專利名稱：新型葡萄糖脫氫酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可能利用于葡萄糖測定試劑和葡萄糖傳感器的新型葡萄糖脫氫酶(葡萄糖脫氫酶在下文中寫作GDH)。
背景技術(shù)：
自己測定血糖對于糖尿病患者日常掌控自身血糖值和決定治療與否很有作用。用于檢測自己血糖的傳感器利用以葡萄糖為底物的酶。這類酶可以葡萄糖氧化酶(EC1.1.3.4)為例。葡萄糖氧化酶對葡萄糖的特異性高，熱穩(wěn)定性好，因為有這些優(yōu)點所以一直用作血糖傳感器用酶，最初提出這點可以追溯到大約40年前。采用葡萄糖氧化酶的血糖傳感器，其原理是氧化葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)镈-葡糖酸-δ-內(nèi)酯，在轉(zhuǎn)換過程中產(chǎn)生的電子通過媒介轉(zhuǎn)移到電極上來測定，然而問題是葡萄糖氧化酶反應(yīng)產(chǎn)生的質(zhì)子容易轉(zhuǎn)移給氧，因此溶解氧會影響測定值。
為解決這個問題，便采用依賴NAD(P)的葡萄糖脫氫酶(EC1.1.1.47)或依賴PQQ的葡萄糖脫氫酶(EC1.1.99.17)作為血糖傳感器用酶。這些酶有不受溶解氧干擾的優(yōu)點，但前者依賴NAD(P)的葡萄糖脫氫酶欠穩(wěn)定，且要補(bǔ)加輔酶，比較煩雜；后者依賴PQQ的葡萄糖脫氫酶缺點是底物特異性較差，除對葡萄糖作用外，還對麥芽糖或乳糖起作用，因而影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。
WO 2004/058958中公開了來自曲霉屬(ァスペルギルス屬)的與黃素結(jié)合的葡萄糖脫氫酶。該酶有底物特異性好，不受溶解氧干擾的優(yōu)點。熱穩(wěn)定性方面，50℃處理15分鐘活性殘留率達(dá)約89％，穩(wěn)定性(以下也用耐熱性表述)良好。但是在制作傳感器探頭時需要加熱處理，不能說會十分穩(wěn)定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服上述已知血糖傳感器用酶存在的缺點，提供應(yīng)用面更廣的有效血糖傳感器用酶。
本發(fā)明者為達(dá)到上述目的進(jìn)行了多方面的探討，結(jié)果從青霉屬(Penicillium)絲狀菌中得到葡萄糖脫氫酶，發(fā)現(xiàn)該葡萄糖脫氫酶具有優(yōu)于已知血糖測定用酶的特性，完成了本申請。
本發(fā)明由以下諸部分組成。
一種來自真核生物的葡萄糖脫氫酶，其特征在于，液體狀態(tài)下55℃加熱處理15分鐘后與加熱處理前相比，保持90％或更高的活性。
一種來自真核生物的葡萄糖脫氫酶，其特征在于，液體狀態(tài)下60℃加熱處理15分鐘后仍保持活性。
一種來自真核生物的葡萄糖脫氫酶，其特征在于，液體狀態(tài)下60℃加熱處理15分鐘后與加熱處理前相比，保持40％或更高的活性。
第1～3各項所述葡萄糖脫氫酶，其中真核生物為絲狀菌。
第4項所述葡萄糖脫氫酶，其中絲狀菌為青霉屬(Penicillium)絲狀菌。
第5項所述葡萄糖脫氫酶，青霉屬絲狀真菌為薄刺青霉(Penicillium lilacinoechinulatum)或意大利青霉(Penicillium italicum)。
第1～6各項所述葡萄糖脫氫酶，其特征在于，對麥芽糖的活性不及對葡萄糖活性的1％。
第7項所述葡萄糖脫氫酶，其特征在于，對半乳糖的活性不及對葡萄糖活性的2％。
來自真核生物的顯示以下(a)～(f)各項物理化學(xué)特性的葡萄糖脫氫酶
(a)通過凝膠過濾得到的表觀分子量約為270kDa(b)最適反應(yīng)溫度50℃(c)最適反應(yīng)pH約6.5(d)溫度穩(wěn)定性55℃加熱處理15分鐘后葡萄糖脫氫酶(GDH)活性殘留率為至少90％；60℃加熱處理15分鐘后GDH活性殘留率為至少40％。
