專(zhuān)利名稱(chēng)：一株應(yīng)用于原油脫硫的兼性嗜熱古地分枝桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)涉及一株可在嗜熱條件下脫除原油中有機(jī)硫的古地分枝桿菌。
背景技術(shù)：
化石燃料中含有大量的硫元素，在燃燒過(guò)程中形成SOx類(lèi)有毒氣體，釋放到大氣中轉(zhuǎn)化為酸雨嚴(yán)重污染大氣和水源，破壞生態(tài)環(huán)境，威脅著人類(lèi)賴(lài)以生存的綠色家園。隨著能源危機(jī)的進(jìn)一步加劇，低硫化石燃料越來(lái)越少，重質(zhì)油的開(kāi)采成為必然，重質(zhì)油硫含量高，粘度大，脫硫工藝復(fù)雜。
歐洲2005年已實(shí)施歐IV排放標(biāo)準(zhǔn)，要求汽油硫含量小于50ppm，車(chē)用柴油硫含量小于50ppm；2010年將實(shí)施歐V排放，主要要求將車(chē)用汽柴油硫含量降到10ppm以下。我國(guó)也將對(duì)車(chē)用燃油實(shí)施越來(lái)越嚴(yán)格的控硫標(biāo)準(zhǔn)，2005年7月1日全國(guó)開(kāi)始執(zhí)行歐洲II排放標(biāo)準(zhǔn)，這要求汽油硫含量不大于500ppm。按照國(guó)家環(huán)保局要求，2007～2010年全國(guó)開(kāi)始實(shí)施國(guó)家第三/四階段排放標(biāo)準(zhǔn)(等效采用歐III/IV排放標(biāo)準(zhǔn))。北京于2005年7月提前實(shí)施歐洲III排放標(biāo)準(zhǔn)，要求汽油硫含量不大于150ppm，柴油硫含量不大于350ppm。
傳統(tǒng)加氫脫硫技術(shù)(HDS)脫硫過(guò)程中，使用無(wú)機(jī)催化劑在200～450℃高溫和150～200psig高壓下反應(yīng)才能達(dá)到脫硫的要求。HDS技術(shù)存在著高溫高壓、使用大量氫氣、能耗大、引起二次污染等缺點(diǎn)，并且HDS技術(shù)不能脫除苯并噻吩類(lèi)雜環(huán)含硫化合物中的硫。由于HDS的局限性及各國(guó)立法對(duì)油品中硫含量的嚴(yán)格限制，迫切需要尋找新的石油脫硫方法。
近年來(lái)，迅速發(fā)展的生物催化脫硫技術(shù)(BDS)在常溫下即可進(jìn)行，并且具有高專(zhuān)一性，這使得BDS方法成為一種可供選擇的方法。化石燃料中有機(jī)硫主要為噻吩類(lèi)，包括噻吩、苯并噻吩、二苯并噻吩(DBT)以及含有更多苯環(huán)的噻吩類(lèi)及其甲基取代物，生物脫硫研究以DBT為模式化合物進(jìn)行。現(xiàn)在已經(jīng)證實(shí)許多菌屬如紅球菌屬(Rhodococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacte)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)等，能夠沿著硫?qū)Ｒ煌緩浇到釪BT，它們不打開(kāi)苯環(huán)，從而保留了燃燒值。
與柴油、汽油相比，原油具有硫含量大，成分復(fù)雜，粘度高等特點(diǎn)。現(xiàn)有的精練技術(shù)費(fèi)用高，并且不適用于深度脫硫。如果在原油冶煉前將硫含量降到一個(gè)較低的水平就可以大大降低下游處理壓力，降低成本。由于原油中硫成分復(fù)雜，含有無(wú)機(jī)硫及大量有機(jī)硫，有機(jī)硫主要為硫醇、硫醚和噻吩類(lèi)雜環(huán)化合物，要求生物脫硫菌株具有較寬的底物范圍。根據(jù)專(zhuān)利和文獻(xiàn)檢索，Toshiki等2003年報(bào)道了Mycobacterium phlei WU-F1在45℃下對(duì)輕質(zhì)柴油達(dá)到60％～70％的脫硫率，Yoshitaka等2004年報(bào)道了Mycobacteriumphlei WU-0103在45℃下處理直餾輕質(zhì)柴油達(dá)到52％的脫硫率，但是，尚無(wú)在高溫下對(duì)原油具有明顯脫硫效果的菌株報(bào)道。目前，為了提高采油率，很多油田采用注水驅(qū)油，使得原油中水份含量高達(dá)80％～90％，這給后處理帶來(lái)很多麻煩，卻為生物脫硫創(chuàng)造了更好的條件。如此高的含水量可以保證生物催化劑的活力。
然而，由于原油出井后常處于較高溫度，為了將生物催化劑真正應(yīng)用到煉油，工廠進(jìn)行生物脫硫時(shí)，要求所用的生物催化劑在較高的溫度下具有活力。因此使用嗜熱微生物脫硫表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)，如嗜熱微生物可以省去精煉中油品冷卻過(guò)程帶來(lái)的麻煩，并可提高生物脫硫的反應(yīng)速率；嗜熱微生物酶催化制劑穩(wěn)定性好；嗜熱微生物在較高溫度下生長(zhǎng)，可抑制其它微生物的生長(zhǎng)，減少生物催化劑的污染；高溫下原油粘度降低，降低操作難度。因此嗜熱微生物脫硫具有更大的應(yīng)用前景，成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中脫除原油中有機(jī)硫方法的不足，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一株應(yīng)用于原油脫硫的兼性嗜熱古地分枝桿菌，此菌株能夠在45℃下專(zhuān)一性降解DBT，生成2-羥基聯(lián)苯，并可以進(jìn)一步作用于2-羥基聯(lián)苯生成2-甲氧基聯(lián)苯，并且本發(fā)明所提供的菌株在45℃下所具有的對(duì)原油的生物脫硫能力是首次發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明提供的菌株為兼性嗜熱古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)。該菌株于2005年12月5日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)，中國(guó)武漢)，保藏中心編號(hào)為CCTCC NO.M 205142。
上述古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142經(jīng)德國(guó)微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Braunschweig，Germany)鑒定，具有如下生物學(xué)特征菌體為彎曲桿狀菌，大小為0.3～0.5×2.0～3.0μm，生長(zhǎng)初期菌落為乳白色，漸變?yōu)辄S色，菌株好氧，不運(yùn)動(dòng)，無(wú)孢子，過(guò)氧化物酶陽(yáng)性，氧化酶陰性，硝酸鹽還原陽(yáng)性，酸染色不著色，革蘭氏染色陽(yáng)性。菌株細(xì)胞壁含有谷氨酸，丙氨酸，消旋二氨基庚二酸。主要的細(xì)胞壁糖成分為阿拉伯糖，半乳糖。16S rDNA序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)所述菌與分枝桿菌屬古地分枝桿菌具有99％的相似性。
根據(jù)上述生理特征及16S rDNA序列分析確定本發(fā)明所述CCTCC NO.M 205142菌株為古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)。
