專利名稱：用于測量生物液體中的分析物的自我限定大小的組合物和檢驗設(shè)備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及用于測定生物液體中的分析物的量的制劑。在一個重要的應(yīng)用中，本發(fā)明應(yīng)用于測量血液或其它液體中的葡萄糖的含量。
背景技術(shù)：
生物液體如全血中的分析物的量的測定，在某些疫病的診斷和治療方面十分重要。例如測定糖尿病患者個體血液中的葡萄糖水平，糖尿病患者必須頻繁地檢查血液中的葡萄糖水平以調(diào)整他們的飲物和藥物?？梢酝ㄟ^一些方法測量血液中的葡萄糖的含量。一種方法是使用電化學(xué)的生物傳感器，其將葡萄糖含量與所測得的電流相聯(lián)系。另一種方法提供葡萄糖含量的可視性指示，例如通過指示劑的反應(yīng)顯現(xiàn)顏色。本發(fā)明在光學(xué)測量上特別有用，同時也應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感器。
已有許多專利描述了使用指示劑的方法，當它們在一系列反應(yīng)的最后一步被化學(xué)氧化時顯現(xiàn)顏色或顯現(xiàn)其它可測性響應(yīng)。例如，使用酶的方法，例如分析物氧化酶(例如葡萄糖氧化酶)或分析物脫氫酶(例如葡萄糖脫氫酶)。所采用的流程是相似的，但是使用了不同的酶、介質(zhì)和指示劑。
許多美國專利和專利申請中教導(dǎo)了使用葡萄糖氧化酶的方法。代表性的是美國專利US4,211,845、US4,808,529、US5,116,729、US5,264,348、US5,620,863和US2003/0077702 A1。這些專利教導(dǎo)了隨著過氧化氫的釋放將葡萄糖氧化成葡萄糖酸的方法。據(jù)說過氧化氫在過氧化物酶的存在下氧化指示劑而產(chǎn)生可測量的顏色，其指示血液樣本中的葡萄糖的含量。最近一些專利提出了葡萄糖隨著過氧化氫的釋放首先轉(zhuǎn)換成葡萄糖酸，再轉(zhuǎn)化成葡糖酸內(nèi)酯的方法。也有建議認為先形成葡糖酸內(nèi)酯再水解成葡萄糖酸。不管哪種方法過程是正確的，葡萄糖氧化酶都已被廣泛地運用在干燥帶和其他用于測量血液中葡萄糖含量的技術(shù)上。
在葡萄糖傳感器上使用了不同的指示劑，例如對二氨基聯(lián)苯型指示劑和雜環(huán)吖嗪。例如，3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺和丁香醛連氮，發(fā)光氨，鄰聯(lián)甲苯胺，鄰聯(lián)茴香胺和其它。另指示劑家族是四唑染料前體。描述此類指示劑的專利例子包括美國專利US5,126,275、US5,322,680、US5,300,637、US5,290,536、US5,360,595和US6,586,199。在下述的發(fā)明優(yōu)選實施方案中使用了四唑指示劑。
關(guān)于本發(fā)明中特別引起注意的是美國專利US6,200,773和它的原案美國專利US5,902,731中描述的方法。在這些專利中，在血液中的葡萄糖含量的檢驗中使用了葡萄糖脫氫酶，作為輔助因子的NAD或PQQ或它們的衍生物、四唑染料前體、硫辛酰胺脫氫酶或類似物和亞硝酸鹽。專利‘773的圖5是通過四唑染料前體還原成甲 而顯現(xiàn)顏色來檢測葡萄糖的方法的圖。
涉及使用酶測定血液中葡萄糖的量的在先專利是美國專利US3,630,957。葡萄糖氧化酶和過氧化物酶均勻地分配到一個防水的聚合物膜中以與葡萄糖反應(yīng)并產(chǎn)生顏色。該膜能被支持在基質(zhì)例如聚合物膜上。其中建議可另入包括白堊、二氧化鈦、膠體硅酸(在實施例中使用了)等，并且可包括顏料以使膜不透明。將血液應(yīng)用于含試劑的膜，然后在讀取所顯現(xiàn)的顏色前將其去除。在美國專利US5,968,765中也討論了使用不透明填充物來減少在由血紅細胞造成的對葡萄糖測量方面的干擾。
