專利名稱：獲取用于鑒定“三系”雜交稻保持系性狀的分子標記方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種獲取雜交稻的分子標記的技術，特別是一種獲取用于鑒定“三系”雜交稻保持系性狀的分子標記的方法。
背景技術：
普通“三系”雜交稻是有由不育系、保持系和恢復系配套而成。其中，對于不育系的繁殖是利用位于不育系細胞質內的不育基因與位于保持系細胞核內的特異保持基因的互作，使雄性不育性性狀得到保持，所以對保持系要求十分嚴格。但是，在育種實踐中對保持系的改良顯得十分困難和無策，且時間周期長、效率極低。就其原因，表面上好像是由于微效恢復基因(對不育性狀有一定的恢復作用的遺傳因子)的存在和干擾，實質上是由于保持系中保持基因的保持性存在問題。無論怎樣，育種家們急待希望找到一種在改良初期就能有效地鑒定育種材料保持性的方法。
專家學者一致認為DNA分子標記技術是實現作物快速、高效育種的手段。它不受環(huán)境因素變化的影響，結果可靠，其技術的核心是獲得與育種目標性狀緊密連鎖的分子標記。目前，在DNA分子標記方面，對于不育基因的分子標記已做了不少研究，取得了很大進展。然而，對于保持系的高保持性性狀幾乎沒有專門的研究。因此，迫切希望有一種能夠獲取用于鑒定“三系”雜交稻保持系性狀的分子標記的方法。

發(fā)明內容
針對現有技術中存在的不足之處，本發(fā)明提供一種獲取用于鑒定“三系”雜交稻保持系性狀的分子標記方法，其特征是包括以下步驟1)、收集8～10種保持度在99.9％以上的優(yōu)良保持系，收集另一組的8～10種保持度為60～80％的育種中間材料作為參照；2)、分別對上述優(yōu)良保持系和參照進行基因組DNA的提取；3)、采用常規(guī)AFLP分子標記方法進行AFLP分子標記；尋找與所有優(yōu)良保持系具有緊密連鎖性的DNA擴增條帶，稱為DNA特異條帶；4)、克隆上述DNA特異條帶，并進行序列測定；5)、根據上述序列測定結果，設計能擴增該DNA特異條帶的PCR引物。
本發(fā)明的一種獲取用于鑒定“三系”雜交稻保持系性狀的分子標記方法，采用多個優(yōu)良保持系和多個保持度在60-80％的育種中間材料為參照，因此能有效地篩選出與優(yōu)良保持系性狀特異連鎖的分子標記。
本發(fā)明的獲取分子標記的方法，步驟3)具體為嚴格按照PROMAGA化學試劑公司提供的AFLP試劑盒和方法，應用E-2或E-3分別與M-3的64～128對引物組合，進行PCR擴增反應；再用8～10％聚丙烯酰銨凝膠，300～350V電泳2小時后，用0.1～0.2％硝酸銀染色法染色，記錄結果。根據記錄結果，尋找所有優(yōu)良保持系與參照(即育種中間材料)之間存在一致的多態(tài)性的DNA片段，即目標片段。步驟4)具體為采用常規(guī)T載體克隆方法，對特異片段進行克??；再將上述片段克隆、轉化到大腸桿菌中，并完成序列測定。步驟5)具體為利用常用的PCR引物設計程序“DNASIS”，在上述序列的特異性片段范圍內，設計引物長度為19～25bp，GC控制在35～50％之間，退火溫度57～62℃，設計出一對正向和反向引物。
本發(fā)明的獲取用于鑒定“三系”雜交稻保持系性狀的分子標記方法，具有如下優(yōu)點1)、因為采用不同遺傳背景，又有相同目標性狀的多個材料為研究對象，所以研究結果(即所獲得的分子標記)更有較廣泛的代表性。2)、因為選取大面積生產應用的品種為研究對象，所以其研究結果具有更大的實用性。3)、因為利用了另一組8～10個保持率表現為60～80％的育種中間材料為有效參照；因此能將一些具有一定保持能力、但達不到要求的保持基因與優(yōu)良的保持基因區(qū)分開來，滿足生產應用要求。4)、本發(fā)明所獲得的分子標記與保持系的高保持性狀密切連鎖。
具體實施例方式
一種獲取用于鑒定“三系”雜交稻保持系性狀的分子標記的方法，依次進行以下步驟1、研究材料收集生產應用的保持度均在99.9％以上“珍汕97B”、“II-32B”、“優(yōu)一B”、“枝B”、“博B”、“岡46B”、“馬協B”、“協青早B”、“D297B”和“D汕B”這10種“三系”雜交稻作為優(yōu)良保持系。收集另一組的保持度均為60～80％的10個“三系”雜交稻的育種中間材料作為參照，并相應的分別編號為“AB-147”、“AB-117”、“AB-039”、“AB-272”、“AB-232”、“AB-180”、“AB-194”、“SG-101”、“SG-161”、“SG-094”和“SG-520”。
然后按照常規(guī)方法對這10種優(yōu)良保持系和10種參照分別進行浸種、播種、移栽種植，作為材料。
2、DNA樣品制備在移栽后18日，每份材料取幼葉5.0克，放入液態(tài)氮中冰凍、研磨成粉狀，轉入12ml 65℃預熱的提取液中保溫20分鐘(提取液50Mm pH8.0Tris，500Mm NaCl，10Mm EDTA，1％SDS，0.1％β-mercaptal ethanol)，再加入等體積的氯仿(氯仿∶異戊醇＝24∶1)混勻；在常溫下，低速振蕩15分鐘后，以12000轉/分速度離心15分鐘，取上清液，加入2/3體積的異丙醇沉淀DNA；取出絮狀DNA，用70％乙醇清洗二次，讓其自然干燥后，加入500μl pH8.0TE緩沖液溶解、定量，待用。