上述古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142的16S rDNA基因序列長(zhǎng)度為1384個(gè)堿基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142的培養(yǎng)溫度為25～50℃，可以在MAM(modification of A Medium)液體培養(yǎng)基上以有機(jī)含硫化合物如二甲基亞砜(DMSO)或噻吩類(lèi)化合物作為唯一硫源生長(zhǎng)，也可以在LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
上述的兼性嗜熱古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142可在30～50℃下專(zhuān)一性脫除二苯并噻吩、二苯并噻吩衍生物中的硫，不破壞碳架，保留了燃燒值。
其中，上述的二苯并噻吩衍生物為4，6-二甲基-二苯并噻吩、DBT-砜、4-甲基-二苯并噻吩之一。
本發(fā)明所述的兼性嗜熱古地分枝桿菌在原油脫硫中的應(yīng)用，其脫硫方法涉及的步驟順序如下(1)菌種選擇選用兼性嗜熱古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142；(2)斜面培養(yǎng)將菌種接種于含有質(zhì)量體積比為1.5～2.0％的瓊脂并加有0.5～2.0mmol/L的二甲基亞砜(DMSO)的固體斜面MAM培養(yǎng)基上，25～50℃條件下，靜止培養(yǎng)36～60小時(shí)；(3)種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接1～2環(huán)于100ml含有0.5～2.0mmol/L的二甲基亞砜(DMSO)的液體MAM培養(yǎng)基中，25～50℃條件下，振蕩培養(yǎng)12～24小時(shí)，制得種子液；(4)擴(kuò)大培養(yǎng)以5～10％的體積比的接種量，將種子液接種于1000ml含有0.5～2.0mmol/L的二甲基亞砜(DMSO)液體MAM培養(yǎng)基中，25～50℃條件下，振蕩培養(yǎng)12～24小時(shí)；(5)生物催化劑制備取步驟(4)所得的培養(yǎng)液，4,000～5,000轉(zhuǎn)/分鐘離心10～20分鐘，收集沉淀細(xì)胞，使用100mmol/L，pH7.0磷酸緩沖液重懸細(xì)胞，再以相同的條件離心，重復(fù)2～3次，收集沉淀細(xì)胞，并重懸于此磷酸緩沖液中，使菌體濃度達(dá)到9～18克干細(xì)胞/升，即為制備好的古地分枝桿菌休止細(xì)胞懸濁液，也稱(chēng)生物催化劑；(6)處理樣品在反應(yīng)體系中(100～1000ml)，以步驟(5)所得的休止細(xì)胞懸濁液作為水相，加入原油，使原油與水相的體積比為1∶10～20，在30～45℃條件下，180轉(zhuǎn)/每分鐘振蕩50～72小時(shí)，進(jìn)行樣品處理；(7)分離樣品以10,000轉(zhuǎn)/分鐘離心5～10分鐘分離步驟(6)中處理后的樣品，得到上層原油樣品；(8)樣品檢測(cè)取1～5μl步驟(7)中的原油樣品，使用硫氮元素分析儀測(cè)定原油中殘留的硫含量，然后對(duì)照未處理的樣品硫含量，得出經(jīng)所述兼性嗜熱古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142處理原油的脫硫率。
在上述的脫硫方法涉及的步驟中，步驟(2)、(3)、(4)中所述的菌體培養(yǎng)溫度優(yōu)選是40～50℃；二甲基亞砜(DMSO)的濃度優(yōu)選為1.0～1.5mmol/L。
在上述的脫硫方法涉及的步驟中，步驟(3)、(4)中所述的菌體培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選是16～18小時(shí)。
在上述的脫硫方法涉及的步驟中，步驟(5)中所述的生物催化劑的菌體濃度優(yōu)選是12～18克干細(xì)胞/升。
在上述的脫硫方法涉及的步驟中，步驟(6)中所述的原油與水相的體積比例優(yōu)選為1∶15～20，處理樣品的溫度優(yōu)選為40～45℃，樣品振蕩時(shí)間優(yōu)選為60～72小時(shí)。
在上述利用古地分枝桿菌休止細(xì)胞高溫脫除原油中有機(jī)硫的方法中，菌株培養(yǎng)使用液體MAM培養(yǎng)基(modification of A Medium MAM)，配方為葡萄糖10g/L；0.5g/KH2PO4；4g/L升K2HPO4；1g/L NH4Cl；質(zhì)量百分比濃度為1％的CaCl22ml/L；質(zhì)量百分比濃度為10％的MgCl2·6H2O 2ml/L；質(zhì)量百分比濃度為1％的FeCl3200μl/L；質(zhì)量百分比濃度為5％的NaCl 200μl/L；質(zhì)量百分比濃度為1％的酵母浸膏5ml/L；維生素混合液200μl/L；金屬離子混合液5ml/L，115℃滅菌20分鐘。
上述固體斜面基本無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基為上述液體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基成分添加質(zhì)量體積百分比濃度為1.6％的瓊脂粉。
上述的金屬離子混合液的配方為，每升蒸餾水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O 0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl120mmol。
上述的維生素混合液的配方為，每升蒸餾水含有400mg泛酸鈣(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/煙酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg對(duì)氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
上述LB培養(yǎng)基配方如下，1L蒸餾水中含10g蛋白胨，5g酵母粉，10g NaCl，固體LB培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為1.6％的瓊脂粉，121℃條件下滅菌20分鐘。
利用本發(fā)明所述的古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142可以在高溫下有效降解二苯并噻吩(DBT)及其甲基衍生物，上述古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142降解二苯并噻吩中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物的質(zhì)譜圖請(qǐng)參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖(圖1、圖2、圖3、圖4)。上述古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142尤其可以脫除以二苯并噻吩(DBT)為代表的有機(jī)含硫化合物中的硫元素。在脫除以二苯并噻吩(DBT)為代表的一大類(lèi)化石燃料中的含硫化合物時(shí)，專(zhuān)一性的攻擊C-S鍵，對(duì)C-C鍵不起作用，保留了化合物的碳架結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明采用古地分枝桿菌休止細(xì)胞作為生物催化劑，能夠有效地在高溫條件下脫除原油中的含硫有機(jī)化合物。
