專利名稱：一種微生物活菌組合及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物活菌組合制劑及其制備方法，屬于微生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自上世紀(jì)中葉發(fā)現(xiàn)飼料中添加抗生素具有明顯抑菌、促生長效果以來，抗生素等藥物性飼料添加劑對預(yù)防動物疾病、提高動物生產(chǎn)性能和經(jīng)濟(jì)效益方面發(fā)揮了巨大作用，推動了畜禽養(yǎng)殖業(yè)尤其是集約化養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。但是后來人們發(fā)現(xiàn)，在飼料中長期使用和濫用抗生素，產(chǎn)生了另人擔(dān)憂的問題；病原菌抗性顯著增強(qiáng)，動物自身免疫力下降，藥物殘留引起人類健康危害，排泄物引起環(huán)境污染等，嚴(yán)重影響了人類的公共衛(wèi)生和安全。各國紛紛采取措施對飼用抗生素的種類、劑量和使用方法等方面嚴(yán)加限制，歐盟已決定2006年開始全面禁止在飼料中使用抗生素。
微生態(tài)制劑是指將已知的有益微生物通過現(xiàn)代生物工程技術(shù)制備成應(yīng)用于動物的生物制劑，它能有效補(bǔ)充畜禽體內(nèi)的有益微生物，改善動物體內(nèi)菌群平衡，提高機(jī)體抗病力和飼料吸收利用能力。由于微生態(tài)制劑無殘留、不產(chǎn)生抗性，且具有預(yù)防疾病和促進(jìn)動物生長的作用，可有效克服長期使用抗生素造成的一些不良影響，被認(rèn)為是飼用抗生素潛在的、天然的、對環(huán)境和健康無害的替代物。微生態(tài)制劑按微生物種類可分為芽孢桿菌制劑、乳酸桿菌制劑、酵母制劑及復(fù)合制劑等，它們在畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖方面的應(yīng)用發(fā)展很快，1989年全球飼用微生態(tài)制劑總銷售額為7500萬美元，1993年為1.22億美元，2000年為1.86億美元，2006年估計(jì)可達(dá)3.5億美元。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是要提供一種新型微生物活菌組合制劑。
為實(shí)現(xiàn)上述目的采取的技術(shù)方案采用復(fù)合微生態(tài)制劑，其活菌成份是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)，采用液體深層發(fā)酵混菌培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)。
該制劑能顯著提高機(jī)體抗病力和飼料吸收利用能力，且生產(chǎn)成本低廉。
本發(fā)明的具體內(nèi)容如下1.活性菌株鑒定(1)枯草芽孢桿菌ZHBal 78菌體桿狀，很少成鏈，通常為0.7-0.8×2.0-3.0微米，革蘭氏陽性，細(xì)胞原生質(zhì)染色均勻，運(yùn)動、周生鞭毛。芽孢橢圓形或柱狀，0.9×0.6微米，中生或偏中生，菌落呈細(xì)皺狀、干燥或顆粒狀。生長溫度15-55℃，接觸酶和V-P反應(yīng)陽性，溶菌酶陽性，V-P培養(yǎng)液中的pH 5.8，在7％氯化鈉中生長，pH 5.7生長。利用葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇產(chǎn)酸，水解淀粉，液化明膠，能利用檸檬酸鹽，還原硝酸鹽成亞硝酸鹽，分解酪素，不分解酪氨酸，石蕊牛奶產(chǎn)堿胨化。需氧菌，厭氧生長和卵黃反應(yīng)陰性，在葡萄糖瓊脂和酪氨酸瓊脂上不形成可溶性黑色素，不水解馬尿酸鹽，不利用丙酸鹽。
