專利名稱：一種篩查唐氏綜合征高危胎兒的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種篩查唐氏綜合征高危胎兒的方法。
背景技術：
唐氏綜合征(D.S，又稱21-三體綜合征，先天愚型)是引起嚴重智力低下的最常見的先天性染色體數(shù)目異常性疾病，發(fā)生率約1/800；35歲以上高齡孕婦發(fā)生率更高。D.S.患者的21號染色體為2條，較正常人多出1條，即其“原始拷貝數(shù)”是正常人的1.5倍。對此病至今無有效治療方法，給家庭和社會造成極大負擔。產(chǎn)前篩查和基因診斷是避免此類病兒出生的有效手段。我國衛(wèi)生部制定的《產(chǎn)前診斷技術管理辦法》和北京市衛(wèi)生局制定的《產(chǎn)前診斷技術管理辦法》實施細則均規(guī)定了必須對唐氏綜合征等進行產(chǎn)前篩查及相應的技術規(guī)范?，F(xiàn)行唐氏綜合征高危胎兒篩查(唐篩)臨床應用較廣的是用酶聯(lián)免疫法測孕婦孕中期外周血血清中α-FP(甲胎蛋白)和hCG(人絨毛膜促性腺激素)、uE3(游離雌三醇，unconjugatedEstriol)，用計算機軟件綜合分析上述兩-三項測定結(jié)果及孕婦年齡、體重及準確的孕周等，計算出胎兒患上D.S及神經(jīng)管畸形(NTD)的風險率。篩出的“高危孕婦”，被建議進一步抽取羊水，作核型分析，以便準確查出D.S及可能的18三體，或13-三體等異常。此種方法能同時計算出NTD的風險。但據(jù)近幾年國內(nèi)大量篩查的結(jié)果看，普遍反映其假陽性率很高，(篩幾千例竟未查出1例陽性)；并且還有一定的漏檢率，即篩查為低風險的孕婦中產(chǎn)下了D.S患兒(孫念姑，唐氏篩查，中國的現(xiàn)狀與對策，第五屆全國產(chǎn)前診斷學術研討會論文匯編，2005年9月，湖北武漢P38；劉子建，產(chǎn)前診斷，香港的經(jīng)驗和教訓，第五屆全國產(chǎn)前診斷學術研討會論文匯編，2005年9月，湖北武漢P37)。另一種是用B超觀察測量胎兒頸項透明層的厚度(NT)的異常作為D.S胎兒的輔助診斷指標。但這種指標對操作者的經(jīng)驗、技巧及儀器等要求均很高，靈敏度低，僅60-70％，受孕婦體重、糖尿病和吸煙等影響，誤差也很大；正在進一步研究和總結(jié)經(jīng)驗之中(嚴英榴，遺傳超聲，第五屆全國產(chǎn)前診斷學術研討會論文匯編，2005年9月，湖北武漢P51)。呂時銘等用多重實時定量PCR技術對目標基因和內(nèi)參分子標記進行同管擴增，通過二者ΔCT值來確定21號染色體數(shù)目并由此診斷21-三體綜合征(呂時銘等，申請?zhí)朇N200510049601.2，實時定量PCR技術檢測人21號染色體數(shù)目的方法)。此技術較建立在標準曲線基礎上的絕對定量方法(鄭明明，胡婭莉等，實時熒光定量PCR技術在產(chǎn)前診斷唐氏綜合征中的應用.中華婦產(chǎn)科雜志，2004，39678-681)更簡便、更準確；但不能用于無創(chuàng)產(chǎn)前篩查。此外，劉敬忠還首創(chuàng)了運用SYBR Green 1實時熒光PCR結(jié)合融解曲線分析法對D.S作出診斷的技術(劉敬忠，申請?zhí)朇N200510055338.8，唐氏綜合征基因診斷新技術及其應用)。上述三種技術檢測的都是羊水細胞，絨毛或白細胞DNA，都是用于對D.S的診斷或有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷，而不是無創(chuàng)產(chǎn)前篩查。
近年來發(fā)現(xiàn)孕婦外周血血漿和血清中有游離DNA，且包含胎兒DNA，雖然后者占的比例很低(Lo YM，Corbetta N，Chamberlain PF et al，Presence of fetalDNA in maternal plasma and serum.Lancet 1997，350485-487)。進而Li Y等報道用凝膠電泳法將孕婦血漿總DNA分成不同長度的組份，發(fā)現(xiàn)在≤300bp的組份中，胎兒DNA占的比例最高，(占28.4％～68.7％)(Li Y，Zimmermann B，Rusterholz C et al，Size Seperation of circulatory DNA in maternal plasmapermits ready detection of fetal DNA polymorphisms.Clin.Chem，501002-1011，2004)。