例如使用GC-PFPD(氣相色譜-脈沖式火焰光度檢測(cè)器)測(cè)定休止細(xì)胞處理前后的原油中的含硫化合物的變化。總硫含量使用Antek 7000硫氮元素分析儀(美國(guó)，Antek公司產(chǎn)品)進(jìn)行分析測(cè)定，總硫含量測(cè)定為3,600ppm。在40℃條件下，使用本發(fā)明所述的古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142休止細(xì)胞可將硫含量為3,600ppm的原油中的硫含量降低到1,478ppm，脫除率達(dá)到了58.9％。
參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖，圖5所示的是經(jīng)過(guò)休止細(xì)胞處理之后，GC-PFPD測(cè)定原油中的含硫化合物的分布情況，此時(shí)總硫含量為1,478ppm。經(jīng)處理前后含硫化合物的比較，可以明顯看出經(jīng)過(guò)休止細(xì)胞處理之后，原油中的大部分可檢測(cè)到的含硫化合物，如噻吩類(lèi)，二苯并噻吩類(lèi)及更加復(fù)雜的含硫化合物都基本脫除，起到了很好的脫硫效果。
根據(jù)文獻(xiàn)和專(zhuān)利檢索，雖然Setti等人1992年報(bào)道采用一株能降解烷烴的假單胞菌降解重油中的硫化合物，但是脫硫的過(guò)程造成了烷烴的損失。Fedorak等人在1984年采用混合菌處理原油，也造成了烷烴的損失。對(duì)生物脫硫模式菌株紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)ATCC 53968也進(jìn)行了原油脫硫的試驗(yàn)，但是發(fā)現(xiàn)處理前后對(duì)原油總硫含量沒(méi)有明顯的變化，即沒(méi)有明顯的脫硫效果。
本發(fā)明的古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142是一個(gè)耐溫的專(zhuān)一性降解含硫化合物的菌，不損失燃燒值。處理原油結(jié)果發(fā)現(xiàn)在較高溫度下有明顯的脫硫效果，因此，本菌株具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。


本發(fā)明提供的一株兼性嗜熱古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)，于2005年12月5日保藏于中國(guó)典型微生物菌種保藏中心，保藏地址湖北省武漢市武漢大學(xué)，郵政編碼430072，其保藏編號(hào)為CCTCC NO.M 205142。
圖1使用氣相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析模式化合物DBT的結(jié)構(gòu)。
圖2使用氣相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)CCTCCNO.M 205142降解模式化合物DBT中間產(chǎn)物二苯并噻吩結(jié)構(gòu)。
圖3使用氣相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)CCTCCNO.M 205142降解模式化合物DBT中間產(chǎn)物2-羥基聯(lián)苯結(jié)構(gòu)。
圖4使用氣相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)CCTCCNO.M 205142降解模式化合物DBT終產(chǎn)物2-甲氧基聯(lián)苯。
圖5使用GC-PFPD檢測(cè)休止細(xì)胞處理原油前后，原油中的含硫化合物的變化。
其中空白是古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142處理原油之前的原油含硫化合物的色譜圖，樣品是古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142處理之后的原油含硫化合物的色譜圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142菌株的篩選從齊魯石化，濟(jì)南煉油廠，勝利油田等地附近石油污染處采取土樣及含油廢水，按照土樣3～5g，水樣10％比例，加入到含0.5mmol/L二苯并噻吩的50ml MAM液體培養(yǎng)基中，在45℃培養(yǎng)2～3天，轉(zhuǎn)接4～5次，在254nm紫外線下照射，觀測(cè)菌種產(chǎn)生熒光的情況，同時(shí)用Gibbs試劑及GC，HPLC方法確認(rèn)有無(wú)終產(chǎn)物2-HBP的產(chǎn)生。5次轉(zhuǎn)接后，進(jìn)行Gibbs試劑反應(yīng)，選取陽(yáng)性結(jié)果。使用生理鹽水稀釋涂布于MAMD固體平板。通過(guò)反復(fù)劃線和培養(yǎng)，終于獲得一株在45℃具有脫硫活力的細(xì)菌，經(jīng)過(guò)常規(guī)活力測(cè)定表明該菌株具有非常高的穩(wěn)定性，連續(xù)培養(yǎng)后降解二苯并噻吩的能力沒(méi)有降低。
該菌株為輕微彎曲桿菌，大小為0.3～0.5×2.0～3.0μm。該菌株好氧，不運(yùn)動(dòng)，無(wú)孢子，過(guò)氧化物酶陽(yáng)性，氧化酶陰性，硝酸鹽還原陽(yáng)性，酸染色不著色，革蘭氏染色陽(yáng)性。菌株細(xì)胞壁含有谷氨酸，丙氨酸，消旋二氨基庚二酸。主要的細(xì)胞壁糖成分為阿拉伯糖，半乳糖。該菌株可以在麥康凱培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，不產(chǎn)生結(jié)晶紫，能抗5％的NaCl。能夠利用阿拉伯糖，葡萄糖，果糖，半乳糖，甘露糖，纖維糖，甘露醇，鼠李糖，木糖，棉子糖等為唯一碳源生長(zhǎng)，部分利用檸檬酸，乳糖。
該菌株鑒定為古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)，定名為Mycobacterium goodiiX7B，已于2005年12月5日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO.M 205142。
上述菌株培養(yǎng)使用液體MAM培養(yǎng)基(modification of A Medium)，配方為葡萄糖10g/L；0.5g/L KH2PO4；4g/L升K2HPO4；1g/L NH4Cl；質(zhì)量百分比濃度為1％的CaCl22ml/L；質(zhì)量百分比濃度為10％的MgCl2·6H2O 2ml/L；質(zhì)量百分比濃度為1％的FeCl3200μl/L；質(zhì)量百分比濃度為5％的NaCl 200μl/L；質(zhì)量百分比濃度為1％的酵母浸膏5ml/L；維生素混合液200μl/L；金屬離子混合液5ml/L，115℃濕熱滅菌20分鐘。