(e)pH穩(wěn)定性5.0～8.0(25℃處理16小時后活性殘留率為至少90％)。
來自真核生物的顯示以下(a)～(f)各項物理化學(xué)特性的葡萄糖脫氫酶(a)通過凝膠過濾得到的表觀分子量為79～93kDa(b)最適反應(yīng)溫度60℃(c)最適反應(yīng)pH約6.5(d)溫度穩(wěn)定性55℃加熱處理15分鐘后GDH活性殘留率為至少95％；60℃加熱處理15分鐘后GDH活性殘留率為至少70％。
(e)pH穩(wěn)定性5.0～8.5(25℃處理16小時后活性殘留率為至少80％)。
葡萄糖脫氫酶的制造方法，包括培養(yǎng)真核微生物，并提取和純化第1～10項所述的葡萄糖脫氫酶。
葡萄糖濃度的測定方法，其中采用第1～10項中任一項所述的葡萄糖脫氫酶。
葡萄糖檢測試劑盒，含有第1～10項中任一項所述的葡萄糖脫氫酶。
葡萄糖傳感器，含有第1～10項中任一項所述的葡萄糖脫氫酶。
本發(fā)明可以提供耐熱性和底物特異性好，并且不受溶解氧干擾的葡萄糖脫氫酶。


圖1表不本發(fā)明的GDH反應(yīng)速度與溫度的關(guān)系。以活性最高時的溫度條件為100的相對活性(％)表示。
圖2表示本發(fā)明的GDH反應(yīng)速度與pH的關(guān)系。以活性最高時的pH條件為100時的相對活性(％)表示。
圖3表示本發(fā)明的GDH溫度穩(wěn)定性。以加熱處理前的活性為100時的相對活性(％)表示各溫度加熱處理后的活性值。
圖4表示來自保藏編號NBRC6092的菌株的GDH的pH穩(wěn)定性。pH4～5用乙酸緩沖液，pH5～7用磷酸鉀緩沖液，pH3.3～6用乙酸緩沖液，pH6～7用PIPES緩沖液，pH7～8.5用Tris-鹽酸緩沖液。
圖5表示來自保藏編號NBRC32032的菌株的GDH的pH穩(wěn)定性。pH4～5用乙酸緩沖液，pH5～7用磷酸鉀緩沖液，pH3.3～6用乙酸緩沖液，pH6～7用PIPES緩沖液，pH7～8.5用Tris-鹽酸緩沖液。
圖6表示用本發(fā)明的GDH制作的葡萄糖電極的葡萄糖濃度與響應(yīng)電壓值的關(guān)系。檢測器輸出的響應(yīng)電壓1V相當(dāng)于葡萄糖電極中10μA電流。
具體實施形式本發(fā)明是來自真核生物的葡萄糖脫氫酶，催化以下反應(yīng)。
D-葡萄糖+電子傳遞體(氧化態(tài))→D-萄糖酸-1，5-內(nèi)酯+電子傳遞體(還原態(tài))1.本發(fā)明以高耐熱性為特征，區(qū)別于公知的來自真核生物的GDH。公知的來自真核生物的葡萄糖脫氫酶中，穩(wěn)定性好的由土曲霉(Aspergillus terreus)而來的GDH在55℃加熱處理15分鐘后活性殘留率(以加熱處理前的活性為100的相對活性)為60％或更低，而本發(fā)明的GDH在55℃加熱處理15分鐘后活性殘存率為至少90％。同時本發(fā)明的GDH在60℃處理15分鐘后仍可保持GDH活性，更優(yōu)選在60℃處理15分鐘后活性殘留率為至少40％。
為判斷是否具有上述耐熱性，作為本發(fā)明所述的加熱處理條件，為在濃度20mM磷酸鉀緩沖液(pH6.5)中溶解GDH使其活性為1U/ml的狀態(tài)下加熱15分鐘。另外，是根據(jù)后述試驗例中所述方法測定的值。
本發(fā)明GDH的來源生物只要是真核生物即可。真核生物的范疇包括所有在細(xì)胞中含有被核膜包覆的細(xì)胞核的生物，但其中優(yōu)選絲狀菌。其中優(yōu)選的絲狀菌可以列舉屬于青霉屬或曲霉屬的種類，其中更優(yōu)選屬于青霉屬的絲狀菌。另外，本發(fā)明的GDH來源菌株進(jìn)一步優(yōu)選青霉屬中的薄刺青霉(Penicillium lilacinoechinulatum)或意大利青霉(Penicillium italicum)。這些菌株可以從各菌株保藏機(jī)構(gòu)通過分開出售(分譲)容易地獲得。薄刺青霉和意大利青霉已經(jīng)在產(chǎn)品評價技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)生物資源管理部門(製品評価技術(shù)基盤機(jī)構(gòu)·生物資源部門)注冊，菌種保藏編號分別為NBRC6231和NBRC32032。
