專利名稱：微生物培養(yǎng)物在治療與預(yù)防近視和減緩視疲勞中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物培養(yǎng)物的新用途，具體地說是金黃色葡萄球菌金黃色亞種(Staphylococcus aureus subsp.aureus，CGMCC No.0910)的代謝產(chǎn)物在微生物培養(yǎng)物在治療與預(yù)防近視和減緩視疲勞中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在人們的日常工作中，眼睛是接受外界信息最重要的器官。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，生活節(jié)奏的加快，人們平均每日用眼強(qiáng)度顯著增大，過度的用眼，造成了眼部營養(yǎng)平衡失調(diào)，這更易造成眼的疲勞、非感染性炎癥，長(zhǎng)期下去造成眼調(diào)節(jié)功能減退，視力下降。汽車司機(jī)、計(jì)算機(jī)工作者、學(xué)生、文字工作者，由于用眼過度，眼部營養(yǎng)又供應(yīng)不上，更易造成眼部損傷，導(dǎo)致視力下降。
人眼的調(diào)節(jié)作用主要靠睫狀肌來完成，當(dāng)人眼長(zhǎng)時(shí)間處于緊張狀態(tài)時(shí)，睫狀肌始終處于收縮狀態(tài)，長(zhǎng)期下去，造成睫狀肌調(diào)節(jié)失調(diào)，導(dǎo)致視力下降。人眼長(zhǎng)時(shí)間暴露在各種射線下時(shí)，如計(jì)算機(jī)操作、汽車駕駛、看電視、電焊、鍋爐工等，易造成眼睛的結(jié)膜、虹膜、晶狀體輕度充血、紅腫、混濁，引起眼部不適。
對(duì)于這些長(zhǎng)時(shí)間眼睛處于緊張狀態(tài)下的人群，需要一種既能供給眼部營養(yǎng)又能迅速緩解眼部疲勞、補(bǔ)充營養(yǎng)的眼藥水問世。
有關(guān)金黃色葡萄球菌代謝產(chǎn)物的應(yīng)用，主要有防治腫瘤、戒毒、抗艾滋病等方面，未見有在治療眼病方面的應(yīng)用報(bào)道。如沈陽協(xié)合集團(tuán)有限公司申請(qǐng)了“從金黃色葡萄球菌代謝產(chǎn)物中提取治療惡性腫瘤用藥的方法”專利，CN1054190A(1023567C)，該方法的產(chǎn)品簡(jiǎn)稱“BM828”對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞有直接和間接的殺傷作用，培養(yǎng)基主要成分采用蛋白胨、豬心浸液、羊肝浸液制備。用肉湯復(fù)蘇培養(yǎng)菌種，用脫脂朱奶作菌株的保護(hù)劑，高壓滅菌不加任何防腐劑，經(jīng)熱處理、冷浸出、活性炭處理、除菌過濾等方式制得注射液，具有顯著的大幅度地增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用。
沈陽協(xié)合生物制藥股份有限公司申請(qǐng)了“一種金黃色葡萄球菌代謝產(chǎn)物藥物口服制劑及其用途”專利，CN1647801A，該藥物口服制劑，其含有以金黃色葡萄球菌經(jīng)培養(yǎng)、除菌、過濾所得的代謝產(chǎn)物原液。對(duì)防治腫瘤、糖尿病、乙肝、戒毒、抗艾滋病、抗病毒、提高免疫功能等有很好的療效。
沈陽協(xié)合集團(tuán)有限公司申請(qǐng)了“用于提高機(jī)體免疫功能的口服金黃色葡萄球菌濾液制劑”專利，CN1509725A，其以腸毒素SEA、SEB、SEC、SED及TSST-1作為活性成份，經(jīng)口服給藥；濾液中腸毒素的含量為5～10ng/ml。口服金黃色葡萄球菌濾液制劑可升高人體內(nèi)白細(xì)胞的數(shù)量，也可提高人體內(nèi)白小板數(shù)量；本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)療效確切；克服了目前口服生物制劑過少不足，毒副作用小。沈陽協(xié)合集團(tuán)有限公司申請(qǐng)了“金黃色葡萄球菌腸毒素在制備治療或預(yù)防艾滋病藥物中的應(yīng)用”專利，CN1509762A，金黃色葡萄球菌腸毒素給病人服用后，能明顯提高病人的抗病毒能力。