上述固體斜面基本無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基為上述液體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基成分添加質(zhì)量體積百分比濃度為1.6％的瓊脂粉。
上述的金屬離子混合液的配方為，每升蒸餾水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O 0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl120mmol。
上述的維生素混合液的配方為，每升蒸餾水含有400mg泛酸鈣(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/煙酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg對(duì)氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
實(shí)施例2上述古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142菌株16SrDNA基因的提取取生長(zhǎng)到穩(wěn)定期的古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142的菌體10ml，5,000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘收集菌體，去上清加入250μl溶液I(質(zhì)量百分比濃度25％蔗糖/50mmol/L Tris-HCl，pH8.0/50mmol/L EDTA)，再加入500μg/ml的溶菌酶，37℃水浴振蕩過(guò)夜；加入250μl溶液II(100mmol/L Tris-HCl，pH8.0質(zhì)量百分比濃度0.1％SDS)加入終濃度為0.4mg/ml的蛋白酶K(Merck，USA)，55℃水浴振蕩4小時(shí)；加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻，12,000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，將上清轉(zhuǎn)入一支新管中；加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，12,000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)入一個(gè)新管中；加入2倍體積的預(yù)冷的無(wú)水乙醇沉淀DNA 1小時(shí)，12,000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上清，用70％乙醇洗滌；12,000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上清，室溫干燥10分鐘，加入100μl TE緩沖液〖10mmol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)、1mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)、用鹽酸調(diào)整pH為8.0〗。以提取的基因組DNA為模板，利用真細(xì)菌引物27f和1492r，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在50μl反應(yīng)體系依次混勻下列試劑38μlH2O，5μl 10倍濃度的PCR反應(yīng)緩沖液，10倍濃度的PCR反應(yīng)緩沖液配方如下500mmol/L的KCl、30mmol/L的二硫蘇糖醇(DTT)、100mmol/L的用鹽酸調(diào)整pH為8.8的Tris緩沖液、1mg/ml的牛血清白蛋白，4μl 25mmol/L MgCl2，1μl 4種dNTP的混合物，0.5μl上游引物，0.5μl下游引物，0.5μl模板DNA即上述古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142的基因組DNA，0.5μl Taq DNA聚合酶，混勻后離心5秒鐘。加入50μl礦物油再離心5秒鐘；將混合物在94℃加熱5分鐘。94℃變性1分鐘，50℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘，總共30個(gè)循環(huán)。最后一個(gè)循環(huán)后，于72℃下保溫10分鐘，使反應(yīng)混合物擴(kuò)增充分，得到古地分枝桿菌(Mycobacteriumgoodii)CCTCC NO.M 205142的16S rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將產(chǎn)物測(cè)序。
測(cè)序結(jié)果古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142的16SrDNA基因序列長(zhǎng)度為1,384bp，核苷酸序列如下acatgcaagt cgaacggaaa ggcccttcgg ggtgctcgag tggcgaacgg gtgagtaaca 60cgtgggtgat ctgccctgca ctttgggata agcctgggaa actgggtcta ataccgaata 120taccctgctg gtcgcatggc ctggtggggg aaagcttttg cggtgtggga tgggcccgcg 180gcctatcagc ttgttggtgg ggtgatggcc taccaaggcg acgacgggta gccggcctga 240gagggtgacc ggccacactg ggactgagat acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt 300
ggggaatatt gcacaatggg cgcaagcctg atgcagcgac gccgcgtgag ggatgacggc 360cttcgggttg taaacctctt tcagcacaga cgaagcgtaa gtgacggtat gtgcagaaga 420aggaccggcc aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt agggtccgag cgttgtccgg 480aattactggg cgtaaagagc tcgtaggtgg tttgtcgcgt tgttcgtgaa aactcacagc 540ttaactgtgg gcgtgcgggc gatacgggca gactagagta ctgcagggga gactggaatt 600cctggtgtag cggtggaatg cgcagatatc aggaggaaca ccggtggcga aggcgggtct 660ctgggcagta actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct 720ggtagtccac gccgtaaacg gtgggtacta ggtgtgggtt tccttccttg ggatccgtgc 780cgtagctaac gcattaagta ccccgcctgg ggagtacggc cgcaaggcta aaactcaaag 840gaattgacgg gggcccgcac aagcggcgga gcatgtggat taattcgatg caacgcgaag 900aaccttacct