(2)粘紅酵母ZHRh028細(xì)胞卵形到球形，2.3-5.0×4.0-7.8微米，單個或幾個細(xì)胞連結(jié)成串，多端出芽。在麥芽汁瓊脂斜面上菌苔呈現(xiàn)珊瑚紅到橙紅色，菌落表面光滑、有光澤、粘稠有時發(fā)硬，其橫切面扁平到有較寬的凸起，邊緣不規(guī)則到整齊，不形成菌絲，無假菌絲。不發(fā)酵任何糖，同化硝酸鉀，分解楊梅苷，不產(chǎn)生類淀粉?？赏咸烟?、麥芽糖、半乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維二糖、L-山梨糖、乙醇、D-果糖、松三糖、甘油等，不能同化乳糖、蜜二糖、D-甘露糖、鼠李糖、D-木糖、菊糖、棉子糖、肌醇、可溶性淀粉、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-山梨醇和赤癬醇。無有性生殖現(xiàn)象，生長溫度25-36℃，pH 2.5-10.0范圍均能生長。
2.制備工藝(1)生產(chǎn)菌種本發(fā)明所用的微生物菌種為枯草芽孢桿菌ZHBa178(Bacillus subtilis ZHBa178)，保藏于CGMCC，保藏號CGMCC NO.1744，保藏日期為2006年06月27日；粘紅酵母ZHRh028(Rhodotorula glutinis ZHRh028)，保藏于CGMCC，保藏號CGMCC NO.1745，保藏日期為2006年06月27日。
(2)培養(yǎng)基①種子斜面培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌牛肉膏0.5％蛋白胨1.0％氯化鈉0.5％葡萄糖0.2％瓊脂2.0％ pH 7.0-7.2粘紅酵母葡萄糖2％ 蛋白胨1.0％酵母膏0.2％瓊脂2.0％ pH 6.0②發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)基中的營養(yǎng)源采用常用的碳源和氮源。其中碳源可為淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、飴糖等；氮源可為蛋白胨、黃豆餅粉、酵母膏、玉米漿、尿素、硫酸銨等。在此基礎(chǔ)上再添加一些其它營養(yǎng)成份，如食鹽、磷酸鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽等。
(3)培養(yǎng)方法本發(fā)明所述的微生物活菌組合制劑，通過液體深層發(fā)酵技術(shù)分步接種混和培養(yǎng)。首先接種枯草芽孢桿菌，培養(yǎng)溫度為34-39℃；培養(yǎng)10-30小時后接種粘紅酵母，培養(yǎng)溫度降至28-33℃，聯(lián)合培養(yǎng)15-100小時后放罐。
(4)產(chǎn)品后處理培養(yǎng)液調(diào)制成一定的含菌量，添加適量防腐劑后分裝，即為水劑產(chǎn)品；或加入適量吸附劑吸附，干燥粉碎后分裝，即為粉劑產(chǎn)品。
具體工藝流程見說明書附圖。
本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)1.多效產(chǎn)品富含枯草芽孢桿菌和粘紅酵母二種有益活性菌，以及由二菌培養(yǎng)時代謝產(chǎn)生的β-胡蘿卜素、維生素、及多種酶等生理活性物質(zhì)，因而具備多重功效。具有改善畜禽體內(nèi)菌群平衡，提高動物免疫力，增加飼料適口性，促進(jìn)動物對飼料的消化吸收，以及凈化水質(zhì)提高水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境質(zhì)量等功能。
2.安全本產(chǎn)品系由有益菌組成的活菌制劑，動物飼用后無任何副作用，無殘留問題，不引起耐藥性，是相對非常安全的活性飼料添加劑。
3.低成本生產(chǎn)采用枯草芽孢桿菌、粘紅酵母分步接種后混和培養(yǎng)工藝，與分別培養(yǎng)后混和工藝相比，可大大降低原材料成本和能源動力消耗，因而成本明顯降低。


附圖為本發(fā)明制備工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明有以下實(shí)施例實(shí)施例一活菌總數(shù)大于50億/ml水劑產(chǎn)品的制備在70L發(fā)酵罐中，按葡萄糖3％、硫酸銨0.4％、酵母膏0.2％、磷酸氫二鉀0.02％、硫酸鎂0.02％配成50L培養(yǎng)基。按常規(guī)方法滅菌后冷卻至37℃，接種1個茄子瓶的枯草芽孢桿菌生產(chǎn)菌種，培養(yǎng)溫度為37℃，轉(zhuǎn)速250轉(zhuǎn)/分；培養(yǎng)18小時后接種1個茄子瓶粘紅酵母生產(chǎn)菌種，培養(yǎng)溫度降至28℃，聯(lián)合培養(yǎng)20小時后放罐。加水稀釋成總活菌數(shù)50億/ml以上的懸液，再加0.1％苯甲酸鈉作防腐劑，分裝即得產(chǎn)品。該產(chǎn)品活菌總數(shù)大于50億/ml，其中枯草芽孢桿菌大于35億/ml，粘紅酵母大于15億/ml。