這樣對原本濃度很低的胎兒DNA就起了一個富集的作用。從這一組份的DNA通過多重PCR擴增21號染色體上多個STR位點片段，然后經(jīng)ABI310自動分析，從峰型中能很明確地診斷出男性胎兒，從而能進行性連鎖單基因遺傳病、RhD母嬰血型不配的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷；同時能查出胎兒是否繼承了父親的β-珠蛋白基因的突變或21號染色體上父源特異的多態(tài)性標志(STR)。但由于不能辨別胎兒從母親繼承的STR峰究竟是一條還是二條(被孕婦DNA峰掩蓋)，由此他們認為尚不能從孕婦外周血游離DNA檢測出胎兒是否患有21-三體綜合征(Li Y，Zimmermann B，Rusterholz C et al，Size Seperation of circulatoryDNA in maternal plasma permits ready detection of fetal DNA polymorphisms.Clin.Chem，501002-1011，2004)。從孕婦外周血分離獲取胎兒有核紅細胞繼而用基于PCR的技術診斷D.S。胎兒雖然是無創(chuàng)性的技術(Samura O，Sohda S，JohnsonK，et al，Diagnosis of trisomy 21 in fetal nucleated erythrocytes frommaternal blood by use of short tandem repeat sequences.Clin.Chem.2001，471622-1626)，但由于獲得的胎兒有核紅細胞數(shù)目太少，需要昂貴的儀器設備，單細胞PCR的高難度等，故仍處于個別實驗室的研究階段。
實時熒光定量PCR(real-time Q-PCR)技術實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，它以其特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應等優(yōu)點成為了分子生物學研究中的重要工具。所謂real-time Q-PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在real-time Q-PCR中，對整個PCR反應擴增過程進行了實時的監(jiān)測和連續(xù)地分析擴增相關的熒光信號，隨著反應時間的進行，監(jiān)測到的熒光信號的變化可以繪制成一條曲線。在PCR反應早期，產(chǎn)生熒光的水平不能與背景明顯地區(qū)別，可以在PCR反應處于指數(shù)期的某一點上來檢測PCR產(chǎn)物的量，并且由此來推斷模板分子最初的拷貝數(shù)。首先需設定一定熒光信號的域值，一般這個閾值(域值)(threshold)是以PCR反應的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號(baseline)，域值的設置是3～15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。如果檢測到熒光信號超過閾值被認為是真正的信號，它可用于定義樣本的域值循環(huán)數(shù)(Ct)。Ct值的含義是每個反應管內(nèi)的熒光信號達到設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，每個PCR反應的Ct值與該PCR模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，因此只要測得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。最常用的Real-time Q-PCR是Taqman探針技術。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種篩查唐氏綜合征高危胎兒的方法。
