專利名稱：人血漿dna定量分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種DNA測量方法，特別涉及一種對血漿DNA水平的定量檢測分析方法。
背景技術(shù)：
人血漿DNA是指游離于細胞外的DNA(cell free DNA)，又稱循環(huán)DNA，始終處于一個較為恒定的水平，保持著一種平衡。只有當(dāng)人體患有各種疾病，如感染而引發(fā)的機體炎癥、外傷所致大面積組織損傷、組織器官的衰竭、自身免疫性疾病和腫瘤等由于大量的細胞出現(xiàn)死亡，此時核酸從細胞內(nèi)大量進入到外周循環(huán)的血液中，這種平衡才會被打破，導(dǎo)致人血漿DNA水平大幅度地升高，以及出現(xiàn)DNA質(zhì)量的異常。
因此，對血漿DNA的定量檢測及分析，可以用于上述各種類型疾病的診斷及嚴(yán)重程度評估，對一些特殊復(fù)雜性疾病(遺傳病及腫瘤等)進行分子診斷，跟蹤觀察治療效果，進行病情預(yù)后分析等。所以，血漿DNA的定量檢測及分析技術(shù)具有重要臨床潛在應(yīng)用價值。
在本發(fā)明之前，沒有準(zhǔn)確定量檢測血漿DNA的定量檢測分析技術(shù)。雖然以前有人采用過針對人基因組中的某一個看家基因進行實時熒光定量檢測分析，試圖對人血漿DNA水平進行定量，但總是難以做到；其原因在于，檢測過程的開始必須將用于血漿DNA定量檢測的模板(血漿DNA模板)提取并富集起來，這樣勢必導(dǎo)致對不同的樣本(同一實驗批次內(nèi)和不同批次的各個樣本)提取回收率存在差異，隨后所采用的高敏感性基因擴增技術(shù)對各個樣本的基因擴增效率又存在一定的差異，這樣可使檢測結(jié)果出現(xiàn)嚴(yán)重的偏差，因此單一針對血漿DNA的實時熒光定量檢測技術(shù)無法對人血漿DNA水平進行準(zhǔn)確定量，從而使得人血漿DNA的實時熒光定量基因擴增(實時熒光定量PCR)檢測技術(shù)長期以來難以用于臨床疾病的診斷、治療效果觀察及病情預(yù)后分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于克服上述缺陷，研究發(fā)展一種新的、可準(zhǔn)確應(yīng)用于臨床血漿DNA水平定量檢測的新分析方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是人血漿DNA定量分析方法，收集以EDTA-K2抗凝的人外周血血漿，其主要技術(shù)特征在于向所收集的血漿加入含人工合成DNA片段的線性克隆質(zhì)粒DNA內(nèi)參照物，對提取的血漿DNA模板以三引物兩種熒光標(biāo)記的雙Taqman探針的二重PCR技術(shù)，進行血漿DNA水平的實時熒光定量檢測分析，(1)將人工合成的序列克隆到pMD18T載體，制備含人工合成DNA片段的線性克隆質(zhì)粒DNA內(nèi)參照物，人工合成的序列為5’-ACGGGAGCGGTTGGTGGTGGAAATCGTGCGTGACATTAAGA-3’，41bp分子量12.93KD。
實時熒光定量PCR檢測所需的上游引物序列P 15’-AAACAGCTATGACCATGATTACGAA-3’，25bp分子量7.75KD。
下游引物序列P25’-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3’，22bp分子量6.73KD。
Taqman熒光探針1HEX 5’-CCACCAACCGCTCCCGTAATCTCTAG-3’TEMRA，26bp分子量7.88KD，5’端標(biāo)記HEX，3’端標(biāo)記TEMRA。
(2)人血漿DNA水平檢測的靶基因是人看家基因β-actin，其基因序列為5’-GGACCTGACTGACTACCTCATGAAGATCCTCACCGAGCGCGGCTACAGCTTCACCACCACGGCCGAGCGGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3’，91bp分子量28.07KD。