鑒于這種情況，本發(fā)明人經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的代謝產(chǎn)物，能顯著改善眼底微循環(huán)、消除微血管痙攣、補(bǔ)充營養(yǎng)因子、調(diào)節(jié)新陳代謝、促進(jìn)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的生長(zhǎng)保護(hù)性、潤濕性，緩解用眼過度造成的視力疲勞，預(yù)防和治療青少年近視，從而得知金黃色葡萄球菌的代謝產(chǎn)物制成的滴眼液在治療與預(yù)防近視眼和減緩視疲勞中具有很好的療效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務(wù)是提供一種金黃色葡萄球菌的代謝產(chǎn)物的新用途，具體是在治療與預(yù)防近視和減緩視疲勞中的應(yīng)用，即金黃色葡萄球菌經(jīng)培養(yǎng)制得代謝產(chǎn)物，然后制備成滴眼液，該滴眼液可有效緩解眼疲勞、預(yù)防和治療青少年近視的作用。
本發(fā)明采用的金黃色葡萄球菌系金黃色葡萄球菌金黃色亞種(Staphylococcus aureus subsp.aureus，CGMCC No.0910)是一種新菌株，在申請(qǐng)日前已送往中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心提供微生物樣品。
提供微生物樣品的請(qǐng)求人是鄒慶宇，地址杭州市上城區(qū)佑圣觀路101號(hào)三幢1單元36室，保藏時(shí)間2003年03月24日，保藏號(hào)0910。
本發(fā)明金黃色葡萄球菌金黃色亞種(Staphylococcus aureus subsp.aureus，CGMCC No.0910)的代謝產(chǎn)物在治療與預(yù)防近視和減緩視疲勞中的應(yīng)用，其滴劑的制備先將金黃色葡萄球菌金黃色亞種(CGMCCNo.0910)復(fù)蘇，在豬心胨培養(yǎng)基制備種子培養(yǎng)液，然后經(jīng)發(fā)酵制成培養(yǎng)菌液，具體方法如下(1)培養(yǎng)基的制備豬心培養(yǎng)基配方和工藝流程豬心胨培養(yǎng)基為豬心浸出液15ml％～25ml％、蛋白胨1g％～3g％、氯化鈉0.6g％～1.2g％；按配方稱取蛋白胨，氯化鈉，量取豬心浸出液，加注射用水至所需配方量，加熱溶解，攪拌均勻，滅菌，即得豬心胨培養(yǎng)基。
豬心浸出液的制備取新鮮豬心，去除血塊、脂肪及筋膜，用水沖洗干凈，攪碎，稱重，加二倍量的注射用水置4℃下保存14小時(shí)，取出，煮沸二小時(shí)趁熱用八層紗布過濾，再用布氏漏斗抽濾，得澄清黃色液體備用。
(2)金黃色葡萄球菌種子液的制備將金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus subsp.aureus，CGMCCNo.0910)接種豬心胨培養(yǎng)基，35℃～37℃培養(yǎng)24小時(shí)，再將種子菌轉(zhuǎn)入營養(yǎng)瓊脂平板中，劃分離培養(yǎng)24小時(shí)，選取典型菌落接種于豬心胨培養(yǎng)基，35℃～37℃培養(yǎng)24小時(shí)，得種子培養(yǎng)液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)菌液的制備將上述制得的種子培養(yǎng)液接種于豬心胨培養(yǎng)基中，35℃～37℃發(fā)酵培養(yǎng)48-72小時(shí)，中止培養(yǎng)，固液分離，用0.22μm微孔濾膜除菌，0.1MPa高壓下滅菌，得培養(yǎng)菌液。