本發(fā)明所提供的篩查唐氏綜合征高危胎兒的方法，是用實時熒光定量PCR同時檢測孕婦外周血血漿或血清游離DNA中小于500bp的DNA組份中非21號染色體上在進化和功能上穩(wěn)定的基因片段的Ct值、21號染色體上與唐氏綜合征的發(fā)生相關的基因片段的Ct值，計算出所述兩個Ct值之差的絕對值，得到待測孕婦的|ΔCt|；和用所述實時熒光定量PCR檢測至少20份懷正常胎兒孕婦外周血血漿或血清游離DNA中小于500bp的DNA組份中非21號染色體上在進化和功能上穩(wěn)定的基因片段的Ct值、21號染色體上與唐氏綜合征的發(fā)生相關的基因片段的Ct值，計算出所述兩個Ct值之差的絕對值的平均值，得到懷正常胎兒孕婦的|ΔCt|的平均值；如待測孕婦的|ΔCt|大于懷正常胎兒孕婦的|ΔCt|的平均值與2SD之和(閾值)，則該待測孕婦懷的胎兒為高風險唐氏綜合征胎兒；所述2SD為懷正常胎兒的孕婦的|ΔCt|的二倍標準差。
上述實時熒光定量PCR為多重實時熒光定量PCR。
所述多重實時熒光定量PCR檢測待測孕婦外周血血漿或血清的PCR模板為待測孕婦外周血血漿或血清中小于500bp的DNA組份。
為了提高篩查的靈敏度，所述多重實時熒光定量PCR檢測待測孕婦外周血血漿或血清的PCR模板為待測孕婦外周血血漿或血清中小于等于300bp的DNA組份。
在實際應用中，所述非21號染色體上在進化和功能上穩(wěn)定的基因可為GAPDH基因，所述21號染色體上與唐氏綜合征的發(fā)生相關的基因可為DSCR3基因。所述懷正常胎兒孕婦的|ΔCt|的平均值與2SD之和在本發(fā)明的實驗條件下為1.62。該數(shù)值在使用同一試劑盒的條件下是固定的；但在使用不同試劑盒時可以有所不同。
所述實時熒光定量PCR中，擴增DSCR3基因的引物具有序列表中序列1和序列2的核苷酸序列，檢測DSCR3基因的探針具有序列表中序列3的核苷酸序列。
所述實時熒光定量PCR中，擴增GAPDH基因的引物具有序列表中序列4和序列5的核苷酸序列，檢測GAPDH基因的探針具有序列表中序列6的核苷酸序列。
在實際應用中，所述非21號染色體上在進化和功能上穩(wěn)定的基因可為RABIF基因，所述21號染色體上與唐氏綜合征的發(fā)生相關的基因可為D21S1437。此時所述懷正常胎兒孕婦的|ΔCt|的平均值與2SD之和在本發(fā)明的實驗條件下為1.86.該數(shù)值在使用同一試劑盒的條件下是固定的；但在使用不同試劑盒時可以有所不同。
所述實時熒光定量PCR中，擴增D21S1437基因的引物具有序列表中序列7和序列8的核苷酸序列，檢測D21S1437基因的探針具有序列表中序列9的核苷酸序列。
所述實時熒光定量PCR中，擴增RABIF基因的引物具有序列表中序列10和序列11的核苷酸序列，檢測RABIF基因的探針具有序列表中序列12的核苷酸序列。
為了提高篩查結(jié)果的可靠性，對同一份標本還可以同時檢測兩個非21號染色體上在進化和功能上穩(wěn)定的基因，如GAPDH和RABIF基因，兩個21號染色體上與唐氏綜合征的發(fā)生相關的基因，如DSCR3和D21S1437基因；當待測孕婦的GAPDH基因片段和DSCR3基因片段的Ct值之差的絕對值大于懷正常胎兒孕婦的|ΔCt|的平均值與2SD之和、待測孕婦的RABIF基因片段和D21S1437基因片段的Ct值之差的絕對值大于懷正常胎兒孕婦的|ΔCt|的平均值與2SD之和，則該待測孕婦懷的胎兒為高風險唐氏綜合征胎兒；所述2SD為懷正常胎兒的孕婦的|ΔCt|的二倍標準差。
本發(fā)明的篩查唐氏綜合征高危胎兒的方法可直接從孕婦外周血血漿或血清檢測出高風險唐氏綜合征胎兒，該方法無創(chuàng)，準確度和靈敏度高；假陽性率假陰性率低。
具體實施例方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實施例1、用實時熒光定量PCR檢測模擬的孕婦外周血血漿或血清游離DNA中小于500bp-300bp的DNA組份的DNA標本的ΔCT1、DNA抽提從2個正常人(血細胞中有2條21號染色體)和2個已為臨床及核型分析診斷為D.S的患兒的外周血細胞用酚-氯仿抽提法得到基因組DNA。用紫外分光光度法，瓊脂糖凝膠電泳法和實時熒光定量PCR法(檢測)GAPDH基因片段精確地定出DNA濃度，并稀釋至0.05μg/μl。
2、模擬的孕婦外周血血漿或血清游離DNA中小于500bp-300bp的DNA組份的DNA標本的配制以不同比例配制正常DNA與D.S患兒DNA(D.S.DNA)的混合溶液，按表1進行表1

表1中2號DNA標本相當于懷了一個D.S胎兒的孕婦外周血血漿或血清游離DNA中小于500bp的DNA組份，其胎兒的DNA占50％。同理，表1中3號，4號及5號標本相當于一位懷了一個D.S胎兒的孕婦外周血血漿或血清游離DNA中小于500bp的DNA組份，其胎兒的DNA依次占40％，30％，和20％。