實(shí)施例二總活菌數(shù)大于100億/克粉劑產(chǎn)品的制備在70L發(fā)酵罐中，按蔗糖4.0％、玉米漿0.5％、尿素0.3％、磷酸氫二鉀0.02％、硫酸鎂0.02％、氯化鈉0.2％配成45L培養(yǎng)基。按常規(guī)方法滅菌后冷卻至35℃，接種1個茄子瓶的枯草芽孢桿菌生產(chǎn)菌種，培養(yǎng)溫度為36℃，轉(zhuǎn)速220轉(zhuǎn)/分；培養(yǎng)24小時后接種2個茄子瓶粘紅酵母生產(chǎn)菌種，培養(yǎng)溫度降至30℃，聯(lián)合培養(yǎng)76小時后放罐。加適量玉米芯粉吸附并調(diào)制到總活菌數(shù)100億/克以上，沸騰干燥后分裝即為產(chǎn)品。該產(chǎn)品總活菌數(shù)大于100億/克，其中枯草芽孢桿菌大于60億/克，粘紅酵母大于40億/克。
權(quán)利要求
1.一種微生物活菌組合制劑，其特征是制劑的活菌成份為枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis和粘紅酵母Rhodotorula glutinis。
2.一種專用于權(quán)利要求1所述微生物活菌組合制劑的生產(chǎn)方法，采用微生物液體深層發(fā)酵混菌培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)，其制備工藝的特征如下(1)生產(chǎn)菌種采用枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ZHBa178和粘紅酵母Rhodotorula glutinisZHRh028，菌種保藏于CGMCC，保藏號分別為CGMCC NO.1744和CGMCC NO.1745；(2)發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)基中的營養(yǎng)源采用碳源和氮源，其中碳源為淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖或飴糖；氮源為蛋白胨、黃豆餅粉、酵母膏、玉米漿、尿素或硫酸銨，并添加食鹽、磷酸鹽、鉀鹽、鈣鹽或鎂鹽；(3)培養(yǎng)方法通過液體深層發(fā)酵技術(shù)分步接種混和培養(yǎng)，首先接種枯草芽孢桿菌，培養(yǎng)溫度為34-39℃，培養(yǎng)10-30小時后接種粘紅酵母，培養(yǎng)溫度降至28-33℃，聯(lián)合培養(yǎng)15-100小時后放罐；(4)產(chǎn)品后處理培養(yǎng)液調(diào)制后，再添加防腐劑，分裝即為水劑產(chǎn)品；或加入吸附劑吸附，干燥粉碎后分裝即為粉劑產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微生物活菌組合制劑及其制備方法。該制劑的活菌成份是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)；其制備采用微生物液體深層發(fā)酵混菌培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)，先接種枯草芽孢桿菌，后接種粘紅酵母，聯(lián)合培養(yǎng)時間15－100小時。該制劑能顯著提高畜禽機(jī)體抗病力和飼料吸收利用能力，且生產(chǎn)成本較低。
文檔編號C12N1/16GK1908155SQ20061005295
公開日2007年2月7日 申請日期2006年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月15日
發(fā)明者施躍峰, 李孝輝, 竺利紅, 吳吉安, 梁建根, 陳兵, 桑金隆 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院