gggtttgaca tgcacaggac gcccgtagag atatgggttc ccttgtggcc 960tgtgtgcagg tggtgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc 1020gcaacgagcg caacccttgt ctcatgttgc cagcacgtga tggtggggac tcgtgagaga 1080ctgccggggt caactcggag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcatcatgc cccttatgtc 1140cagggcttca cacatgctac aatggccggt acaaagggct gcgatgccgt gaggtggagc 1200gaatcctttc aaagccggtc tcagttcgga tcggggtctg caactcgacc ccgtgaagtc 1260ggagtcgcta gtaatcgcag atcagcaacg ctgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac 1320acaccgcccg tcacgtcatg aaagtcggta acacccgaag ccggtggcct aaccccttgt 1380ggga 1384實(shí)施例3利用古地分枝桿菌休止細(xì)胞脫除原油中有機(jī)硫的方法，其中加入的原油與水相的體積比為1∶10，處理溫度為30℃(1)菌種選擇選用古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142；(2)斜面培養(yǎng)將菌種接種于含有質(zhì)量體積比為1.6％的瓊脂并加有0.5mmol/L的二甲基亞砜(DMSO)的固體斜面MAM培養(yǎng)基上，25℃條件下，靜止培養(yǎng)60小時(shí)；(3)種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接1～2環(huán)于100ml含有0.5mmol/L的二甲基亞砜(DMSO)的液體MAM培養(yǎng)基中，25℃條件下，振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，制得種子液；(4)擴(kuò)大培養(yǎng)以10％的體積比的接種量，將種子液接種于1000ml含有0.5mmol/L的二甲基亞砜(DMSO)液體MAM培養(yǎng)基中，25℃條件下，振蕩培養(yǎng)24小時(shí)；(5)生物催化劑制備取步驟(4)所得的培養(yǎng)液5,000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集沉淀細(xì)胞，使用100mmol/L，pH7.0磷酸緩沖液重懸細(xì)胞，再以相同的條件離心，重復(fù)2～3次，收集沉淀細(xì)胞，并重懸于此磷酸緩沖液中，使菌體濃度達(dá)到18克干細(xì)胞/升，即為制備好的古地分枝桿菌休止細(xì)胞懸濁液，即生物催化劑；(6)處理樣品在反應(yīng)體系中(300ml)，以步驟(5)所得的休止細(xì)胞懸濁液作為水相，加入原油，使原油與水相的體積比為1∶10，在30℃條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩72小時(shí)，進(jìn)行樣品處理；(7)分離樣品以10,000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘分離步驟(6)中處理后的樣品，得到上層原油樣品；
(8)樣品檢測(cè)取5μl步驟(7)中的原油樣品，使用硫氮元素分析儀測(cè)定原油中殘留的硫含量，然后對(duì)照未處理的樣品硫含量，得出經(jīng)古地分枝桿菌(Mycobacteriumgoodii)CCTCC NO.M 205142處理的原油脫除率為40.5％。
在上述利用古地分枝桿菌休止細(xì)胞高溫脫除原油中有機(jī)硫的方法中，菌株培養(yǎng)使用液體MAM培養(yǎng)基(modification of A Medium MAM)，配方為葡萄糖10g/L；0.5g/KH2PO4；4g/L升K2HPO4；1g/L NH4Cl；質(zhì)量百分比濃度為1％的CaCl22ml/L；質(zhì)量百分比濃度為10％的MgCl2·6H2O 2ml/L；質(zhì)量百分比濃度為1％的FeCl3200μl/L；質(zhì)量百分比濃度為5％的NaCl 200μl/L；質(zhì)量百分比濃度為1％的酵母浸膏5ml/L；維生素混合液200μl/L；金屬離子混合液5ml/L，115℃濕熱滅菌20分鐘。
上述固體斜面基本無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基為上述液體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基成分添加質(zhì)量體積百分比濃度為1.6％的瓊脂粉。
上述的離子混合液的配方為，每升蒸餾水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol。
上述的維生素混合液的配方為，每升蒸餾水含有400mg泛酸鈣(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/煙酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg對(duì)氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
實(shí)施例4利用古地分枝桿菌休止細(xì)胞脫除原油中有機(jī)硫的方法，其中加入的原油與水相的體積比為1∶20，處理溫度為40℃(1)菌種選擇選用古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142；(2)斜面培養(yǎng)將菌種接種于含有質(zhì)量體積比為1.6％的瓊脂并加有1.0mmol/L的二甲基亞砜(DMSO)的固體斜面MAM培養(yǎng)基上，45℃條件下，靜止培養(yǎng)48小時(shí)；(3)種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接1～2環(huán)于100ml含有1.0mmol/L的二甲基亞砜(DMSO)的液體MAM培養(yǎng)基中，45℃條件下，振蕩培養(yǎng)16小時(shí)，制得種子液；(4)擴(kuò)大培養(yǎng)以9％的體積比的接種量，將種子液接種于1000ml含有1.0mmol/L的二甲基亞砜(DMSO)液體MAM培養(yǎng)基中，45℃條件下，振蕩培養(yǎng)16小時(shí)；(5)生物催化劑制備取步驟(4)所得的培養(yǎng)液5,000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集沉淀細(xì)胞，使用100mmol/L，pH7.0磷酸緩沖液重懸細(xì)胞，再以相同的條件離心，重復(fù)2～3次，收集沉淀細(xì)胞，并重懸于此磷酸緩沖液中，使菌體濃度達(dá)到12克干細(xì)胞/升，即為制備好的古地分枝桿菌休止細(xì)胞懸濁液，即生物催化劑；(6)處理樣品在反應(yīng)體系中(800ml)，以步驟(5)所得的休止細(xì)胞懸濁液作為水相，加入原油，使原油與水相的體積比為1∶20，在40℃條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩72小時(shí)，進(jìn)行樣品處理；(7)分離樣品以10,000轉(zhuǎn)/分鐘離心8分鐘分離步驟(6)中處理后的樣品，得到上層原油樣品；(8)樣品檢測(cè)取3μl步驟(7)中的原油樣品，使用硫氮元素分析儀測(cè)定原油中殘留的硫含量，然后對(duì)照未處理的樣品硫含量，得出經(jīng)古地分枝桿菌(Mycobacteriumgoodii)CCTCC NO.M 205142處理的原油脫除率為58.9％。