本發(fā)明以高底物特異性為特征，對麥芽糖的活性不及對葡萄糖活性的1％，對半乳糖的活性不及對葡萄糖活性的2％。此處所述之活性，指底物濃度為4mM時的GDH活性，其測定方法根據(jù)后述試驗例中所述，將所使用的反應(yīng)液中的葡萄糖濃度調(diào)整到4mM。
從另外角度來說，本發(fā)明是來自真核生物的、具有以下特性的葡萄糖脫氫酶(a)通過凝膠過濾得到的表觀分子量約為270kDa(b)最適反應(yīng)溫度50℃(c)最適反應(yīng)pH約6.5(d)溫度穩(wěn)定性55℃加熱處理15分鐘后GDH活性殘留率為至少90％；60℃加熱處理15分鐘后GDH活性殘留率為至少40％。
(e)pH穩(wěn)定性5.0～8.0(25℃處理16小時后活性殘留率為至少90％)。
作為酶來源的真核生物，只要是能產(chǎn)生具有以上特性的GDH的生物即可，并無特別限定，但優(yōu)選絲狀菌，更優(yōu)選青霉屬的絲狀菌，進(jìn)一步優(yōu)選薄刺青霉。進(jìn)一步優(yōu)選已經(jīng)在產(chǎn)品評價技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)生物資源管理部門注冊，菌種保藏編號為NBRC6231的菌株。
同時，本發(fā)明是來自真核生物的具有以下特性的葡萄糖脫氫酶(a)通過凝膠過濾得到的表觀分子量約為79～93kDa(b)最適反應(yīng)溫度60℃(c)最適反應(yīng)pH約6.5(d)溫度穩(wěn)定性55℃加熱處理15分鐘后GDH活性殘留率為至少95％；60℃加熱處理15分鐘后GDH活性殘留率為至少70％。
(e)pH穩(wěn)定性5.0～8.5(25℃處理16小時后活性殘留率為至少80％)。
作為酶來源的真核生物，只要是能產(chǎn)生具有以上特性的GDH的生物即可，并無特別限定，但優(yōu)選絲狀菌，更優(yōu)選青霉屬的絲狀菌，進(jìn)一步優(yōu)選意大利青霉。進(jìn)一步優(yōu)選已經(jīng)在產(chǎn)品評價技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)生物資源管理部門注冊，菌種保藏編號為NBRC32032的菌株。
為判斷是否具有上述pH穩(wěn)定性，作為本發(fā)明所述的加熱條件，以在濃度20mM的乙酸緩沖液(pH4.5～6.0)、PIPES緩沖液(pH6.0～7.5)和Tris-鹽酸緩沖液(pH7.0～8.5)中分別溶解GDH使其活性為1U/ml的狀態(tài)下加熱15分鐘。另外，其為根據(jù)后述試驗例中所述方法測定的值。
上述凝膠過濾的處理條件如下。在使用的柱為東森(東ソ一)公司制TSK-GEL G3000SW(7.5mm×300mm)，使用的緩沖液為50mM Tris-鹽酸緩沖液、150mM NaCl(pH7.5)，加入樣品量為25μL，流速0.5ml/分的條件下進(jìn)行分部分離。根據(jù)事先用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從資料的峰出現(xiàn)位置計算分子量。作為吸收峰出現(xiàn)位置的確定方法，可以通過紫外吸光測定進(jìn)行監(jiān)測，或者也可以通過分別收集流過柱的液體，確定出現(xiàn)GDH活性峰級分來進(jìn)行。
本發(fā)明還提供GDH的制造方法，包括培養(yǎng)真核生物，并提取和純化具有上述特性的GDH。真核生物可以列舉絲狀菌、酵母菌、真核藻類等，只要是這個范圍內(nèi)，能產(chǎn)生具有上述特性的GDH的生物均可，并無特別限定。優(yōu)選絲狀菌，更優(yōu)選屬于青霉屬的絲狀菌，進(jìn)一步優(yōu)選薄刺青霉或意大利青霉。相當(dāng)于這些屬種的菌株都可以用于本發(fā)明。進(jìn)一步優(yōu)選采用薄刺青霉NBRC6231或意大利青霉NBRC32032。