實時熒光定量PCR檢測所需的上游引物序列P35’-GGACCTGACTGACTACCTCATGAA-3’，24bp分子量7.4KD。
下游引物序列P25’-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3’，22bp分子量6.73KD。
Taqman熒光探針2FAM 5’-CACCGAGCGCGGCTACAGCTTC-3’TEMRA，22bp分子量6.76KD，5’端標(biāo)記FAM，3’端標(biāo)記TEMRA。
(3)線性克隆質(zhì)粒DNA內(nèi)參照物中所含人工合成DNA片段與被定量分析的人血漿DNA靶基因β-actin序列具有不同的序列，針對這兩個靶基因進行定量分析為兩種不同熒光標(biāo)記的Taqman熒光探針；同時，在設(shè)計人工合成DNA時，針對這兩個靶基因進行基因擴增時共用了同一個下游引物P2，使二重PCR基因擴增的條件與效率一致。
(4)將步驟(1)人工合成的外源性DNA插入載體pMD18T；從培養(yǎng)菌液中提取含插入片段的陽性質(zhì)粒，用限制性核酸內(nèi)切酶Hind II將陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品酶切為線性得到線性克隆質(zhì)粒DNA內(nèi)參照物；將酶切后的線性克隆質(zhì)粒DNA內(nèi)參照物5μl(5×103拷貝)投入到250μl人血漿中，對提取的血漿DNA模板采用兩重?zé)晒舛炕驍U增技術(shù)，在同一個基因擴增管中分別對兩個不同的靶基因，即人類基因組和外源性DNA基因組同時進行熒光定量擴增分析，從而準(zhǔn)確計算出人血漿中DNA的含量。
本發(fā)明的優(yōu)點和效果在于采用設(shè)計一個與人類基因組完全不同源的外源性DNA序列，并對該序列進行基因克隆，制備大量的具有相同序列的外源性DNA作為參考物質(zhì)，并將其加入到血漿中利用其具有與血漿DNA提取效率完全一致的特點，即在提取血漿游離DNA的同時，外源性DNA也被提取，利用已知靶質(zhì)和實際測定質(zhì)的外源性線性克隆質(zhì)粒DNA內(nèi)參照物，對血漿DNA定量并對檢測結(jié)果進行矯正，從而得到被測血漿DNA的準(zhǔn)確含量，這是本發(fā)明的創(chuàng)造性所在。
其意義在于，應(yīng)用本發(fā)明可以克服以往存在的各個樣本間DNA提取效率及核酸體外擴增效率不一致性的關(guān)鍵問題，從而能夠?qū)θ说难獫{DNA進行準(zhǔn)確定量檢測，確立人類血漿DNA水平正常值參考值范圍，用于發(fā)現(xiàn)患者血漿中DNA水平是否異常，對疾病進行診斷和治療效果的跟蹤觀察。
其意義還在于，由于血漿DNA水平能夠反映人體患有各種疾病如感染而引發(fā)的機體炎癥、外傷所致大面積組織損傷、組織器官的衰竭、自身免疫性疾病和腫瘤等而引起的變化，因此不僅可以通過本發(fā)明得知這種變化，而且能定量檢測這種變化，使得這種檢測方法具有實用性，即可以應(yīng)用于臨床?？梢栽u估各種類型的臨床常見疾病的嚴(yán)重程度，并進行病情預(yù)后分析等。
本技術(shù)中利用雙通道熒光定量PCR檢測儀器對兩個待測靶基因同時進行實時熒光定量檢測，所采用的是以不同熒光標(biāo)記的兩個分別針對內(nèi)參照基因和待測定的人血漿DNA基因的Taqman熒光探針，以共同的下游引物，即三個引物，對兩個目的基因進行實時熒光定量PCR檢測，使得在同一個基因擴增管中的兩個基因擴增反應(yīng)效率一致；同時，在最大程度上減少了引物二聚體形成的可能。
迄今為止尚未有用于血漿DNA定量臨床檢驗診斷的兩重?zé)晒舛縋CR檢測技術(shù)，更無本發(fā)明中所描述的含有內(nèi)參照的血漿DNA兩重?zé)晒舛縋CR的檢測技術(shù)。
具體實施例方式
1.外源性DNA制備將3’末端帶有A的寡核苷酸插入載體pMD18T，制備感受態(tài)細菌，將含目的片段得到的pMD18-T全量轉(zhuǎn)入200μl的感受態(tài)細菌中；經(jīng)藍白斑篩選、菌落PCR鑒定，陽性克隆提取含目的片段的質(zhì)粒DNA。