(4)利用金黃色葡萄球菌的代謝產(chǎn)物制備預(yù)防與治療近視眼和緩解視疲勞的滴眼液以1000ml滴眼液計(jì)，培養(yǎng)菌液80ml～150ml、氯化鈉5g～12g，加注射用水至1000ml；制備方法將氯化鈉溶解于注射用水中，加入所需的培養(yǎng)菌液中，補(bǔ)水至全量，充分?jǐn)嚢韬笥?.22μm微孔濾膜過濾，熱壓滅菌，冷卻，分裝。
本發(fā)明的金黃色葡萄球菌金黃色亞種(Staphylococcus aureus subsp.aureus，CGMCC No.0910)，此菌株自1998年在實(shí)驗(yàn)室被發(fā)現(xiàn)以來，共傳代50次左右。一般情況下是4～8℃菌種斜面?zhèn)鞔４?，兩個(gè)月轉(zhuǎn)移一次，但在轉(zhuǎn)移的過程中要純化菌種與活化3～4次。特殊情況時(shí)保存時(shí)間稍長(zhǎng)些，三個(gè)月傳代一次。
菌種穩(wěn)定性自發(fā)現(xiàn)此菌株以來，在4℃～8℃的條件下進(jìn)行傳代保存(保存期2個(gè)月左右。)在這么多次的傳代、純化復(fù)壯、活化及生產(chǎn)培養(yǎng)過程中，尚未發(fā)現(xiàn)有異?，F(xiàn)象。在30℃～37℃溫度培養(yǎng)，其菌落形態(tài)，細(xì)菌個(gè)體形態(tài)的穩(wěn)定性均佳，細(xì)菌體培養(yǎng)分泌產(chǎn)物成分及有關(guān)成分的含量也較穩(wěn)定。
生物特性細(xì)胞球形，直徑0.5μm～1.5μm。單個(gè)，成對(duì)和不規(guī)則堆狀。革蘭氏陽性，不運(yùn)動(dòng)，不生芽孢，兼性厭氧。化能異養(yǎng)，即有呼吸亦有發(fā)酵二種代謝型。菌落不透明，黃到橙色。接觸酶通常陽性；有細(xì)胞色素，但氧化酶陰性。10％NaCl生長(zhǎng)，pH值7左右，最適菌體生長(zhǎng)溫度30℃～37℃。
本發(fā)明的積極效果在于一種金黃色葡萄球菌金黃色亞種(Staphylococcus aureus subsp.aureus，CGMCC No.0910)的代謝產(chǎn)物在治療與預(yù)防近視眼和減緩視疲勞中的應(yīng)用，即以自行篩選的金黃色葡萄球菌菌種作為生物反應(yīng)器提取的天然活性物質(zhì)為主要成份，制備成滴眼液，選擇由結(jié)膜囊滴入、經(jīng)旁路系統(tǒng)進(jìn)入眼循環(huán)系統(tǒng)，對(duì)睫狀肌有松馳其緊張狀態(tài)的功能，能顯著改善眼底微循環(huán)、消除微血管痙攣、補(bǔ)充營養(yǎng)因子、調(diào)節(jié)新陳代謝、促進(jìn)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的生長(zhǎng)保護(hù)性、潤濕性、保濕性，防止眼干，減輕由于微小刺激引起的眼部炎癥、充血，對(duì)因用眼過度、強(qiáng)光刺激及紫外線輻射造成的眼部炎性損傷有良好的預(yù)防及恢復(fù)作用。
用法如灌裝成1ml/支的本發(fā)明滴眼液，滴入眼瞼內(nèi)，1次1～2滴，一日3次～4次。
用本發(fā)明的金黃色葡萄球菌金黃色亞種(Staphylococcus aureus subsp.aureus，CGMCC No.0910)的代謝產(chǎn)物制備的滴眼液能夠達(dá)到緩解眼疲勞和預(yù)防治療青少年近視的作用且無不良反應(yīng)。
(四)具體實(shí)施方案參照附隨的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的描述，這些實(shí)施例決不是對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1金黃色葡萄球菌CGMCC No.0910的培養(yǎng)(1)培養(yǎng)基的制備豬心浸出液的制備取新鮮豬心，去除血塊、脂肪及筋膜，用水沖洗干凈，攪碎，稱重，加二倍量的注射用水置4℃下保存14小時(shí)，取出，煮沸二小時(shí)趁熱用八層紗布過濾，再用布氏漏斗抽濾，得澄清黃色液體備用。
豬心胨培養(yǎng)基的配制稱取蛋白胨2g、氯化鈉0.9g，量取豬心浸出液20ml，加注射用水至100ml，加熱溶解，攪拌均勻，滅菌，制得豬心胨培養(yǎng)基備用。