培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基，只要能使微生物生長且產(chǎn)生本發(fā)明所述GDH即可，并無特別限定，更優(yōu)選含有最適合微生物生長所必需的碳源、無機(jī)氮源和/或有機(jī)氮源的培養(yǎng)基。進(jìn)一步優(yōu)選適合通氣攪拌的液體培養(yǎng)基。在液體培養(yǎng)基的情況下，碳源可以例示葡萄糖、葡聚糖(dextran)、可溶性淀粉、蔗糖等；氮源可以例示銨鹽類、硝酸鹽類、氨基酸、玉米漿、蛋白胨、酪素、肉膏、脫脂大豆、馬鈴薯提取液等。如有需要，可含有其它營養(yǎng)素(例如氯化鈣、磷酸二氫鈉、氯化鎂等的無機(jī)鹽、維生素類等)。
培養(yǎng)方法采用本領(lǐng)域已知的方法。例如在含有上述營養(yǎng)素的液體培養(yǎng)基中接種微生物孢子或生長狀態(tài)良好的菌體，通過靜置或通氣攪拌而繁殖菌體，優(yōu)選用通氣攪拌方法培養(yǎng)。培養(yǎng)液的pH優(yōu)選5～9，更優(yōu)選6～8。溫度通常為14～42℃，更優(yōu)選20～40℃。通常連續(xù)培養(yǎng)14～144小時，優(yōu)選在各種培養(yǎng)條件下GDH表達(dá)量達(dá)到最大時結(jié)束培養(yǎng)。確定結(jié)束培養(yǎng)時間的手段是從培養(yǎng)液中取樣測定培養(yǎng)液中GDH活性來監(jiān)控其變化，把GDH活性不再隨時間增加的時刻視為峰，即可停止培養(yǎng)。
作為從上述培養(yǎng)液中抽提GDH的方法，當(dāng)要從菌體內(nèi)回收積聚的GDH時，可通過離心分離或過濾等操作收集菌體，將此菌體再懸浮在溶劑、優(yōu)選水或緩沖液中。再用通用方法破碎再懸浮的菌體，由此將菌體中的GDH抽提到溶劑中。作為破碎方法，可以用溶菌酶法或物理破碎方法。作為溶菌酶，只要是能消化真菌細(xì)胞壁的酶即可，并無特別限定，作為可應(yīng)用的酶的例子可以舉出SIGMA公司的Lyticase等。物理破碎方法有例如超聲波破碎、玻璃珠破碎、弗氏細(xì)胞壓碎器(frenchpress)等。破碎處理后的溶劑經(jīng)離心分離或過濾除去殘渣，即可得到GDH的粗抽提液。
本發(fā)明還可以采用固體培養(yǎng)方法。優(yōu)選在適當(dāng)控制溫度和濕度條件下在麥麩上培養(yǎng)能產(chǎn)生本發(fā)明之GDH的真核微生物。此時，培養(yǎng)可以通過靜置進(jìn)行，或者通過攪拌培養(yǎng)物等進(jìn)行混合也可以。GDH的提取是在培養(yǎng)物中加入溶劑、優(yōu)選水或緩沖液溶解GDH，再通過離心分離或過濾除去麥麩等固形物。
GDH的純化可以根據(jù)存在GDH活性的級分通過適當(dāng)組合通常使用的各種分離技術(shù)來進(jìn)行。從上述GDH抽提液中，適當(dāng)選擇公知的分離方法，例如鹽析、溶劑沉淀、透析、超濾、凝膠過濾、非變性PAGE、SDS-PAGE、離子交換色譜、羥基磷灰石色譜、親和色譜、反向高效液相色譜、等電聚焦電泳等來進(jìn)行。另外，抽提的GDH或純化的GDH溶液中還可以加入各種穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑有例如以甘露醇、海藻糖、蔗糖、山梨醇、赤蘚醇、甘油等為代表的糖類、糖醇類，以谷氨酸、精氨酸為代表的氨基酸類，以牛血清白蛋白、卵清白蛋白和各種伴侶蛋白等為代表的蛋白質(zhì)和肽類等各種物質(zhì)。