另一個引人注意的是美國專利US4,312,834，其中描述了包括不溶性粒子的防水膜的使用，該粒子在阻礙大組分進入的同時給試劑提供通道。膜可被支撐在載體上，比如膜、箔等?？紤]到確定的分子的進入，專利權(quán)人指出微粒(稱為“膜開啟者”(film opener))的量應(yīng)該有一定的限度。建議了不同類型的粒子，如硅藻土膠、硅膠和石膏等。二氧化鈦被建議作為膜開啟者和提高膜緩和性質(zhì)的一個途徑。一般而言，實施例中200-400μm相對厚的膜沉積在基質(zhì)膜上；在某些情況下應(yīng)用多層膜。如在‘957專利中，過量的樣品，例如血液，在反應(yīng)發(fā)生后去除。
許多專利都有測試條的描述，因為它們廣泛用于檢測生物樣本中的分析物。如果要獲得準確并且一致的結(jié)果，每個測試條應(yīng)用都有其必須要解決的獨特問題。檢驗全血要求血紅細胞不干擾指示葡萄糖存在的所顯現(xiàn)的顏色，也不干擾電化學(xué)測量。在某些情況中特定成份加入到測試條中以使血紅細胞從樣本中被過濾。在其它情況中，在一段時間過去后去除樣本，可以測量顯現(xiàn)的顏色。當檢驗全血時遇到了涉及樣本中的血紅細胞濃度的問題。通常通過血細胞比容值來測量血紅細胞它們在樣本中的量。因為血液樣本中的血細胞比容可以在20至60％間變化，所以葡萄糖的測量也許會受影響。同時，運載葡萄糖到試劑以顯現(xiàn)顏色(或電化學(xué)響應(yīng))的血漿移動也許會延遲或未完成。
防止血紅細胞到達與葡萄糖反應(yīng)的試劑是許多本領(lǐng)域技術(shù)人員的關(guān)注點。在上述‘765專利的測試條中，0.002至0.2英寸(50.8到5080μm)厚的多孔膜加入了使血紅細胞從全血中分離出來的試劑，其包括混在其中的聚丙烯酸、指示劑和如二氧化鈦、滑石等的不透明填充物。涂層溶液沉積在多孔膜的表面或者吸收在膜內(nèi)。
在美國專利US5,306,623中，一種能分離全血的涂層選自包括聚乙烯醇磺酸、聚乙二醇、聚苯乙烯磺酸、羥丙基纖維素、聚丙烯乙二醇、聚乙烯醇和聚丙烯酸的聚合物。分離涂層連同用于檢驗血的試劑一起沉淀在多孔基體上。
美國專利US5,789,255討論了血測試條對全血血細胞比容的敏感度。發(fā)明者發(fā)現(xiàn)增加0.1-2％w/v的高分子量(＞750000)丙烯酸聚合物降低了變化的血細胞比容對葡萄糖測量的影響。
用于測量全血樣本中葡萄糖的理想測試條應(yīng)該對血液樣本中血細胞比容不敏感，并提供快速、準確和一致的結(jié)果?？焖俚捻憫?yīng)時間加上穩(wěn)定的端點(endpoint)將提供一個大大降低對時間依賴性并因此對使用者來說更為便利的檢驗。對使用者來說另一個重要方面是，測試條應(yīng)該對所用血液量不敏感。下面更詳細地對很接近理想的性能的測試條進行描述。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要涉及用于測量生物液體中分析物的光學(xué)或電化學(xué)方法中的自我限定大小(size self-limiting)的試劑制劑和含該試劑制劑的測試條。雖然葡萄糖是特別感興趣的分析物，但是其它生物液體中的其它分析物也被認為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