(2)金黃色葡萄球菌種子液的制備
金黃色葡萄球菌菌種啟開后，轉(zhuǎn)入豬心胨培養(yǎng)基中，36℃±1℃培養(yǎng)24小時(shí)，再轉(zhuǎn)入營養(yǎng)瓊脂平板中，劃分離培養(yǎng)24小時(shí)，選取典型菌落接種轉(zhuǎn)入裝有15ml的豬心胨培養(yǎng)基的小三角瓶中，在36℃±1℃搖床內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)，如此反復(fù)3次，即得種子培養(yǎng)液。
(3)發(fā)酵培養(yǎng)菌液的制備(供下面實(shí)施例2～5使用)將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液15ml倒入已有400ml豬心胨培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，置搖床內(nèi)36℃±1℃培養(yǎng)48小時(shí)。將培養(yǎng)后的菌液離心分離，5000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清液。用塞氏濾器0.22μm過濾除菌，裝入500ml輸液瓶中，再置于高壓滅菌器內(nèi)0.1MPa滅菌35分鐘，取出，冷卻，即得發(fā)酵菌液。
實(shí)施例2金黃色葡萄球菌CGMCC No.0910培養(yǎng)物制成眼用滴劑滴眼液配方發(fā)酵菌液 100ml氯化鈉 8.1g加注射用水，制取1000ml滴眼液制備方法稱取氯化鈉8.1g，用約800ml注射用水溶解，然后加入發(fā)酵菌液100ml，攪拌均勻，補(bǔ)注射用水至總量為1000ml，充分?jǐn)嚢杈鶆?，?.22μm的微孔濾膜過濾，115℃熱壓滅菌，冷卻，分裝成1ml，包裝，既得，產(chǎn)品的pH值為5.0～7.0。
實(shí)施例3金黃色葡萄球菌CGMCC No.0910培養(yǎng)物制成眼用滴劑滴眼液配方發(fā)酵菌液 80ml氯化鈉 6.1g加注射用水，制取1000ml滴眼液制備方法同實(shí)施例2。
實(shí)施例4金黃色葡萄球菌CGMCC No.0910培養(yǎng)物制成眼用滴劑滴眼液配方發(fā)酵菌液 120ml氯化鈉 10g加注射用水，制取1000ml滴眼液制備方法同實(shí)施例2。
實(shí)施例5金黃色葡萄球菌CGMCC No.0910培養(yǎng)物制成眼用滴劑滴眼液配方發(fā)酵菌液 150ml氯化鈉 12g加注射用水，制取1000ml滴眼液制備方法同實(shí)施例2。
實(shí)施例6金黃色葡萄球菌CGMCC No.0910培養(yǎng)物制成的眼用滴劑的急性毒性實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)用滴眼液采用上述本發(fā)明方法制備，參照實(shí)施例1～5；受試動(dòng)物家兔，日本大耳白種，體重1.5-2.8kg，雌雄兼有；小鼠，昆明種，均由中國醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供，合格證號(hào)遼實(shí)合質(zhì)字021號(hào)；(一)對(duì)家兔眼結(jié)膜囊內(nèi)給藥的急性觀察體重1.8-2.5kg家兔16只，雌雄近半，隨機(jī)分兩組，每組8只，分別向結(jié)膜囊內(nèi)滴溶劑對(duì)照液和本發(fā)明滴眼液0.1ml/眼，在四小時(shí)內(nèi)滴四次，觀察藥后24小時(shí)內(nèi)全身狀態(tài)，眼局部反應(yīng)等，結(jié)果無明顯反應(yīng)，每天同上給藥，連續(xù)7天，測(cè)定給藥前和給藥后4、7天體重、呼吸、結(jié)膜局部反應(yīng)(按眼刺激評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)記分)、一般狀態(tài)等，第7天測(cè)II導(dǎo)聯(lián)心電圖，計(jì)算心率；