本發(fā)明的GDH能以液體狀態(tài)提供，也可以通過冷凍干燥、真空干燥、噴霧干燥等手段制成粉末狀。此時，可采用把GDH溶解在緩沖液等溶劑中使用，還可以添加賦形劑或穩(wěn)定劑糖類、糖醇類、氨基酸類、蛋白質(zhì)類和肽類等。粉末化后也可以造粒。
上述GDH的抽提、純化和粉末化所用的緩沖液的組成并無特別限定，優(yōu)選在pH5～8范圍內(nèi)有緩沖能力的溶液即可。例如硼酸、Tris-鹽酸、磷酸鉀等緩沖劑，或BES、Bicine、Bis-Tris、CHES、EPPS、HEPES、HEPPSO、MES、MOPS、MOPSO、PIPES、POPSO、TAPS、TAPSO、TES、Tricine等Good’s緩沖劑。
本發(fā)明中可以用以下各種方法測定葡萄糖。
葡萄糖檢測試劑盒本發(fā)明的特征還在于使用根據(jù)本發(fā)明的GDH的葡萄糖檢測試劑盒。本發(fā)明的葡萄糖檢測試劑盒含有足夠至少一次檢測所需量的根據(jù)本發(fā)明的GDH。具體而言，試劑盒包括有本發(fā)明的GDH、檢測必需的緩沖液、介體、制備校準(zhǔn)曲線所需之葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液以及使用指南。根據(jù)本發(fā)明的GDH可以各種形態(tài)提供，例如冷凍干燥的試劑、或在適當(dāng)保存溶液中制成的溶液狀態(tài)。
葡萄糖傳感器本發(fā)明的特征還在于含有根據(jù)本發(fā)明的GDH的葡萄糖傳感器。電極可以使用碳電極、金電極或鉑電極等，在該電極上固定化本發(fā)明的酶。固定化方法有采用交聯(lián)試劑的方法、包埋在高分子基質(zhì)中的方法、用透析膜覆蓋的方法、使用光交聯(lián)性聚合物、導(dǎo)電性聚合物和氧化還原聚合物等的方法，或者可以和以二茂鐵或其衍生物為代表的電子介體一起固定在聚合物中或吸附固定在電極上，也可以將這些方法組合應(yīng)用。典型例子是用戊二醛將本發(fā)明的GDH固定在碳電極上，然后用帶有氨基的試劑處理以封閉戊二醛。
葡萄糖濃度的測定按以下所述進(jìn)行。在恒溫的小杯(cell)中加入緩沖液，加入介體，并維持在恒定溫度。工作電極采用固定了本發(fā)明的GDH的電極，采用反電極(如鉑電極)和參比電極(例如Ag/AgCl電極)。在碳電極上施加恒定電壓，待電流穩(wěn)定后，加入含葡萄糖的樣品，測定電流的增加。根據(jù)以標(biāo)準(zhǔn)濃度的葡萄糖溶液制作的校準(zhǔn)曲線，可以計算出樣品中的葡萄糖濃度。
本發(fā)明的葡萄糖測定用組合物、葡萄糖檢測試劑盒、葡萄糖傳感器或葡萄糖測定方法中使用的介體并無特別限定，優(yōu)選用2，6-二氯苯酚-靛酚(2，6-dichlorophenol-indophenol，簡稱DCPIP)、二茂鐵或它們的衍生物(例如鐵氰化鉀、N-甲基吩嗪甲基硫酸鹽等)，這些介體可以從市場上買到。
試驗例本發(fā)明中按以下條件進(jìn)行葡萄糖脫氫酶的活性測定。
試劑50mM PIPES緩沖液，pH6.5，(含0.1％Triton X-100)14mM 2，6-二氯苯酚-靛酚(DCPIP)溶液1M D-葡萄糖溶液混合上述PIPES緩沖液15.8ml、DCPIP 0.2ml和D-葡萄糖溶液4ml，得到反應(yīng)試劑。
將2.9ml反應(yīng)試劑在37℃預(yù)熱5分鐘。加入0.1ml GDH溶液，緩慢混合后，以水為對照，用控制溫度為37℃的分光光度計記錄5分鐘在600nm波長下的吸光度變化，由直線部分測定每1分鐘的吸光度變化(ΔOD試驗)。作為盲檢，用溶解GDH的溶劑代替GDH溶液加入試劑混合液中，同樣測定每1分鐘的吸光度變化(ΔOD空白)。由這些值根據(jù)下式求得GDH活性。此處1單位GDH活性定義為200mM濃度的D-葡萄糖存在下一分鐘內(nèi)還原1微摩爾DCPIP的酶量。
式1 式中3.0為反應(yīng)試劑+酶溶液的液量(ml)，16.3為本活性測定條件下毫摩爾分子吸光系數(shù)(cm2/微摩爾)，0.1為酶溶液的液量(ml)，1.0為池的光徑長(cm)。