限制性核酸內(nèi)切酶Hind II將質(zhì)粒內(nèi)參照物酶切為線性酶切后，將線性克隆質(zhì)粒DNA內(nèi)參照物稀釋為1×103拷貝/μl。
2.血漿分離和保存用含EDTA-K2的5ml帶蓋無菌塑料抗凝離心管抽取人外周血液3ml，室溫放置4h內(nèi)以2000r/min離心20min，收集血漿；再次以3000r/min離心15min，獲得無血細胞成分的血漿，取0.5ml并向其中加入濃度為1×103拷貝/μl的線性克隆質(zhì)粒DNA內(nèi)參照物10μl，用0.5ml的Eppendorf離心管平均分裝成兩管，每管250μl，-70℃保存待用。
注收集抗凝靜脈血不可以使用玻璃離心管或試管。
3.血漿DNA模板的提取采用常規(guī)酚/氯仿、QIAamp DNA Blood Minikit或磁珠法DNA提取試劑提取。
對含有內(nèi)參照物的每份待測血漿標(biāo)本以上述任何一種同樣的方法進行DNA模板的提取，最后溶解于40μl TE緩沖液中放置于-20℃保存，在兩周內(nèi)檢測，如需要長期保存，應(yīng)放置在-70℃的冰箱中保存。
4.熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)熒光定量PCR檢測β-actin和投入的外源性DNA(內(nèi)參照物)(1)PCR體系組成

(2)擴增循環(huán)參數(shù)
第一步95℃ 5min；第二步94℃30s，57℃60s，40個循環(huán)；第三步72℃ 3min。
(3)采用PE7000或PE7700、Mx 3005P、Light Cycler 2.0等具有兩重?zé)晒夥治龉δ艿亩縋CR儀(雙通道以上熒光定量PCR儀器)。進行兩重?zé)晒舛縋CR檢測。
(4)利用公式計算人血漿DNA的準(zhǔn)確含量。
log人拷貝數(shù)/log內(nèi)拷貝數(shù)＝Ct內(nèi)/Ct人log人拷貝數(shù)＝Ct內(nèi)/Ct人log內(nèi)拷貝數(shù) 注公式中4為用于血漿DNA含量檢測的人血漿為250μ1(即1/4ml)，6×10-6指每分子人類基因組的質(zhì)量(μg)，8指每一反應(yīng)中只加入5μl血漿DNA模板(血漿DNA模板提取后總量為40μl，即其中的1/8)，5×103為投入的內(nèi)參照物的濃度；“人”表示人血漿DNA；“內(nèi)”表示內(nèi)參照物；Ct值指熒光定量擴增檢測域值循環(huán)周期數(shù)(即threshold cycle)。所投入線性克隆質(zhì)粒DNA內(nèi)參照物(5×103拷貝)與被測定的人基因組DNA的量，在本檢測技術(shù)的線性范圍內(nèi)，并且與健康人預(yù)計的基因拷貝數(shù)接近或稍低，這樣減少了所投入的外源性靶模板DNA的基因擴增的競爭效應(yīng)。
以本發(fā)明定量檢測人血漿DNA，針對不同年齡段、不同性別、不同地區(qū)、不同人種等，可以建立健康人血漿DNA的正常水平數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)，即人血漿DNA正常參考值范圍。利用本技術(shù)所建立的人血漿DNA水平定量這一臨床檢驗診斷項目，可以在體檢時用于評判身體是否出現(xiàn)異?，F(xiàn)象；同時，還可以用于診斷和評估各種類型的臨床常見疾病的嚴(yán)重程度，從而提高對臨床疾病診斷、治療療效觀察及病情預(yù)后分析的效果。
權(quán)利要求
1.人血漿DNA定量分析方法，收集以EDTA-K2抗凝的人外周血血漿，其特征在于向所收集的血漿加入含人工合成DNA片段的線性克隆質(zhì)粒DNA內(nèi)參照物，對提取的血漿DNA模板以三引物兩種熒光標(biāo)記的雙Taqman探針的二重PCR技術(shù)，進行血漿DNA水平的實時熒光定量檢測分析，(1)將人工合成的序列克隆到pMD18T載體，制備含人工合成DNA片段的線性克隆質(zhì)粒DNA內(nèi)參照物，人工合成的序列為5’-ACGGGAGCGGTTGGTGGTGGAAATCGTGCGTGACATTAAGA-3’，41bp分子量12.93KD。