3、AFLP分子標記嚴格按照PROMAGA化學試劑公司提供的試劑盒和方法，應用E-2或E-3和M-3的64對全部引物組合，進行PCR擴增反應；再用10％聚丙烯酰銨凝膠，300V電泳2小時后，用0.2％硝酸銀染色法染色。結果獲得DNA多態(tài)性條帶732條，其中由E-CCA和M-CTT引物所擴增的多態(tài)性條帶中，分子量約為920bp位置的一條多態(tài)性片段顯示，所有10個優(yōu)良保持系樣品中均表現為陽性(有該片段出現)，而參照的10個樣品呈現陰性(無該片段)，這說明該條帶與優(yōu)良保持系的保持性性狀存在緊密的連鎖關系。
4、連鎖片段克隆采用常規(guī)T載體克隆方法，對特異片段進行克隆。具體方法是，用pT7blue為T載體，將上述片段克隆、轉化到大腸桿菌中。
5、測序與引物設計為了獲得該特異性DNA片段的分子標記，對該片段進行堿基序列測定，該項工作可委托INVITROGEN公司完成；根據INVITROGEN公司提供的測序結果，采用“DNASIS”計算機分析程序設計出一對引物(1)正向引物是5’CTTCACTTATGAGCTCAAGG3’其特征為長度20bp，GC含量45％，退火溫度58.6℃；(2)反向引物是5’CGACTGAAGTCTTCAACTGAC3’其特征為長度21bp，GC含量47％，退火溫度61.0℃；并委托SONGON公司合成設計引物。
為了證明本發(fā)明的優(yōu)點，發(fā)明人對所得的引物特異性進行了如下的檢測PCR擴增用步驟2所得的20份DNA樣品，每份5.0μl(20ng/μl)與15.0μl PCR反應液(2.0μl 10x緩沖液，1.6μl 25mM dNTP，2.0μl 25mM MgCl2，和0.3μl設計的引物(1)，0.3μl設計的引物(2)，0.2μl 5U/μlTaq DNA聚合酶，8.6μl雙蒸水)混合，進行PCR反應第一步94℃預變性保溫3分鐘；第二步94℃保溫45秒，56℃保溫60秒，72℃保溫80秒，并依次循環(huán)36次；第三步72℃延伸保溫5分鐘，結束反應。
凝膠電泳配制1.0％葡聚糖凝膠，將20μl PCR反應后的樣品放入凝膠孔中，6伏特/厘米的電壓進行穩(wěn)壓電泳45分鐘；取出凝膠，放入1.0μg/ml溴化乙錠溶液中，染色10分鐘；放在254nm紫外燈下，對PCR擴增產物經凝膠電泳，優(yōu)良保持系的10個樣品均出現1.5KB明顯的擴增條帶，而參照沒有。
此結果顯示正向5’CTTCACTTATGAGCTCAAGG3’和反向5’CGACTGAAGTCTTCAACTGAC3’的設計引物，對優(yōu)良保持系具有特異性。
實施例2、利用本發(fā)明所得的分子標記，進行鑒定“三系”雜交稻是否為優(yōu)良品種。
1、選擇已知的優(yōu)良保持系“金23B、KB、中9B、064B和地谷B”作為待鑒定的品種。然后按照常規(guī)方法對其進行浸種、播種、移栽種植，作為材料。
2、DNA樣品制備等同于實施例1。
3、引物特異性檢測
PCR擴增等同于實施例1；凝膠電泳等同于實施例1，結果顯示出現1.5KB明顯的擴增條帶。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。
序列表SEQ ID NO1cttcacttat gagctcaagg 20SEQ ID NO2cgactgaagt cttcaactga c2權利要求
1.一種獲取用于鑒定“三系”雜交稻保持系性狀的分子標記方法，其特征是包括以下步驟1)、在“三系”雜交稻中收集8～10種保持度在99.9％以上的作為優(yōu)良保持系，收集另一組的8～10種保持度為60～80％的育種中間材料作為參照；2)、分別對上述優(yōu)良保持系和參照進行基因組DNA的提??；3)、采用常規(guī)AFLP分子標記方法進行AFLP分子標記；尋找與所有優(yōu)良保持系具有緊密連鎖性的DNA擴增條帶，稱為DNA特異條帶；4)、克隆上述DNA特異條帶，并進行序列測定；5)、根據上述序列測定結果，設計能擴增該DNA特異條帶的PCR引物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種獲取用于鑒定“三系”雜交稻保持系性狀的分子標記方法，包括以下步驟1)在“三系”雜交稻中收集8～10種保持度在99.9％以上的作為優(yōu)良保持系，收集另一組的8～10種保持度為60～80％的育種中間材料作為參照；2)分別對上述優(yōu)良保持系和參照進行基因組DNA的提??；3)采用常規(guī)AFLP分子標記方法進行AFLP分子標記；尋找與所有優(yōu)良保持系具有緊密連鎖性的DNA擴增條帶，稱為DNA特異條帶；4)克隆上述DNA特異條帶，并進行序列測定；5)根據上述序列測定結果，設計能擴增該DNA特異條帶的PCR引物。采用本發(fā)明方法所獲得的分子標記與保持系的高保持性狀密切連鎖。
文檔編號C12N15/65GK1884583SQ200610051748
公開日2006年12月27日 申請日期2006年5月31日 優(yōu)先權日2006年5月31日
發(fā)明者劉小川, 陳集雙 申請人:浙江理工大學