3、擴增21號染色體上的與D.S.有關的基因DSCR3片段(序列表中序列13的自5′端第28位至第149位脫氧核苷酸序列)的引物及探針如下上游引物序列5’TAG CAA GTC AGA GGT TTC CTT 3’(序列1)，下游引物5’AAC ATT GAC TGT GGC TCT TGC 3’(序列2)檢測DSCR3基因片段的探針5’FAM-CAC TCT CCA GCA AGC TCA AACTGC-Tamra 3’(序列3)。
4、擴增做為內(nèi)參照的12號染色體上的管家基因GAPDH片段(序列表中序列14的自5′端第41位至第191位脫氧核苷酸序列)的引物及探針如下上游引物5’CTG TCC AGT TAA TTT CTG ACC 3’(序列4)，下游引物5’CTT TGT ACA TGG TAT TCA CCA C 3’(序列5)，檢測GAPDH基因片段的探針5’VIC-AAT GCT TGC TGC TGC CTA GCTCAG-Tamra 3’(序列6)。
5、表1中的6管DNA每管DNA單獨一個反應體系。PCR反應混合物總體積25μl，含表1中DNA溶液1μl，上述2對引物各0.2μmol/L，檢測DSCR3基因的探針為0.04μmol/L，檢測GAPDH基因的探針為0.2μmol/L，購自ABI公司的TaqManUniversal Master Mix 12.5μl。每個管號的DNA做3只平行管。
6、熱循環(huán)在ABI Prism 7000熒光定量PCR儀上進行先50℃2分鐘；然后95℃10分鐘；最后按如下條件進行40個循環(huán)95℃15秒，60℃，1分鐘。
基線(Baseline)定在6-21，閾值0.2，儀器自動給出各反應曲線的Ct值。
7、計算出ΔCt如下ΔCt＝CtGAPDH-CtDSCR3。
結(jié)果如表2所示，表明隨待測混合DNA溶液中D.S.DNA百分比從20％增加到50％時，靶基因與內(nèi)參照基因間的ΔCt也在增加，并且都大于正常ΔCt平均值+2SD＝1.42±2SD，(見實施例2)。當孕婦懷上一個D.S.胎兒的時候，其外周血血漿或血清游離DNA中小于500bp-300bp的DNA組份中，就會含有約至少20％至50％，甚至70％的D.S胎兒DNA。這樣以這一組份的DNA為模板測得的ΔCt值就會明顯高于懷正常胎兒的孕婦(正常ΔCt平均值±2SD＝1.42±2SD；反過來說，如果測得一未知標本的ΔCt值≥1.42±2SD，即可判斷該未知標本為“高風險D.S胎兒”。
表2.以正常DNA與D.S.DNA混合溶液為模板用實時熒光定量PCR檢測21號染色體的DSCR3基因與12號染色體上GAPDH基因得到的Ct值及ΔCt值


*從另一份正常DNA和另一份D.S.DNA混合溶液測得的Ct值計算出的ΔCt*。
實施例2、用本發(fā)明的方法篩查D.S高風險的胎兒用瓊脂糖凝膠電泳分步分離得到小于500bp的DNA組份后，檢測16位用酶聯(lián)免疫法(測AFP，hCG)篩查為D.S高風險的孕婦及24位用酶聯(lián)免疫法(測AFP，hCG)篩查為D.S低風險的孕婦的DSCR3與GAPDH基因Ct值及ΔCt值，具體步驟如下1、取血前，與每位孕婦簽署知情同意書。每份EDTA抗凝血標本各10ml取自用酶聯(lián)免疫法(測AFP，hCG)檢測為D.S胎兒高風險的孕婦16名及篩查為D.S低風險的孕婦24名，經(jīng)2次離心(1600g，10分鐘，上清再經(jīng)16000g，10分鐘)獲得血漿。
2、血漿DNA提取用德國QIAamp mini Kit方法提取血漿中DNA，按廠家說明書進行，用紫外分光法測定濃度，稀釋至0.50μg/μl備用。
3、孕婦外周血血漿游離DNA中小于500bp的DNA組份的制備上述共40份血漿DNA，用1％瓊脂糖凝膠電泳，各加DNA溶液15μl，同時加DNA長度標準物100bp ladder和Lamda DNA/Hind III酶切物。電泳在80伏1小時。將含有500～80bp DNA的凝膠切下，用Qiagen公司QIAEX II Gel Extraction Kit回收純化其中DNA，溶解于15μl Tris-Hcl pH 8.0buffer中。
4、20個D.S.患兒外周血細胞的基因組DNA的提取同實施例1的步驟1。