結(jié)果一次給藥后24小時(shí)內(nèi)上述指標(biāo)無明顯變化，連續(xù)給藥7天，測(cè)定4、7天體重、呼吸、心率、結(jié)膜局部反應(yīng)及動(dòng)物一般狀態(tài)等，兩組家兔均無明顯差別，表時(shí)本發(fā)明滴眼液對(duì)家兔多次結(jié)膜囊內(nèi)給藥，沒產(chǎn)生明顯急性反應(yīng)。
(二)對(duì)小鼠靜脈給藥最大給藥量測(cè)定方法取體重18-20g小鼠12只，均分4組，每組3吸，按0.1ml/10g、0.2ml/10g、0.3ml/10g、0.4ml/10g靜脈注射給藥，給藥速度0.1ml/5秒。觀察藥后24小時(shí)，結(jié)果和組小鼠均不產(chǎn)生死亡；另取體重18-20g小鼠20只，雌雄各半，禁食不禁水12h，尾靜脈注射本發(fā)明滴眼液20ml/kg，觀察7天；結(jié)果注藥后小鼠活動(dòng)自如，毛光、大小便正常，攝食量、飲水等一般狀態(tài)無明顯影響，7天內(nèi)無死亡。最大給藥量20ml/kg，由于實(shí)驗(yàn)給藥途徑與臨床不一致，因此不計(jì)算相當(dāng)于臨床劑量的倍數(shù)；滴眼液向家兔眼結(jié)膜囊內(nèi)多次給藥沒產(chǎn)生毒性反應(yīng)，為進(jìn)一步了解該藥毒性反應(yīng)又作了小鼠靜脈給藥，結(jié)果測(cè)不出LD50，測(cè)得最大給藥量為20ml/kg。
實(shí)施例7金黃色葡萄球菌CGMCC No.0910培養(yǎng)物制成眼用滴劑在治療與預(yù)防近視眼和減緩視疲勞中的作用試驗(yàn)用滴眼液采用上述本發(fā)明方法制備，參照實(shí)施例1～5；空白溶劑為不含藥物的本發(fā)明滴眼液，由遼寧省醫(yī)藥工業(yè)研究院提供，批號(hào)20020109；珍視明滴眼液江西省撫州制藥廠，批號(hào)020204，本實(shí)驗(yàn)中作為陽性對(duì)照藥；試劑與儀器氯化乙酰膽堿上海試劑三廠生產(chǎn)，批號(hào)011227；腎上腺素天津市氨基酸公司生產(chǎn)，批號(hào)20010418；紫外燈30W，波長(zhǎng)254nm，沈陽市東陵燈具廠生產(chǎn)；動(dòng)物家兔，日本大耳白種，體重2.1-3。0Kg，雌雄兼有；小鼠，昆明種，均由中國醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供，合格證號(hào)遼實(shí)合質(zhì)021號(hào)；(一)對(duì)兔眼紫外線輻射損傷的保護(hù)作用方法取上述健康家兔30只，按體重、性別隨機(jī)分5組，每組6只12只眼，分別于家兔眼結(jié)膜囊內(nèi)給空白溶劑對(duì)照、珍視明滴眼液、本發(fā)明滴眼大、中、小三個(gè)劑量組，每次給藥時(shí)，將眼瞼提起，藥物滴入結(jié)膜囊內(nèi)均為0.1ml，停留10秒以上，中間閉合眼瞼三次，本發(fā)明滴眼液大劑量組每日滴藥6次，小劑量每日滴藥2次，其它各組均每日滴藥4次。預(yù)防給藥一天，次日，家兔用兔夾固定，將波長(zhǎng)254nm紫外燈置于兔眼前40cm處，進(jìn)行照射，照射強(qiáng)度為5000μW/cm2，第一天上午照射3小時(shí)，下午1小時(shí)，第二、三天上午照射2小時(shí)，下午1小時(shí)，三天共照射10小時(shí)，每天給藥，連續(xù)6天。觀察紫外燈照射前及照射后2-6天眼瞼結(jié)膜、球結(jié)膜、瞬膜、角膜、虹膜的受損程度，觀察眼分泌物，另用Schirmer法測(cè)定波浪分泌量，即將長(zhǎng)35mm、寬3mm濾紙條，一端折2mm寬放于兔眼下穹窿內(nèi)，被動(dòng)閉合，記一分鐘內(nèi)濾紙被浸濕的長(zhǎng)度表示波浪分泌量。對(duì)眼結(jié)膜、角膜等輻射損傷程度用分級(jí)計(jì)分方法進(jìn)行觀察與統(tǒng)計(jì)，分級(jí)計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。