該創(chuàng)造性制劑主要包括含標稱大小約0.05至20μm，優(yōu)選約1至10μm的不溶于水粒子的水溶性可膨脹的聚合物基體和與分析物反應(yīng)的酶體系。水不溶性粒子與水溶性可膨脹的聚合物基體的重量比是約1/2至2/1。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的試劑制劑包括作為反應(yīng)物的用于與葡萄糖反應(yīng)的酶體系和指示劑。酶體系包括葡萄糖脫氫酶和該酶的輔助因子如NAD、四唑鹽指示劑，以及在特別優(yōu)選實施方案中作為介質(zhì)的硫辛酰胺脫氫酶。試劑與含不溶于水的小粒子的水溶性可膨脹的聚合物基體結(jié)合，粒子優(yōu)選二氧化鈦和碳酸鈣。聚合物基體優(yōu)選選自聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯磺酸鈉、聚丙烯酸膠乳、聚乙二醇、苯乙烯丙烯酸酯和它們的共聚體。粒子與聚合物基體的重量比優(yōu)選為約1/2至2/1。在制備測試條中，本發(fā)明的制劑流延成無孔基質(zhì)上厚度約6至16μm的膜，優(yōu)選約7至10μm。膜用包括毛細管通道的粘合層和防護頂覆蓋來完成測試條。覆蓋可以是透明的或不透明的。
另一個方面，本發(fā)明是通過光學(xué)或電化學(xué)方法檢驗生物液體中分析物如全血中葡萄糖的方法，其提供了快速穩(wěn)定的響應(yīng)并對樣本的量不敏感。本發(fā)明的方法使用測試條，其中薄膜被流延在無孔基質(zhì)上，膜包括在水溶性可膨脹的聚合物基體中的標稱大小0.05至20μm優(yōu)選1至10μm的不溶于水粒子。薄膜優(yōu)選厚度約6至16μm，更優(yōu)選約7至10μm；并且反射粒子與聚合物基體的重量比優(yōu)選為約1/2至2/1。


圖1a、b是實施例1結(jié)果的曲線圖。
圖2a、b是實施例2結(jié)果的曲線圖。
圖3a、b、c是實施例3結(jié)果的曲線圖。
圖4a、b、c是實施例4結(jié)果的曲線圖。
具體實施方案本發(fā)明主要涉及用于測量生物液體中的分析物的制劑，分析物包括但不局限于葡萄糖、乳酸鹽、膽固醇、甘油三酯、游離脂肪酸、膽紅素、抗壞血酸、過氧化氫和尿酸。本發(fā)明的一個重要應(yīng)用是測量全血中的葡萄糖含量，其在下面被更詳細地描述。制劑可以替代其它試劑用于測量葡萄糖，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。
測量血液中葡萄糖光學(xué)方法血液中的葡萄糖可以通過使用酶來氧化葡萄糖的試劑體系來測定，酶包括但不局限于己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、葡萄糖脫氫酶-PQQ和葡萄糖氧化酶。
在使用葡萄糖氧化酶的方法中，這些酶與葡萄糖反應(yīng)產(chǎn)生氧化的葡萄糖和過氧化氫。過氧化氫在過氧化物酶存在條件下氧化指示劑化合物。氧化的指示劑產(chǎn)生與血液樣本中的葡萄糖含量相聯(lián)系的顏色。
在本發(fā)明的其它實施方案中，葡萄糖脫氫酶連同輔助因子如NAD、FAD或PQQ、介質(zhì)如硫辛酰胺脫氫酶和指示劑如四唑染料前體一起被使用以產(chǎn)生對樣本中葡萄糖含量成比例的可見響應(yīng)。這種反應(yīng)通常通過以下順序的反應(yīng)被描述葡萄糖+GDH-輔助因子氧化→葡糖酸內(nèi)酯+GDH-輔助因子還原GDH-輔助因子還原+介質(zhì)氧化→GDH-輔助因子氧化+介質(zhì)還原介質(zhì)還原+四唑指示劑→介質(zhì)氧化+甲 根據(jù)這種順序的反應(yīng)，葡萄糖轉(zhuǎn)變成葡糖酸內(nèi)酯同時脫氫酶-輔助因子被還原然后為了與可用的葡萄糖進一步反應(yīng)通過介質(zhì)被再氧化。