在上述利用古地分枝桿菌休止細(xì)胞高溫脫除原油中有機(jī)硫的方法中，菌株培養(yǎng)使用液體MAM培養(yǎng)基(modification of A Medium MAM)，配方為葡萄糖10g/L；0.5g/L KH2PO4；4g/L升K2HPO4；1g/L NH4Cl；質(zhì)量百分比濃度為1％的CaCl22ml/L；質(zhì)量百分比濃度為10％的MgCl2·6H2O 2ml/L；質(zhì)量百分比濃度為1％的FeCl3200μl/L；質(zhì)量百分比濃度為5％的NaCl 200μl/L；質(zhì)量百分比濃度為1％的酵母浸膏5ml/L；維生素混合液200μl/L；金屬離子混合液5ml/L，115℃濕熱滅菌20分鐘。
上述固體斜面基本無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基為上述液體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基成分添加質(zhì)量體積百分比濃度為1.6％的瓊脂粉。
上述的離子混合液的配方為，每升蒸餾水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol。
上述的維生素混合液的配方為，每升蒸餾水含有400mg泛酸鈣(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/煙酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg對(duì)氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
實(shí)施例5利用古地分枝桿菌休止細(xì)胞脫除原油中有機(jī)硫的方法，其中加入的原油與水相的體積比為1∶15，處理溫度為45℃(1)菌種選擇選用古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142；(2)斜面培養(yǎng)將菌種接種于含有質(zhì)量體積比為1.6％的瓊脂并加有2.0mmol/L的二甲基亞砜(DMSO)的固體斜面MAM培養(yǎng)基上，50℃條件下，靜止培養(yǎng)36小時(shí)；(3)種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接1～2環(huán)于100ml含有2.0mmol/L的二甲基亞砜(DMSO)的液體MAM培養(yǎng)基中，50℃條件下，振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，制得種子液；(4)擴(kuò)大培養(yǎng)以7％的體積比的接種量，將種子液接種于1000ml含有2.0mmol/L的二甲基亞砜(DMSO)液體MAM培養(yǎng)基中，50℃條件下，振蕩培養(yǎng)12小時(shí)；(5)生物催化劑制備取步驟(4)所得的培養(yǎng)液5,000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集沉淀細(xì)胞，使用100mmol/L，pH7.0磷酸緩沖液重懸細(xì)胞，再以相同的條件離心，重復(fù)2～3次，收集沉淀細(xì)胞，并重懸于此磷酸緩沖液中，使菌體濃度達(dá)到9克干細(xì)胞/升，即為制備好的古地分枝桿菌休止細(xì)胞懸濁液，即生物催化劑；(6)處理樣品在反應(yīng)體系中(600ml)，以步驟(5)所得的休止細(xì)胞懸濁液作為水相，加入原油，使原油與水相的體積比為1∶15，在45℃條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩60小時(shí)，進(jìn)行樣品處理；(7)分離樣品以10,000轉(zhuǎn)/分鐘離心7分鐘分離步驟(6)中處理后的樣品，得到上層原油樣品；(8)樣品檢測(cè)取4μl步驟(7)中的原油樣品，使用硫氮元素分析儀測(cè)定原油中殘留的硫含量，然后對(duì)照未處理的樣品硫含量，得出經(jīng)古地分枝桿菌(Mycobacteriumgoodii)CCTCC NO.M 205142處理的原油脫除率為32.6％。
在上述利用古地分枝桿菌休止細(xì)胞高溫脫除原油中有機(jī)硫的方法中，菌株培養(yǎng)使用液體MAM培養(yǎng)基(modification of A Medium MAM)，配方為葡萄糖10g/L；0.5g/L KH2PO4；4g/L升K2HPO4；1g/L NH4Cl；質(zhì)量百分比濃度為1％的CaCl22ml/L；質(zhì)量百分比濃度為10％的MgCl2·6H2O 2ml/L；質(zhì)量百分比濃度為1％的FeCl3200μl/L；質(zhì)量百分比濃度為5％的NaCl 200μl/L；質(zhì)量百分比濃度為1％的酵母浸膏5ml/L；維生素混合液200μl/L；金屬離子混合液5ml/L，115℃滅菌20分鐘。
上述固體斜面基本無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基為上述液體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基成分添加質(zhì)量體積百分比濃度為1.6％的瓊脂粉。
上述的離子混合液的配方為，每升蒸餾水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol。
上述的維生素混合液的配方為，每升蒸餾水含有400mg泛酸鈣(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/煙酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg對(duì)氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