結(jié)果家兔眼經(jīng)紫外線輻射后，瞼結(jié)膜、球結(jié)膜、瞬膜均呈現(xiàn)充血、水腫等炎反應(yīng)，隨輻射劑量增加炎癥反應(yīng)加重。本發(fā)明滴眼液和珍視明滴眼液均呈現(xiàn)顯著保護(hù)作用(見表2、3、4)。經(jīng)紫外線輻射后，空白溶劑級(jí)家兔均閉眼、畏光、流淚，給藥各組大部分動(dòng)物均可見半睜眼，畏光程度較輕等，表明本發(fā)明滴眼液對(duì)紫外線輻射損傷有保護(hù)作用，對(duì)瞼結(jié)膜、球結(jié)膜和瞬膜的損傷程度看到，本發(fā)明滴眼液大劑量組作用強(qiáng)于珍視明滴眼液(P＜0.05)。
表1 家兔眼刺激損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)
表2 本發(fā)明滴眼液對(duì)家兔瞼結(jié)膜紫外線輻射損傷的保護(hù)
(n＝12)*，**與空白對(duì)照組比較P＜0.05，0.01△與珍視明組比較P＜0.05表3 本發(fā)明滴眼液對(duì)家兔球結(jié)膜紫外線輻射損傷的保護(hù)
(n＝12)*，**與空白對(duì)照組比較P＜0.05，0.01△與珍視明組比較P＜0.05表4 本發(fā)明滴眼液對(duì)家兔瞬膜紫外線輻射損傷的保護(hù)
(n＝12)*，**與空白對(duì)照組比較P＜0.05，0.01△，△△與珍視明組比較P＜0.05，0.01
角膜和虹膜受長(zhǎng)時(shí)間紫外線輻射后，角膜出現(xiàn)散在渾濁或半透明區(qū)，虹膜出現(xiàn)貧血、腫脹等現(xiàn)象。給藥各組角膜與虹膜的損傷有明顯減輕，本發(fā)明滴眼液和珍視明滴眼液對(duì)角膜、虹膜的損傷均有較強(qiáng)的保護(hù)作用(見表5、6)。
經(jīng)紫外線輻射后，從外觀所見兔眼分泌物增加，給藥各組均能明顯減少眼分泌物，與空白容劑組比較(P＜0.05-0.1)，其中本發(fā)明滴眼液大、中劑量組藥后5、6天與珍視明滴眼液組比較眼分泌物顯著減少(P＜0.05)，表明本發(fā)明滴眼液有較強(qiáng)的抗紫外線輻射所引起的分泌物增多的作用。用Schirmer法測(cè)定淚液分泌量，經(jīng)紫外線輻射后淚液分泌量明顯增加，給藥各組也都明顯增加淚液分泌量，其中本發(fā)明滴眼液大、中劑量組淚液分泌量增加更為明顯。(見表7、8)表5 本發(fā)明滴眼液對(duì)家兔角膜紫外線輻射損傷的保護(hù)
(n＝12)*，**與空白對(duì)照組比較P＜0.05，0.01表6 本發(fā)明滴眼液對(duì)家兔虹膜紫外線輻射損傷的保護(hù)
(n＝12)*，**與空白對(duì)照組比較P＜0.05，0.01
表7 本發(fā)明滴眼液對(duì)家兔受紫外線輻射后分泌物的影響
(n＝12)*，**與空白對(duì)照組比較P＜0.05，0.01△與珍視明組比較P＜0.05表8 本發(fā)明滴眼液對(duì)家兔受紫外線輻射后分泌物的影響
(n＝12)與損傷前比較增加率(％)(二)對(duì)正常家兔眼睫狀肌張力的影響方法取健康家兔，摘出眼球放于K-H液中，除去角膜、晶狀體和玻璃體，于鞏膜和睫狀肌間剝離，游離睫狀肌，但肌韌帶與鞏膜相連，將睫狀肌連同鞏膜縱向剪成約4mm寬肌條，在距離睫狀肌下端約3mm處的鞏膜剪斷，去掉多余的鞏膜。將兩條睫狀肌條用絲線串連，上下兩端穿線，下固定于盛有K-H液的麥?zhǔn)显」艿撞?，上連于換能器杠桿上，加負(fù)荷100mg，恒溫30℃，通過氧氫，睫狀肌收縮活動(dòng)記錄于記錄儀上，溫育約1小時(shí)，待肌張力穩(wěn)定后，麥?zhǔn)显」苤蟹?9ml K-H營養(yǎng)液，加本發(fā)明滴眼液和珍視明滴眼液1ml，終濃度即為原眼藥水被稀釋20倍的濃度。觀察在藥物作用下，睫狀體張力的變化，以給藥前肌張力為零，記錄給藥后8分鐘內(nèi)張力最低值為給藥后張力。