5、用實時熒光定量PCR測定24位用酶聯(lián)免疫法(測AFP，hCG)檢測為D.S胎兒低產(chǎn)風險的孕婦外周血血漿游離DNA中小于500bp的DNA組份及20個D.S.患兒外周血細胞的基因組DNA的ΔCt值。PCR反應體系除模板DNA不同外，其余同實施例1的步驟5。
6、PCR反應和ΔCt值的計算方法同實施例1的步驟6和7。
7、用實時熒光定量PCR測定16個所述用酶聯(lián)免疫法(測AFP，hCG)檢測為D.S高危孕婦外周血血漿游離DNA中小于500bp的DNA組份的ΔCt值上述16份DNA標本PCR反應體系除模板DNA標本外，其余同實施例1的步驟5；8、PCR反應和ΔCt值的計算方法同實施例1的步驟6和7。
結(jié)果表明24位用酶聯(lián)免疫法檢測為D.S低風險孕婦外周血血漿游離DNA中小于500bp的DNA組份標本的ΔCt值的絕對值的平均值為1.42±0.20。20個D.S.患兒外周血細胞的基因組DNA的ΔCt值的絕對值的平均值為2.58±0.20。16份所述用酶聯(lián)免疫法檢測為D.S高風險的孕婦外周血血漿游離DNA中小于500bp的DNA組份標本的ΔCt值如表3表3 16份用酶聯(lián)免疫法檢測為D.S高風險孕婦外周血血漿游離DNA中小于500bp的DNA組份標本的ΔCt值

表3表明6#和13#的ΔCt明顯高出正常值范圍(1.42+0.20)，因此這二例孕婦可判斷為真正的D.S高風險。這與用羊水核型分析的結(jié)果一致。同時表明，16份用酶聯(lián)免疫法(測AFP，hCG)檢測為D.S高風險的孕婦中，有14例為假陽性(假陽性率81.5％)。
實施例3、用本發(fā)明的方法篩查D.S高風險的胎兒用瓊脂糖凝膠電泳分步分離小于等于300bp的DNA組份后，檢測21號染色體上另一與D.S密切有關的基因片段D21S1437與1號染色體上無多態(tài)性無三體可能性的另一內(nèi)參照基因RABIF的Ct值及ΔCt，具體步驟如下1、取血前，與每位孕婦簽署知情同意書。每份EDTA抗凝血標本各10ml，取自用酶聯(lián)免疫法(測AFP，hCG)檢測為D.S胎兒高風險的孕婦16名及篩查為D.S低風險的孕婦24名，經(jīng)2次離心(1600g，10分鐘，上清再經(jīng)16000g，10分鐘)獲得血漿。同實施例2。
2、血漿DNA提取同實施例2步驟2。
3、孕婦外周血血漿游離DNA中小于等于300bp的DNA組份的制備同實施例2步驟3。
4、20個D.S.患兒外周血細胞的基因組DNA的提取同實施例1的步驟1。
5、擴增21號染色體上靶基因D21S1437片段(序列表中序列15的自5′端第157位至第280位脫氧核苷酸序列)的引物及探針如下上游引物序列5’ATG TAC ATG TGT CTG GG AAG 3’(序列7)，下游序列5’CTC TAC ATA TTT ACT GCC AAC 3’(序列8)；檢測D21S1437基因的探針5’Fam-CTTCCTTCCTTCCTTCCTTCCTTC-Temra 3’(序列9)。
6、擴增1號染色體上的RABIF基因片段(序列表中序列16的自5′端第6位至第68位脫氧核苷酸序列)的引物和探針如下上游引物5’CTCAACATGGGCCCCACAT 3’(序列10)；下游引物5’AAGCCAGTGTGCCTGAAGCA 3’(序列11)；檢測RABIF基因的探針5‘VIC-TCCTAGTTTCCCCGGCTCATTATG-Temra(序列12)。
7、用實時熒光定量PCR測定24位用酶聯(lián)免疫法(測AFP，hCG)檢測為D.S胎兒低產(chǎn)風險的孕婦外周血血漿游離DNA中小于等于300bp的DNA組份及20個D.S.患兒外周血細胞的基因組DNA的ΔCt值。PCR反應體系除2對引物和探針為上述步驟5和6的引物和探針外，其余同實施例2的步驟5。上述2對引物各0.2μmol/L，探針濃度為0.04μmol/L。PCR反應同實施例1的步驟6。ΔCt＝CtRABIF-CtD21S1437。
8、用實時熒光定量PCR測定16個所述用酶聯(lián)免疫法(測AFP，hCG)檢測為D.S高危孕婦外周血血漿游離DNA中小于等于300bp的DNA組份的ΔCt值上述16份DNA標本PCR反應體系除模板DNA標本外，其余同步驟7；ΔCt＝CtRABIF-CtD21S1437。
結(jié)果表明以24位用酶聯(lián)免疫法檢測為D.S低風險的孕婦外周血血漿游離DNA中小于等于300bp的DNA組份為模板進行實時熒光定量PCR(各做3個平行管)，檢測1號染色體上的RABIF基因片段與21號染色體上靶基因D21S1437片段得到的ΔCt值的絕對值的平均值為1.62±0.20。