實(shí)施例6利用紅平紅球菌ATCC 53968休止細(xì)胞脫除原油中有機(jī)硫的方法，其中加入的原油與水相的體積比為1∶20，處理溫度為40℃；(1)菌種選擇紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)ATCC 53968〖該菌株保藏于美國(guó)典型微生物收藏中心(12301 Park Lawn Drive，Rockville，Md.20852)〗；(2)斜面培養(yǎng)將菌種接種于含有質(zhì)量體積比為1.6％的瓊脂并加有1.0mmol/L二甲基亞砜(DMSO)的固體斜面無(wú)機(jī)鹽基本培養(yǎng)基上，30℃條件下，靜止培養(yǎng)42小時(shí)；(3)種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于100ml含有1.0mmol/L二甲基亞砜(DMSO)的液體無(wú)機(jī)鹽基本培養(yǎng)基中，30℃條件下，振蕩培養(yǎng)42小時(shí)，制得種子液；(4)擴(kuò)大培養(yǎng)以10％的體積比的接種量，將種子液接種于100ml含有1.0mmol/L二甲基亞砜(DMSO)液體無(wú)機(jī)鹽基本培養(yǎng)基中30℃條件下，振蕩培養(yǎng)36小時(shí)；(5)生物催化劑的制備取步驟(4)所得的培養(yǎng)液5,000轉(zhuǎn)每分鐘離心15分鐘，收集沉淀細(xì)胞，使用100mmol/L，pH7.0磷酸緩沖液重懸細(xì)胞，再以相同的條件離心，重復(fù)2次，收集沉淀細(xì)胞，并重懸于pH7.0磷酸緩沖液，使菌體濃度達(dá)到18克干細(xì)胞/升。此細(xì)胞懸濁液即為制備好的紅平紅球菌休止細(xì)胞，也稱(chēng)生物催化劑；(6)處理樣品在300ml的反應(yīng)體系中，以步驟(5)所得的休止細(xì)胞懸濁液作為水相，加入原油，使原油與水相的體積比為1∶20，在40℃條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩72小時(shí)，進(jìn)行樣品處理；(7)分離樣品以10,000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘分離步驟(6)中處理后的樣品，得到上層原油樣品；(8)樣品檢測(cè)取3μl步驟(7)中的原油樣品，使用Antek7000硫氮元素分析儀(美國(guó)，Antek公司產(chǎn)品)測(cè)定原油中殘留的硫含量。對(duì)照未處理的樣品硫含量，得出原油脫除率為8.5％。
在上述利用紅平紅球菌休止細(xì)胞脫除原油中有機(jī)硫的方法中，菌株培養(yǎng)使用液體基本無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(Basal Salts Medium，BSM)，配方為甘油4g/L，KH2PO42.44g/L，Na2HPO414.04g/L，NH4Cl 2g/，質(zhì)量百分比為1％的CaCl2100μl/L，質(zhì)量百分比為10％的MgCl2·6H2O 2ml/L，質(zhì)量百分比為1％的FeCl3100μl/L，維生素混合液200ml/L，離子混合液5ml/L。121℃濕熱滅菌20分鐘。
上述固體基本無(wú)機(jī)鹽斜面培養(yǎng)基為上述液體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基成分添加質(zhì)量體積百分比1.6％的瓊脂粉。
上述的離子混合液的配方為，每升蒸餾水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol。
上面所述的維生素混合物的配方為，每升蒸餾水含有400mg泛酸鈣(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/煙酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg對(duì)氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
通過(guò)實(shí)施4與實(shí)施例6的對(duì)比可以看到，古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142在40℃、油水比為1∶20條件下，對(duì)原油的總硫含量達(dá)到58.9％的脫除率；脫硫率明顯高于紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)ATCC 53968。說(shuō)明上述的古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142在較高溫度下具有很好的處理效果，具有很高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
序列表SEQ ID NO.1<110>山東大學(xué)<120>一株應(yīng)用于原油脫硫的兼性嗜熱古地分枝桿菌<141>2006-03-07<211>1384<212>DNA<213>古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)<221>古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M205142 16S rDNA<222>(1)…(1384)<400>
acatgcaagt cgaacggaaa ggcccttcgg ggtgctcgag tggcgaacgg gtgagtaaca 60cgtgggtgat ctgccctgca ctttgggata agcctgggaa actgggtcta ataccgaata 120taccctgctg gtcgcatggc ctggtggggg aaagcttttg cggtgtggga tgggcccgcg 180gcctatcagc ttgttggtgg ggtgatggcc taccaaggcg acgacgggta gccggcctga 240gagggtgacc ggccacactg ggactgagat acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt 300ggggaatatt gcacaatggg cgcaagcctg atgcagcgac gccgcgtgag ggatgacggc 360cttcgggttg taaacctctt tcagcacaga cgaagcgtaa gtgacggtat gtgcagaaga 420aggaccggcc aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt agggtccgag cgttgtccgg 480aattactggg cgtaaagagc tcgtaggtgg tttgtcgcgt tgttcgtgaa aactcacagc 540ttaactgtgg gcgtgcgggc gatacgggca gactagagta ctgcagggga gactggaatt 600cctggtgtag cggtggaatg cgcagatatc aggaggaaca ccggtggcga aggcgggtct 660ctgggcagta actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct 720ggtagtccac gccgtaaacg gtgggtacta ggtgtgggtt tccttccttg ggatccgtgc 780cgtagctaac gcattaagta ccccgcctgg ggagtacggc cgcaaggcta aaactcaaag 840gaattgacgg gggcccgcac aagcggcgga gcatgtggat taattcgatg caacgcgaag 900aaccttacct gggtttgaca tgcacaggac gcccgtagag atatgggttc ccttgtggcc 960tgtgtgcagg tggtgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc 1020gcaacgagcg caacccttgt ctcatgttgc cagcacgtga tggtggggac tcgtgagaga 1080ctgccggggt caactcggag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcatcatgc cccttatgtc 1140cagggcttca cacatgctac aatggccggt acaaagggct gcgatgccgt gaggtggagc 1200gaatcctttc aaagccggtc tcagttcgga tcggggtctg caactcgacc ccgtgaagtc 1260ggagtcgcta gtaatcgcag atcagcaacg ctgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac 1320acaccgcccg tcacgtcatg aaagtcggta acacccgaag ccggtggcct aaccccttgt 1380ggga 138權(quán)利要求