結(jié)果給本發(fā)明滴眼液后，睫狀肌張力逐漸降低，8分鐘內(nèi)最大下降3.58mm(見表9)，顯見該藥能明顯降低家兔睫狀肌張力，其作用強(qiáng)于珍視明滴眼液(P＜0.01)。表明該藥能使眼睫狀肌張力降低，對(duì)疲勞眼睛起調(diào)節(jié)作用。
表9 本發(fā)明滴眼液對(duì)家兔眼睫狀肌張力的影響
*與珍視明滴眼液比較P＜0.01(三)抗乙酰膽堿的作用方法同二，在加空白溶劑、本發(fā)明滴眼液或珍視明2分鐘后再加乙酰膽堿觀察該藥對(duì)抗乙酰膽堿的作用見(表10)。在該藥物作用下睫狀機(jī)張力降低時(shí)加入酰膽堿，觀察藥物的抗乙酰膽堿的作用，結(jié)查其差值空白溶劑為3.55±1.10、珍視明1.87±1.52、本發(fā)明滴眼液0.42±1.10(見表10)，本發(fā)明滴眼液與空白溶劑組比較(P＜0.05)，表明該藥有顯著的抗乙酰膽堿作用。
表10 本發(fā)明滴眼液對(duì)家兔眼睫狀肌抗乙酰膽堿作用的影響
n＝6，**與空白組比較P＜0.01
(四)對(duì)家兔眼睫狀肌的解痙作用方法同二，向麥?zhǔn)显」苤屑右阴Ｄ憠A終濃度為5×10-5，睫狀肌呈穩(wěn)定的痙攣狀態(tài)，待致痙作用穩(wěn)定后加入眼藥，觀察對(duì)抗乙酰膽堿的致痙作用。測(cè)定乙酰膽堿的致痙高度，測(cè)定乙酰膽堿致痙后加入藥物你用8分鐘內(nèi)最低高度其差值為解痙程度，以該差值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。
結(jié)果兔眼睫狀肌在乙酰膽堿致痙狀態(tài)下，兩藥均有解痙作用(見表11)，本發(fā)明滴眼液解痙作用略強(qiáng)于珍視明滴眼液，其下降百分率珍視明為55.88、本發(fā)明滴眼液為76.67，表明該藥對(duì)睫狀機(jī)處于痙攣狀態(tài)具有調(diào)節(jié)作用。
表11 本發(fā)明滴眼液對(duì)家兔眼睫狀肌的解痙作用
(n＝7，X±SD)與空白對(duì)照組比較P＜0.05上述藥效學(xué)試驗(yàn)表明目前越來越多的人由于用眼過度或長(zhǎng)期處于視屏端，如電視、電腦、家用電器、光電儀器等，對(duì)人類眼睛健康的影響，現(xiàn)已引起人們廣泛重視；野外工作、旅游等，紫外線對(duì)眼睛造成的傷害等，會(huì)造成眼疲勞癥等有關(guān)眼病，急需研制具有防護(hù)和保健功能的眼藥。本發(fā)明滴眼液就是根據(jù)臨床需要研制的具有防治眼疲勞功能的藥物，本試驗(yàn)用波長(zhǎng)254nm的紫外線對(duì)兔眼進(jìn)行輻射，由于距離近，照射時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)瞼結(jié)膜、球結(jié)膜、瞬膜、角膜、虹膜均造成較重的炎性損傷，本發(fā)明滴眼液具有顯著的預(yù)防作用，其作用強(qiáng)度與珍視明滴眼液相近。測(cè)定淚液分泌量結(jié)果，紫外線輻射可使淚液分泌量作用較強(qiáng)，這是一種生理保護(hù)反應(yīng)，本發(fā)明滴眼液大劑量組增加淚液分泌量作用較強(qiáng)，顯見是一種對(duì)眼的保護(hù)作用。
眼睫狀肌通過睫狀小帶與晶狀體相連，顯見是一種對(duì)眼的保護(hù)作用。
眼睫狀肌通過睫狀小帶與晶狀體相連，來調(diào)節(jié)晶狀體的屈光度，因此睫狀肌是眼調(diào)節(jié)作用主要因素。經(jīng)眼睫狀肌張力實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明滴眼液能使睫狀肌張力降低在乙酰膽堿所致睫狀肌痙攣狀態(tài)下，該藥有顯著解痙作用，可見該藥對(duì)眼睫狀肌有調(diào)節(jié)作用，特別在眼疲勞時(shí)，睫狀肌處于高度收縮狀態(tài)下，可緩解收縮狀態(tài)，達(dá)到治療眼疲勞的作用。
經(jīng)微循環(huán)實(shí)驗(yàn)看到，局部應(yīng)用本發(fā)明滴眼液可顯著改善局部微循環(huán)，該藥為滴眼應(yīng)用必將改善眼的微循環(huán)，增加眼部氧和營養(yǎng)供應(yīng)，改善眼部代謝，改善眼的疲勞狀態(tài)。通過熱板法和化學(xué)致痛法鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)看到，該藥有鎮(zhèn)痛作用，對(duì)疲勞狀態(tài)下眼睛的不適癥狀也有所改善。