以20個D.S.患兒外周血細胞的基因組DNA為模板進行實時熒光定量PCR(各做3個平行管)，檢測1號染色體上的RABIF基因片段與21號染色體上靶基因D21S1437片段得到的ΔCt值的絕對值的平均值為2.70±O.20。
以16份所述用酶聯(lián)免疫法檢測為D.S高風險的孕婦外周血血漿游離DNA中小于等于300bp的DNA組份為模板進行實時熒光定量PCR(各做3個平行管)，檢測1號染色體上的RABIF基因片段與21號染色體上靶基因D21S1437片段的Ct值，計算每份標本的ΔCt，結(jié)果示于表4表4.16份用酶聯(lián)免疫法檢測為D.S高風險孕婦外周血血漿游離DNA中小于等于300bp的DNA組份標本的ΔCt值

表4結(jié)果表明，6#和13#ΔCt明顯高出正常值范圍(1.62+0.20)，屬D.S高風險胎兒。12#ΔCt1.81接近正常ΔCt值的絕對值的平均值的上限(1.82)，但仍在正常范圍內(nèi)(對未知標本為慎重起見可重復作一次；并建議2-3周后復查)?？梢姡\用檢測21號染色體上D21S1437基因與1號染色體上RABIF基因的實時熒光定量PCR與實施例2測定DSCR3及GAPDH基因得出的結(jié)果一致，即在16例孕婦中，6#和13#是D.S高風險胎兒，其它14位均是低風險。運用本發(fā)明的方法無創(chuàng)篩查D.S.胎兒的準確度和靈敏度都達到十分滿意的程度，在這16例中沒有發(fā)現(xiàn)假陽性和假陰性。
在實際應用中，對同一份標本還可以同時運用實施例2和實施例3所述的兩種實時熒光定量PCR系統(tǒng)進行檢測，綜合兩個結(jié)果作出最終篩查結(jié)論更為可靠。
序列表<160>16<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>1tagcaagtca gaggtttcct t21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2aacattgact gtggctcttg c21<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3cactctccag caagctcaaa ctgc 24<210>4<211>21
<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>4ctgtccagtt aatttctgac c21<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5ctttgtacat ggtattcacc ac 22<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>6aatgcttgct gctgcctagc tcag 24<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>7atgtacatgt gtctgggaag 20<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>8ctctacatat ttactgccaa c21<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
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權(quán)利要求
1.一種篩查唐氏綜合征高危胎兒的方法，是用實時熒光定量PCR同時檢測孕婦外周血血漿或血清游離DNA中小于500bp的DNA組份中非21號染色體上在進化和功能上穩(wěn)定的基因片段的Ct值、21號染色體上與唐氏綜合征的發(fā)生相關的基因片段的Ct值，計算出所述兩個Ct值之差的絕對值，得到待測孕婦的|ΔCt|；和用所述實時熒光定量PCR檢測至少20份懷正常胎兒孕婦外周血血漿或血清游離DNA中小于500bp的DNA組份中非21號染色體上在進化和功能上穩(wěn)定的基因片段的Ct值、21號染色體上與唐氏綜合征的發(fā)生相關的基因片段的Ct值，計算出所述兩個Ct值之差的絕對值的平均值，得到懷正常胎兒孕婦的|ΔCt|的平均值；如待測孕婦的|ΔCt|大于懷正常胎兒孕婦的|ΔCt|的平均值與2SD之和，則該待測孕婦懷的胎兒為高風險唐氏綜合征胎兒；所述2SD為懷正常胎兒的孕婦的|ΔCt|的二倍標準差。