實時熒光定量PCR檢測所需的上游引物序列P15’-AAACAGCTATGACCATGATTACGAA-3’，25bp分子量7.75KD。下游引物序列P25’-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3’，22bp分子量6.73KD。Taqman熒光探針1HEX 5’-CCACCAACCGCTCCCGTAATCTCTAG-3’TEMRA，26bp分子量7.88KD，5’端標(biāo)記HEX，3’端標(biāo)記TEMRA。(2)人血漿DNA水平檢測的靶基因是人看家基因β-actin，其基因序列為5’-GGACCTGACTGACTACCTCATGAAGATCCTCACCGAGCGCGGCTACAGCTTCACCACCACGGCCGAGCGGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3’，91bp分子量28.07KD。實時熒光定量PCR檢測所需的上游引物序列P35’-GGACCTGACTGACTACCTCATGAA-3’，24bp分子量7.4KD。下游引物序列P25’-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3’，22bp分子量6.73KD。Taqman熒光探針2FAM 5’-CACCGAGCGCGGCTACAGCTTC-3’TEMRA，22bp分子量6.76KD，5’端標(biāo)記FAM，3’端標(biāo)記TEMRA。(3)線性克隆質(zhì)粒DNA內(nèi)參照物中所含人工合成DNA片段與被定量分析的人血漿DNA靶基因β-actin序列具有不同的序列，針對這兩個靶基因進行定量分析為兩種不同熒光標(biāo)記的Taqman熒光探針；同時，在設(shè)計人工合成DNA時，針對這兩個靶基因進行基因擴增時共用了同一個下游引物P2，使二重PCR基因擴增的條件與效率一致。(4)將步驟(1)人工合成的外源性DNA插入載體pMD18T；從培養(yǎng)菌液中提取含插入片段的陽性質(zhì)粒，用核酸限制性內(nèi)切酶Hind II將陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品酶切為線性得到線性克隆質(zhì)粒DNA內(nèi)參照物；將酶切后的線性克隆質(zhì)粒DNA內(nèi)參照物5μl(5×103拷貝)投入到250μl人血漿中，對提取的血漿DNA模板采用兩重?zé)晒舛炕驍U增技術(shù)，在同一個基因擴增管中分別對兩個不同的靶基因，即人類基因組和外源性DNA基因組同時進行熒光定量擴增分析，從而準(zhǔn)確計算出人血漿中DNA的含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種對人血漿DNA水平的定量檢測分析方法。選擇與人類血漿DNA具有相同或相似提取效率的人工合成外源性DNA系列，且二者不同源，選擇看家基因beta actin為測定基因，將人工合成外源性DNA插入載體pMD18T并放入細菌中培養(yǎng)，進行藍白斑篩選、菌落PCR鑒定，再酶切成線性，投入到血漿中，采用兩重?zé)晒舛炕驍U增，熒光基團分別為FAM、HEX，提取已知外源性陽性質(zhì)?；厥招剩糜嬎愎接嬎愕弥獫{DNA的量。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中不能臨床應(yīng)用的缺陷，可建立人類基因的正常水平數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)包括異常值參考范圍，便于發(fā)現(xiàn)身體出現(xiàn)異常現(xiàn)象，評估各種類型的臨床常見疾病的嚴(yán)重程度，從而加強對臨床疾病的診斷、治療，跟蹤觀察治療效果，進行病情預(yù)后分析等。
文檔編號C12Q1/68GK1811387SQ20061003802
公開日2006年8月2日 申請日期2006年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月25日
發(fā)明者潘世揚, 黃珮珺, 張寄南, 童明慶, 魏源華 申請人:潘世揚