脫氫酶與葡萄糖特異性反應(yīng)的脫氫酶稱為葡萄糖脫氫酶。它們是來自Toyobo、Kyowa、Amano、Genzyme、Biozyme及其它的商用酶和或者是天然酶或者是通過典型發(fā)酵和/或重組方法產(chǎn)生的重組酶。為了有效果，這種脫氫酶需要輔助因子，例如NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)和它的衍生物、FAD(黃素腺嘌呤二核苷酸)和它的衍生物和PQQ(吡咯并喹啉苯醌)和它的衍生物。
介質(zhì)介質(zhì)典型地用于在葡萄糖反應(yīng)形成相應(yīng)內(nèi)酯后再氧化被還原的脫氫酶-輔助因子。介質(zhì)的例子(美國專利US6,200,773中稱為氫化物提取器)包括硫辛酰胺脫氫酶、PMS(吩嗪硫酸二甲酯)、PES(吩嗪ethosulfate)、DCIP(2，6-dichlorophenolindophenol)和二茂鐵。在電化學(xué)傳感器中一般使用的介質(zhì)是氰鐵酸鹽。
四唑指示劑在美國專利US5,360,595和上面提及的其它專利中廣泛描述了四唑指示劑。美國專利US6,200,773中確定的四唑染料前體被列出作為特別用于與脫氫酶-輔助因子的組合反應(yīng)。其中之一是名為WST-4的四唑化合物，在下面實施例中使用了該化合物。
支持基質(zhì)本發(fā)明的試劑層典型地置于實質(zhì)上無孔的支持基質(zhì)上，典型地聚合物條帶或柄(handle)例如聚酯、聚碳酸酯等。這種條帶具有適于與用于讀取顯現(xiàn)色的儀器一起使用的維度。例如，實施例所述的帶大約為0.060×0.160英寸(1.5×4.1mm)并且厚度約0.002英寸(51μm)。盡管對發(fā)明不是關(guān)鍵性的，不過基質(zhì)優(yōu)選是光學(xué)透明的，并可以含有一個或多個涂層，所述涂層在加工期間用于幫助粘合于其它表面例如試劑承載層。
電化學(xué)方法在電化學(xué)傳感器中，電壓應(yīng)用于與血液(或其它)樣本接觸的電極以產(chǎn)生電流，測量電流且與樣本中的分析物(如葡萄糖)的量相聯(lián)系。電極與固體層接觸，固體層含有氧化樣本中的分析物的酶試劑和再氧化已被還原的酶的介質(zhì)?？赏ㄟ^下述步驟描述反應(yīng)物葡萄糖+酶氧化→酶還原+氧化的葡萄糖(葡糖酸內(nèi)酯)酶還原+n介質(zhì)氧化→n介質(zhì)還原+酶氧化n介質(zhì)氧化→介質(zhì)氧化+ne-其中酶氧化和酶還原是酶氧化還原作用中心的氧化和還原形式，而介質(zhì)氧化和介質(zhì)還原是介質(zhì)的氧化和還原形式。
通常，除了在電化學(xué)傳感器中不需要指示劑外，在電化學(xué)傳感器中使用的反應(yīng)制劑與在光學(xué)方法中使用的相似。
試劑層制劑本發(fā)明的試劑層是單一的非常薄的層，試劑層含有與血液樣本中的葡萄糖反應(yīng)并產(chǎn)生快速均一的響應(yīng)的試劑。試劑層的特征在于自我限定大小的，在試劑層中阻礙大顆粒例如血紅細胞的運動并允許期望組分的移動。它一般可描述為水溶性可膨脹的聚合物基體所述基體含有不溶于水粒子、與葡萄糖反應(yīng)的酶如葡萄糖脫氫酶及其輔助因子、介質(zhì)和使用光學(xué)檢測的指示劑。另外的組分可以包括除垢劑、表面活性劑、和類似物。