實施例以下用實施例具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。
實施例1青霉屬絲狀菌由來的GDH的取得GDH生產(chǎn)菌采用薄刺青霉(Penicillium lilacinoechinulatum)NBRC6231菌株或意大利青霉(Penicillium italicum)NBRC32032菌株(由獨立行政法人制品評價技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)購買)。將各自的冷凍干燥樣品分別接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Difco)，通過在25℃溫育而活化。在活化的板上的菌絲連同瓊脂一起回收，懸浮在經(jīng)過濾處理的無菌水中。在2個10L容積發(fā)酵缸(jar fermenter)中配制6L生產(chǎn)培養(yǎng)基(1％麥芽提取物、1.5％大豆蛋白胨、0.1％MgSO4·7H2O、2％葡萄糖，pH6.5)，120℃高壓滅菌15分鐘后，分別加入上述菌絲懸浮液，開始培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為30℃、通氣量2L/分鐘、攪拌速度380rpm。培養(yǎng)64小時后停止，使用Nutsch過濾器進(jìn)行吸濾，在濾紙上收集各自菌株的菌體。將菌體再懸浮在3L 20mM的磷酸鉀緩沖液(pH6.5)中，以130MPa的壓力進(jìn)行法蘭西壓，將菌體破碎。將破碎液移液到500ml的離心管中，以日立高速冷卻離心機(jī)8000rpm離心15分鐘沉淀殘渣。上清液用截留分子量10000的超濾用中空纖維式濃縮到1/10量，在濃縮液中加入硫酸銨使其終濃度為60％飽和(456g/L)，并溶解。隨后用日立高速冷卻離心機(jī)8000rpm離心15分鐘沉淀殘渣，然后將上清液吸附在Octyl-Sepharose柱上，以0.6～0.0飽和度的硫酸銨溶液進(jìn)行梯度洗脫，回收有GDH活性的級分。得到的GDH溶液用G-25Sepharose柱進(jìn)行凝膠過濾，回收含蛋白質(zhì)的級分，由此進(jìn)行脫鹽，向脫鹽溶液中加入相當(dāng)于0.6飽和度的硫酸銨并溶解。將其吸附在Phenyl-Sepharose柱上，以0.6～0.0飽和度的硫酸銨溶液梯度洗脫，回收有GDH活性的級分。將其在50℃加熱45分鐘，離心分離得到上清液。經(jīng)以上過程得到的溶液作為GDH純化樣品。
實施例2分子量的估測由實施例1從NBRC6231菌株和NBRC32032菌株得到的純化GDH樣品25μl加到經(jīng)50mM Tris-HCl(pH7.5)緩沖的東森(公司)制TSK-GEL G3000SW(7.5mm×300mm)柱上，以0.5ml/分鐘流速分部分離。NBRC6231洗脫時，監(jiān)控280nm波長吸光度，根據(jù)出現(xiàn)吸收峰的位置來確定洗脫時間；NBRC32032的洗脫液，用分部收集器收集洗脫液，根據(jù)試驗例1的方法測定各級分的GDH活性，確定出現(xiàn)吸收峰的級分并由此得出洗脫時間。根據(jù)所確定的洗脫時間，由預(yù)先使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(Oriental酵母株式會社制MW-Marker，MW12400～290000)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得GDH蛋白質(zhì)的分子量。結(jié)果估測由NBRC6231得到的GDH的分子量約為270kDa，由NBRC32032得到的GDH的分子量約為79～93kDa。