1.一株應(yīng)用于原油脫硫的兼性嗜熱古地分枝桿菌，其特征在于該菌名為古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)，已于2005年12月5日保藏于中國(guó)典型微生物菌種保藏中心，其保藏編號(hào)為CCTCC NO.M 205142。
2.如權(quán)利要求1所述的兼性嗜熱古地分枝桿菌，其特征是所述兼性嗜熱古地分枝桿菌為彎曲桿狀菌，大小為0.3～0.5×2.0～3.0μm，生長(zhǎng)初期菌落為乳白色，漸變?yōu)辄S色，菌株好氧，不運(yùn)動(dòng)，無(wú)孢子，過(guò)氧化物酶陽(yáng)性，氧化酶陰性，硝酸鹽還原陽(yáng)性，酸染色不著色，革蘭氏染色陽(yáng)性；菌株細(xì)胞壁含有谷氨酸，丙氨酸，消旋二氨基庚二酸；主要的細(xì)胞壁糖成分為阿拉伯糖，半乳糖；所述兼性嗜熱古地分枝桿菌的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。
3.如權(quán)利要求1或2中所述的兼性嗜熱古地分枝桿菌，其特征在于所述的兼性嗜熱古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142可在30～50℃下專(zhuān)-性脫除二苯并噻吩、二苯并噻吩衍生物中的硫，不破壞碳架，保留了燃燒值。
4.如權(quán)利要求3所述的兼性嗜熱古地分枝桿菌，其特征在于，所述的二苯并噻吩衍生物為4，6-二甲基-二苯并噻吩、DBT-砜、4-甲基-二苯并噻吩之一。
5.權(quán)利要求1或2所述的兼性嗜熱古地分枝桿菌在原油脫硫中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的兼性嗜熱古地分枝桿菌在原油脫硫中的應(yīng)用，其脫硫方法涉及的步驟順序如下(1)菌種選擇選用兼性嗜熱古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142；(2)斜面培養(yǎng)將菌種接種于含有質(zhì)量體積比為1.5～2.0％的瓊脂并加有0.5～2.0mmol/L的二甲基亞砜(DMSO)的固體斜面MAM培養(yǎng)基上，25～50℃條件下，靜止培養(yǎng)36～60小時(shí)；(3)種子培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)的菌株，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接1～2環(huán)于100ml含有0.5～2.0mmol/L的二甲基亞砜(DMSO)的液體MAM培養(yǎng)基中，25～50℃條件下，振蕩培養(yǎng)12～24小時(shí)，制得種子液；(4)擴(kuò)大培養(yǎng)以5～10％的體積比的接種量，將種子液接種于1000ml含有0.5～2.0mmol/L的二甲基亞砜(DMSO)液體MAM培養(yǎng)基中，25～50℃條件下，振蕩培養(yǎng)12～24小時(shí)；(5)生物催化劑制備取步驟(4)所得的培養(yǎng)液4,000～5,000轉(zhuǎn)/分鐘離心10～20分鐘，收集沉淀細(xì)胞，使用100mmol/L，pH 7.0磷酸緩沖液重懸細(xì)胞，再以相同的條件離心，重復(fù)2～3次，收集沉淀細(xì)胞，并重懸于此磷酸緩沖液中，使菌體濃度達(dá)到9～18克干細(xì)胞/升，即為制備好的古地分枝桿菌休止細(xì)胞懸濁液，也稱(chēng)生物催化劑；(6)處理樣品在反應(yīng)體系中，以步驟(5)所得的休止細(xì)胞懸濁液作為水相，加入原油，使原油與水相的體積比為1∶10～20，在30～45℃條件下，180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩50～72小時(shí)，進(jìn)行樣品處理；(7)分離樣品以10,000轉(zhuǎn)/分鐘離心5～10分鐘分離步驟(6)中處理后的樣品，得到上層原油樣品；(8)樣品檢測(cè)取1～5μl步驟(7)中的原油樣品，使用硫氮元素分析儀測(cè)定原油中殘留的硫含量，然后對(duì)照未處理的樣品硫含量，得出經(jīng)所述兼性嗜熱古地分枝桿菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142處理原油的脫硫率。
7.如權(quán)利要求5所述的兼性嗜熱古地分枝桿菌在原油脫硫中的應(yīng)用，其特征在于，步驟(2)、(3)、(4)中所述的菌體培養(yǎng)溫度是40～50℃；二甲基亞砜(DMSO)的濃度為1.0～1.5mmol/L。
8.如權(quán)利要求5所述的兼性嗜熱古地分枝桿菌在原油脫硫中的應(yīng)用，其特征在于，步驟(3)、(4)中所述的菌體培養(yǎng)時(shí)間是16～18小時(shí)。
9.如權(quán)利要求5所述的兼性嗜熱古地分枝桿菌在原油脫硫中的應(yīng)用，其特征在于，步驟(5)中所述的生物催化劑的菌體濃度是12～18克干細(xì)胞/升。
10.如權(quán)利要求5所述的兼性嗜熱古地分枝桿菌在原油脫硫中的應(yīng)用，其特征在于，步驟(6)中所述的原油與水相的體積比例為1∶15～20，處理樣品的溫度為40～45℃，樣品振蕩時(shí)間為60～72小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一株應(yīng)用于原油脫硫的兼性嗜熱古地分枝桿菌，該菌株于2005年12月5日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)，中國(guó)武漢)，保藏中心編號(hào)為CCTCC NO.M 205142。該菌株為彎曲桿狀菌，好氧，不運(yùn)動(dòng)，無(wú)孢子，過(guò)氧化物酶陽(yáng)性，氧化酶陰性，硝酸鹽還原陽(yáng)性，酸染色不著色，革蘭氏染色陽(yáng)性；所述菌具有嗜熱、脫硫率高等特點(diǎn)，可以在30～45℃下脫除原油中的硫，40℃條件下，脫硫率達(dá)到58.9％。在石油煉制及大氣污染治理方面具有很大的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12S1/00GK1858204SQ20061004444
公開(kāi)日2006年11月8日 申請(qǐng)日期2006年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月10日
發(fā)明者許平, 李福利, 馬翠卿, 張正芝, 馮進(jìn)輝, 于波 申請(qǐng)人:山東大學(xué)