聚合物可以包括聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯磺酸鈉、聚丙烯酸膠乳、聚乙二醇、苯乙烯丙烯酸酯和它們的共聚體。通常這種聚合物的特征是具有相對低的分子量，例如100至100000道爾頓，包括低分子量低聚物。這種聚合物在水溶液中具有高溶解度并典型地具有低粘性。它們典型地溶解于維持理想pH如約7.5的緩沖溶液中。聚合物在中性pH溶液如全血中再水合時將會迅速膨脹。相信這種聚合物給試劑提供了分析物(如葡萄糖)的快速通道。
粒子可以包括二氧化鈦、碳酸鈣、膨潤土、二氧化硅、硫酸鋇、粉狀金屬、膠乳和類似物。適合的粒子實質(zhì)上不溶于水且標稱大小約0.05至20μm，但優(yōu)選在1至10μm范圍內(nèi)。粒子不應(yīng)具有允許試劑或樣本組分進行不期望的移動的孔。
除垢劑和表面活性劑可以包括專有材料，例如Silwet L-7600(聚二甲基硅氧烷甲基乙氧基化物)、Gerepon T-77(N-油烯基-N-?；撬峒柞モc)、Zwittergentt 3-12(N-十二烷基-N，N-二甲基-3-胺基-1-丙磺酸鹽)和其它。
其它添加劑可以包括乳化劑、潤濕劑、增稠劑、顏料和相似的添加劑。
在涂層被施用及干燥后，反射粒子與聚合物基體的重量比典型地在約1/2至2/1之間。涂層施用時厚度可以約6至16μm，優(yōu)選約7至10μm。這種涂層比現(xiàn)有技術(shù)中一般所用的涂層薄很多。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)這種薄膜能提供快速穩(wěn)定的響應(yīng)，如下面實施例所說明。
用于光學(xué)方法的測試條的制備如下制備試劑層，將上述組分混合成均一的水性涂層，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知技術(shù)將其施用于基質(zhì)例如照相凹版或Mayer-rod涂層，然后干燥?？梢允褂闷渌繉臃椒?，因為施用涂層的方法不認為是成功要素。
在將涂層施用于基質(zhì)后，用防護頂(protective top)將它覆蓋，所述防護頂優(yōu)選親水性聚酯涂層，其可以是透明或不透明。也可以加另外的不透明層。在反應(yīng)層與防護頂之間放置一粘合層其連接另外兩個層并且還為血液樣本的引入形成毛細管通道。如實施例中所見，本發(fā)明的測試條對毛細管維度不敏感。換句話說，測試條不要求使用確定數(shù)量的(或其它生物液體)。
在下面每個實施例中，所列組分通過將聚合物、緩沖液、粒子、和添加劑混入蒸餾水中先低剪切再高剪切一段時間直至均一混合以制備基料來組合。然后，診斷試劑混入基料中，并且混合的組分施用于如10μm厚涂層的實質(zhì)上無孔的聚碳酸酯或聚酯支持材料的條上。加入具有50或80μm厚度的間隔-粘合劑層3M F9460。最后通過使用轉(zhuǎn)移黏合劑施用親水性聚酯涂層的防護頂(3M 9971)。一片不透明的材料被應(yīng)用于聚酯頂?shù)耐獠恳蕴峁╊~外的小量不透明度。
電化學(xué)傳感器試劑層除光學(xué)指示劑外被應(yīng)用于電極以產(chǎn)生電化學(xué)傳感器，例如美國專利申請US2001/0042683中舉例所述的那些。
實施例1通過混合表A所列組分制備試劑層，如前所述地將它們應(yīng)用于基質(zhì)上，完成測試條的制備。測試條的性能如下測定，將含已知量的葡萄糖的全血小樣本(約600nL)加入試劑層中，將測試條置于小讀取區(qū)(如0.75mm直徑)漫反射系數(shù)測量儀器并讀取超過約60秒時間所顯現(xiàn)的顏色。結(jié)果記錄如K/S，Kubelka-Munk函數(shù)(1-R)2/2R其中R是測量系數(shù)。如圖1a中所見，超過每個葡萄糖濃度檢驗時間，測量的顏色強度保持不變。給出葡萄糖儀表的響應(yīng)所相對應(yīng)的葡萄糖的含量，如圖1b中所示。很明顯響應(yīng)時間是快速的，而且第12秒和第52秒的結(jié)果是非常相似的。因而，能推斷本發(fā)明的測試條可提供快速的響應(yīng)并且不會對讀取時間過度敏感。