實施例3最適反應(yīng)溫度為了解由實施例1得到的NBRC6231和NBRC32032純化液的最適反應(yīng)溫度，將上述試驗例的測定步驟中預(yù)熱和反應(yīng)中的反應(yīng)試劑的溫度分別設(shè)定在25、37、40、45、50、55、60、65℃，計算各條件下的活性。表示將表現(xiàn)最高活性的條件下的酶活性值設(shè)為100時的相對活性的曲線見圖1。由此得知，在上述條件下，由NBRC6231得到的GDH的最適反應(yīng)溫度為高于45℃且低于55℃的范圍內(nèi)，約為50℃；由NBRC32032得到的GDH的最適反應(yīng)溫度為高于55℃且低于65℃的范圍內(nèi)，約為60℃。
實施例4最適反應(yīng)pH為了解由實施例1得到的NBRC6231和NBRC32032純化液的最適反應(yīng)pH，用pH在5.5～8.0范圍的50mM磷酸鉀緩沖液代替上述試驗例的測定步驟中的PIPES緩沖液制備反應(yīng)試劑，使用它們按照試驗例的順序測定活性。表示將表現(xiàn)最高活性的條件下的活性值設(shè)為100時的各種pH條件下的相對活性的曲線見圖2。由此得知，在上述條件下，由NBRC6231得到的GDH和由NBRC32032得到的GDH的最適反應(yīng)pH都在大于6.0且小于7.0的范圍內(nèi)，約為6.5。
實施例5溫度穩(wěn)定性為了解由實施例1得到的NBRC6231和NBRC32032純化液的溫度穩(wěn)定性，將各GDH溶液用20mM磷酸鉀緩沖液(pH6.5)稀釋到活性為1U/ml，將此稀釋液放在熱浴中，以37～65℃范圍內(nèi)的各種溫度加熱處理15分鐘，比較處理前后的活性?；钚詼y定方法按上述試驗例所述。表示加熱處理后的活性相對于加熱處理前的活性的活性殘留率的曲線見圖3。說明由NBRC6231得到的GDH 55℃處理后活性殘留率為93％，60℃處理后活性殘留率為44％；由NBRC32032得到的GDH 55℃處理后活性殘留率為98％，60℃處理后活性殘留率為73％。
實施例6pH穩(wěn)定性為了解由實施例1得到的NBRC6231和NBRC32032純化液的pH穩(wěn)定性，配制pH在3.3～8.5范圍內(nèi)的緩沖液(pH3～6乙酸緩沖液，pH6～7PIPES緩沖液，pH7～8.5Tris-HCl緩沖液)，用這些緩沖液稀釋GDH至活性為1U/ml。比較將稀釋液在25℃溫育16小時前后的活性。表示溫育后的活性相對于溫育前的活性的活性殘留率的曲線見圖4(來自NBRC6231)和圖5(來自NBRC32032)。來自NBRC6231的GDH在pH5～8范圍內(nèi)活性殘留率為至少80％，穩(wěn)定性良好；由NBRC32032得到的GDH在pH5～8.5范圍內(nèi)活性殘留率為至少80％，但采用PIPES緩沖液時，在pH7.4時活性殘留率為77％。
實施例7
測定對D-葡萄糖的Km值將試驗例中所述反應(yīng)試劑組成中的D-葡萄糖的濃度在不超過200mM的范圍內(nèi)改變，測定由NBRC6231和NBRC32032得到的GDH的活性。根據(jù)Lineweaver-Burk作圖法算出Km值。結(jié)果表明來自NBRC6231的GDH的Km值為13mM，來自NBRC32032的GDH的Km值為1.8mM。
實施例8在葡萄糖電極中的應(yīng)用在乳缽中加入0.5g碳石墨、0.3ml液體石蠟，用杵捏煉30分鐘，制成碳糊。將碳糊涂布(練りこみ)在白金電極上，再將按實施例1得到的純化GDH溶液(由保藏號NBRC6231得到，500U/ml)10μl添加，室溫風(fēng)干30分鐘。在風(fēng)干的酶電極上覆蓋截留分子量8000的纖維素半透膜，用塑料制O形環(huán)固定半透膜。如此制成的葡萄糖電極，預(yù)先在冰冷卻的50mM的磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中浸漬30分鐘后使用。在保溫于25℃的小池中加入20ml反應(yīng)液，在其中浸入葡萄糖電極(工作電極)、反電極白金電極和參比電極Ag/AgCl，施加+0.35V的電壓。待電流值恒定后加入葡萄糖，監(jiān)測響應(yīng)的電流值。檢測器將1μA電流轉(zhuǎn)換為0.1V輸出，將輸出的電壓值隨時間推移的變化作成曲線圖。以從本底值到加入葡萄糖后達(dá)到的穩(wěn)定值的電壓的電壓增長度作為響應(yīng)值(V)。加入的葡萄糖濃度以終濃度在5～40mM范圍內(nèi)變動，以各葡萄糖濃度時得到的響應(yīng)值作圖，見圖6。由此結(jié)果可見隨著葡萄糖濃度增加響應(yīng)值上升，確認(rèn)了本發(fā)明的GDH可以適用于葡萄糖定量，可以用作葡萄糖傳感器。