結(jié)果表明，用金黃色葡萄球菌CGMCC No.0910的代謝產(chǎn)物制備的滴眼液可有效治療與預(yù)防近視眼和減緩視疲勞作用且無不良反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種金黃色葡萄球菌的代謝產(chǎn)物在治療與預(yù)防近視和減緩視疲勞中的應(yīng)用，所述的金黃色葡萄球菌為金黃色亞種，Staphylococcus aureussubsp.aureus，CGMCC No.0910。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于金黃色葡萄球菌金黃色亞種，CGMCC No.0910，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)物制成滴眼液，具體方法如下(1)金黃色葡萄球菌金黃色亞種，CGMCC No.0910，接種于豬心胨培養(yǎng)基，35℃～37℃培養(yǎng)24小時(shí)，再將種子菌轉(zhuǎn)入營養(yǎng)瓊脂平板中，劃分離培養(yǎng)24小時(shí)，選取典型菌落接種于豬心胨培養(yǎng)基，35℃～37℃培養(yǎng)24小時(shí)，得種子培養(yǎng)物；其中所用的豬心胨培養(yǎng)基，為豬心浸出液15ml％～25ml％，蛋白胨1g％～3g％，氯化鈉0.6g％～1.2g％；(2)將種子培養(yǎng)物接種于豬心胨培養(yǎng)基中，35℃～37℃發(fā)酵培養(yǎng)48-72小時(shí)，中止培養(yǎng)，固液分離，用0.22μm微孔濾膜除菌，0.1MPa高壓下滅菌，得金黃色葡萄球菌培養(yǎng)菌液；(3)以1000ml滴眼液計(jì)，其中金黃色葡萄球菌培養(yǎng)菌液80ml～150ml，氯化鈉5g～12g，其余為注射用水；按配方將氯化鈉溶解于注射用水中，加入培養(yǎng)菌液，補(bǔ)水至全量，充分?jǐn)嚢韬笥?.22μm微孔濾膜過濾，熱壓滅菌，冷卻，分裝。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于以1000ml滴眼液計(jì)，其中培養(yǎng)菌液100ml，氯化鈉8.1g，其余為注射用水。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微生物培養(yǎng)物的新用途，具體地說是金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus subsp.aureus，CGMCC No.0910)的代謝產(chǎn)物在治療與預(yù)防近視眼和減緩視疲勞中的應(yīng)用，代謝產(chǎn)物制備成藥物的具體方法為，包括所述金黃色葡萄球菌的復(fù)蘇、在豬心胨培養(yǎng)基制備種子培養(yǎng)液，然后經(jīng)發(fā)酵制成培養(yǎng)菌液以1000ml滴眼液計(jì)，其中培養(yǎng)菌液80ml～150ml，氯化鈉5g～12g，其余為注射用水，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，熱壓滅菌，制得滴眼液。本發(fā)明人研究證明，自行篩選的金黃色葡萄球菌CGMCC No.0910培養(yǎng)物可有效治療與預(yù)防近視眼和減緩視疲勞作用且無不良反應(yīng)。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1843381SQ20061004941
公開日2006年10月11日 申請(qǐng)日期2006年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月14日
發(fā)明者鄒慶宇 申請(qǐng)人:鄒慶宇