表A組分 濃度磷酸鉀，pH7.5 120mm膨潤土(1)0.78％二氧化鈦(2)5％ TiO2聚丙烯酸，鈉鹽(60k)(3)1.0％Gerepon T-77(4)0.45％Silwet L-7600(5)0.10％PEG 8000(6)2.0％WST-4四唑鹽(7)40mMNAD(8)10mM硫辛酰胺脫氫酶(9)1900μ/mL葡萄糖脫氫酶(10)1100μ/mL(1)Rheox，Bentone EW
(2)Sigma-Aldrich，T-8141(3)Polysciences有限公司，18611(4)Pragmatics有限公司(5)OSi Specialties(6)Pragmatics有限公司(7)Dojindo實驗室(8)Calbiochem(9)Unitika，Diaphorase I(10)Amano Enzyme有限公司，Amano 2實施例2通過混合表B所列組分制備另一個試劑層，如前所述地將它們施用于基質(zhì)上，完成測試條的制備。如實施例1所述實施用含已知量的葡萄糖的全血樣本進行一系列的檢驗。檢驗結(jié)果如圖2a-b所示?？捎^察到除了在更高濃度時顯現(xiàn)一些另外的顏色的，顯現(xiàn)的顏色超過60秒時間后基本上不變。
表B組分濃度磷酸鉀，pH7.5 120mm膨潤土(1)0.78％二氧化鈦(2)5.3％ TiO2PSSA(70k)(3)1.8％丙烯酸膠乳(4)3.6％Zwittergent 3-12(5)0.2％WST-4四唑鹽(6)40mmNAD(7)10mm硫辛酰胺脫氫酶(8)1900μ/mL葡萄糖脫氫酶(9)1100μ/mL(1)Rheox，Bentone EW
(2)Sigma-Aldrich，T-8141(3)Polysciences有限公司(4)Dow，UCAR Latex 455(5)Calbiochem(6)Dojindo實驗室(7)Sigma-Aldrich(9)Unitika，Diaphorase I(10)Amano Enzyme有限公司，Amano 2實施例3通過混合表C所列組分制備試劑層，如前所述將它們施用于基質(zhì)上，完成測試條的制備。如實施例1和2所述對試劑層進行檢驗。結(jié)果如圖3a，b，c所示。圖3a和3b記錄的結(jié)果與實施例1和2的結(jié)果相似。圖2a和b中記錄的更高葡萄糖濃度下的另外的顏色顯現(xiàn)沒有出現(xiàn)在本實施例中。
另外的結(jié)果如圖3c所示。測量了具有3個不同血細胞比容(20％，40％，60％)的全血樣本并且繪出結(jié)果。很明顯，本發(fā)明的測試條未受到血液中血紅細胞的濃度顯著影響。
表C組分濃度Hepes，半鈉鹽(1)0.3m膨潤土(2)1.44％二氧化鈦(3)8％ TiO2聚丙烯酸，鈉鹽(60k)(4)3.85％PEG 8000(5)2.0％Rhodasurf-ON870(6)1.0％Gerepon T-77(7)0.6％Silwet L-7600(8)0.08％