工業(yè)實用性根據(jù)本發(fā)明，可以獲得葡萄糖測定用組合物或葡萄糖的測定方法。這種葡萄糖測定用組合物或葡萄糖的測定方法可以用于葡萄糖檢測試劑盒和用作葡萄糖傳感器。
權(quán)利要求
1.一種來自真核生物的葡萄糖脫氫酶，其特征在于，液體狀態(tài)下55℃加熱處理15分鐘后與加熱處理前相比，保持至少90％的活性。
2.一種來自真核生物的葡萄糖脫氫酶，其特征在于，液體狀態(tài)下60℃加熱處理15分鐘后仍保持活性。
3.權(quán)利要求2所述的來自真核生物的葡萄糖脫氫酶，其特征在于，液體狀態(tài)下60℃加熱處理15分鐘后與加熱處理前相比，保持至少40％的活性。
4.權(quán)利要求1～3任一項所述的葡萄糖脫氫酶，其中真核生物為絲狀菌。
5.權(quán)利要求4所述的葡萄糖脫氫酶， 其中絲狀菌為青霉屬(Penicillium)絲狀菌。
6.權(quán)利要求5所述的葡萄糖脫氫酶，其中青霉屬絲狀菌為薄刺青霉(Penicillium lilacinoechinulatum)或意大利青霉(Penicillium italicum)。
7.權(quán)利要求1～6任一項所述的葡萄糖脫氫酶，其特征在于，對麥芽糖的活性不及對葡萄糖活性的1％。
8.權(quán)利要求7所述的葡萄糖脫氫酶，其特征還在于，對半乳糖的活性不及對葡萄糖活性的2％。
9.來自真核生物的顯示以下(a)～(f)各項物理化學(xué)特性的葡萄糖脫氫酶(a)通過凝膠過濾得到的表觀分子量約為270kDa(b)最適反應(yīng)溫度50℃(c)最適反應(yīng)pH約6.5(d)溫度穩(wěn)定性55℃加熱處理15分鐘后GDH活性殘留率為至少90％，60℃加熱處理15分鐘后GDH活性殘留率為至少40％(e)pH穩(wěn)定性5.0～8.0(25℃處理16小時后活性殘留率為至少90％)。
10.來自真核生物的顯示以下(a)～(f)各項物理化學(xué)特性的葡萄糖脫氫酶(a)通過凝膠過濾得到的表觀分子量為79～93kDa(b)最適反應(yīng)溫度60℃(c)最適反應(yīng)pH約6.5(d)溫度穩(wěn)定性55℃加熱處理15分鐘后GDH活性殘留率為至少95％，60℃加熱處理15分鐘后GDH活性殘留率為至少70％(e)pH穩(wěn)定性5.0～8.5(25℃處理16小時后活性殘留率為至少80％)。
11.葡萄糖脫氫酶的制造方法，包括培養(yǎng)真核微生物，并抽提和純化權(quán)利要求1～10所述的葡萄糖脫氫酶。
12.葡萄糖濃度的測定方法，其中采用權(quán)利要求1～10任一項所述的葡萄糖脫氫酶。
13.葡萄糖檢測試劑盒，含有權(quán)利要求1～10任一項所述的葡萄糖脫氫酶。
14.葡萄糖傳感器，含有權(quán)利要求1～10任一項所述的葡萄糖脫氫酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種來自真核生物的葡萄糖脫氫酶，其特征在于，液體狀態(tài)下55℃加熱處理15分鐘后與加熱處理前相比，保持至少90％的活性。
文檔編號C12N9/04GK1962859SQ20061006782
公開日2007年5月16日 申請日期2006年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月7日
發(fā)明者相場洋志 申請人:東洋紡織株式會社