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述實時熒光定量PCR為多重實時熒光定量PCR。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述多重實時熒光定量PCR檢測待測孕婦外周血血漿或血清的PCR模板為待測孕婦外周血血漿或血清中小于500bp的DNA組份。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述多重實時熒光定量PCR檢測待測孕婦外周血血漿或血清的PCR模板為待測孕婦外周血血漿或血清中小于等于300bp的DNA組份。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述非21號染色體上在進化和功能上穩(wěn)定的基因為GAPDH基因，所述21號染色體上與唐氏綜合征的發(fā)生相關的基因為DSCR3基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述實時熒光定量PCR中，擴增DSCR3基因片段的引物具有序列表中序列1和序列2的核苷酸序列，檢測DSCR3基因片段的探針具有序列表中序列3的核苷酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述實時熒光定量PCR中，擴增GAPDH基因片段的引物具有序列表中序列4和序列5的核苷酸序列，檢測GAPDH基因片段的探針具有序列表中序列6的核苷酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述非21號染色體上在進化和功能上穩(wěn)定的基因為RABIF基因，所述21號染色體上與唐氏綜合征的發(fā)生相關的基因為D21S1437。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述實時熒光定量PCR中，擴增D21S1437基因片段的引物具有序列表中序列7和序列8的核苷酸序列，檢測D21S1437基因片段的探針具有序列表中序列9的核苷酸序列；擴增RABIF基因片段的引物具有序列表中序列10和序列11的核苷酸序列，檢測RABIF基因片段的探針具有序列表中序列12的核苷酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述非21號染色體上在進化和功能上穩(wěn)定的基因為GAPDH和RABIF基因，所述21號染色體上與唐氏綜合征的發(fā)生相關的基因為DSCR3和D21S1437基因；當待測孕婦的GAPDH基因片段和DSCR3基因片段的Ct值之差的絕對值大于懷正常胎兒孕婦的|ΔCt|的平均值與2SD之和、待測孕婦的RABIF基因片段和D21S1437基因片段的Ct值之差的絕對值大于懷正常胎兒孕婦的|ΔCt|的平均值與2SD之和，則該待測孕婦懷的胎兒為高風險唐氏綜合征胎兒；所述2SD為懷正常胎兒的孕婦的|ΔCt|的二倍標準差。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種篩查唐氏綜合征高危胎兒的方法。該方法用實時熒光定量PCR同時檢測孕婦外周血血漿或血清游離DNA中小于500bp的DNA組份中非21號染色體上在進化和功能上穩(wěn)定的基因片段的Ct值、21號染色體上與唐氏綜合征的發(fā)生相關的基因片段的Ct值，計算出所述兩個Ct值之差的絕對值；和用所述實時熒光定量PCR檢測至少20份懷正常胎兒孕婦外周血血漿或血清游離DNA中小于500bp的DNA，計算出所述兩個Ct值之差的絕對值的平均值，進行比較；如待測孕婦的|ΔCt|大于懷正常胎兒孕婦的|ΔCt|的平均值與2SD之和，則該待測孕婦懷的胎兒為高風險唐氏綜合征胎兒。該篩查唐氏綜合征高危胎兒的方法無創(chuàng)，準確度和靈敏度高；假陽性率假陰性率低。
文檔編號C12Q1/68GK1844408SQ20061000310
公開日2006年10月11日 申請日期2006年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月10日
發(fā)明者劉敬忠, 肖白 申請人:首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院