WST-4四唑鹽(9)60mmNAD(10)10mm硫辛酰胺脫氫酶(11)1085μ/mL葡萄糖脫氫酶(12)2680μ/mL(1)Research Organics(2)Rheox，Bentone EW(3)Sigma-Aldrich，T-8141(4)Polysciences有限公司(5)Pragmatics有限公司(6)Pragmatics有限公司(7)Pragmatics有限公司(8)OSi Specialties(9)Dojindo實驗室(10)Sigma-Aldrich，#N-6522(11)Unitika，Diaphorase I(12)Toyobo有限公司，#GLD311實施例4通過混合表D所列組分制備試劑層，如前所述的將它們施用于基質(zhì)上完成測試條的制備。如在前實施例所述對得到的測試條進行檢驗。結(jié)果如圖4a，b，c所示。測量的顏色顯現(xiàn)的濃度甚至比在前實施例所見的更濃。就是說，能推斷顏色顯現(xiàn)在最初幾秒內(nèi)就充分地完成了。
圖4c顯示了本發(fā)明的測試條的另一個優(yōu)勢。比較兩個測試條設(shè)計。第一個具有50μm的毛細管間隙，通過該間隙其血液樣本得以進入，同時第二個類型具有80μm的毛細管間隙。圖4c顯示了毛細管間隙高度的差異和產(chǎn)生的樣本體積的變化對結(jié)果沒有顯著影響。這一結(jié)果的原因是不清楚的，但是可歸因于葡萄糖在最初被血液樣本再水合后對從血液樣本進入試劑層的擴散的無能為力。無論如何，這顯示了發(fā)明測試條的一個顯著優(yōu)勢，因為這意味著它們對所施用的血液的量不敏感。
表D組分 濃度磷酸鈉，pH7.40.25mm聚丙烯酸(60k)(1)6％聚乙烯醇(6k)(2)6％TiO2(3)15％CaCO3(4)10％Gerepon T-77(5)0.6％Surfonyl DF37(6)0.5％Silwet L-7600(7)0.1％WST-4四唑鹽(8)100mMNAD(9)19mM硫辛酰胺脫氫酶(10)1800μ/mL葡萄糖脫氫酶(11)4020μ/mL(1)Polysciences有限公司(2)Polysciences有限公司(3)DuPont，R-706(4)Huber有限公司，40ptifil□(5)Pragmatics有限公司(6)Air Products and Chemicals有限公司(7)OSi Specialties(8)Dojindo實驗室(9)Sigma-Aldrich，#N-6522(10)Unitika，Diaphorase I(11)Toyobo有限公司，#GLD311替選實施方案A
一種用于測量生物液體中的分析物的量的反應(yīng)制劑，包括(a)水溶性可膨脹的聚合物基體；(b)標稱大小約0.05至20μm的水不溶性粒子；(c)與所述分析物反應(yīng)的酶體系；和其中所述水不溶性粒子與所述水溶性可膨脹的聚合物基體的重量比是約1/2至2/1。
替選實施方案B替選實施方案A的反應(yīng)制劑，其中所述酶體系與葡萄糖、乳酸鹽、膽固醇、甘油三酯、游離脂肪酸、膽紅素、抗壞血酸、過氧化氫和尿酸中的一種反應(yīng)。
替選實施方案C替選實施方案A的反應(yīng)制劑，其中所述分析物是葡萄糖并且酶體系包括己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、葡萄糖脫氫酶-PQQ和葡萄糖氧化酶中的一種。
替選實施方案D替選實施方案A的反應(yīng)制劑，其中所述粒子是二氧化鈦、碳酸鈣、二氧化硅、硫酸鋇、粉狀金屬和膠乳中的至少一種。
替選實施方案E替選實施方案A的反應(yīng)制劑，其中所述水溶性可膨脹的聚合物基體包括聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯磺酸鈉、聚丙烯酸膠乳、聚乙二醇、苯乙烯丙烯酸酯、和它們的共聚體中的至少一種。
替選實施方案F替選實施方案A的反應(yīng)制劑，進一步包括至少一種表面活性劑、除垢劑或增稠劑。
替選實施方案G替選實施方案A的反應(yīng)制劑，用作厚度約6至16μm的涂層。
替選實施方案H替選實施方案G的反應(yīng)制劑，其中所述涂層厚度約7至10μm。
替選實施方案I
替選實施方案A的反應(yīng)制劑，其中所述水溶性可膨脹聚合物的分子量低于約100000。
替選實施方案J替選實施方案A的反應(yīng)制劑，其中所述水不溶性粒子標稱大小約1至10μm。
替選處理K通過將所述生物液體樣本施加于測試條或電化學(xué)傳感器以獲得快速穩(wěn)定的、對所述樣本量不敏感的響應(yīng)的測量生物液體中的分析物的量的方法，所述方法包括(a)將所述生物液體樣本施加于所述測試條或電化學(xué)傳感器，所述測試條或電化學(xué)傳感器包括無孔基質(zhì)，無孔基質(zhì)上沉積了含在制劑中的用于與所述分析物反應(yīng)的酶體系的薄膜，其中所述制劑包括水溶性可膨脹的聚合物基體及標稱大小約0.05至20μm的水不溶性粒子；和(b)通過光學(xué)或電化學(xué)方法測量所述樣本對所述酶體系的響應(yīng)，并測定所述生物液體中存在的所述分析物的量。
替選處理L替選處理K的方法，其中所述分析物是葡萄糖，且所述生物液體是全血。
替選處理M替選處理L的方法，其中所述酶體系包括葡萄糖氧化酶或葡萄糖脫氫酶。
替選處理N替選處理K的方法，其中所述薄膜厚度約6至16μm。
替選處理O替選處理N的方法，其中所述薄膜厚度約7至10μm。
替選處理P替選處理K的方法，其中所述粒子與所述聚合物基體的重量比是約1/2至2/1。
替選處理Q替選處理K的方法，其中所述水溶性可膨脹的聚合物基體包括聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯磺酸鈉、聚丙烯酸膠乳、聚乙二醇、苯乙烯丙烯酸酯、和它們的共聚體中的至少一種。
替選處理R替選處理K的方法，其中所述粒子包括二氧化鈦、碳酸鈣、二氧化硅、硫酸鋇、粉狀金屬和膠乳中的至少一種。
替選處理S替選處理K的方法，其中所述可膨脹聚合物的分子量低于約100000。
替選處理T替選處理K的方法，其中所述不溶粒子標稱大小約1至10μm。
替選實施方案U一種用于測量全血中的葡萄糖含量的反應(yīng)制劑，包括(a)水溶性可膨脹的聚合物基體；(b)標稱大小約0.05至20μm的水不溶性粒子；(c)用于氧化所述葡萄糖的酶體系；(d)指示劑；其中(b)中反射粒子與聚合物基體的重量比是約1/2至2/1。
替選實施方案V替選實施方案U的反應(yīng)制劑，其中所述酶體系包括己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、葡萄糖脫氫酶-PQQ和葡萄糖氧化酶中的一種。
替選實施方案W替選實施方案U的反應(yīng)制劑，其中所述酶體系包括葡萄糖脫氫酶、所述葡萄糖脫氫酶的輔助因子、四唑鹽指示劑和介質(zhì)。
替選實施方案X替選實施方案U的反應(yīng)制劑，其中所述粒子是二氧化鈦、碳酸鈣、二氧化硅、硫酸鋇、粉狀金屬和膠乳中的至少一種。
替選實施方案Y替選實施方案U的反應(yīng)制劑，其中所述水溶性可膨脹的聚合物基體包括聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯磺酸鈉、聚丙烯酸膠乳、聚乙二醇、苯乙烯丙烯酸酯和其共聚體中的至少一種。
替選實施方案Z替選實施方案U的反應(yīng)制劑，其中所述水溶性可膨脹聚合物溶于經(jīng)緩沖以維持理想pH的溶液中。
替選實施方案AA替選實施方案U的反應(yīng)制劑，進一步包括至少一種表面活性劑、除垢劑或增稠劑。
替選實施方案BB替選實施方案U的反應(yīng)制劑，用作厚度約6至16μm的涂層。
替選實施方案CC替選實施方案BB的反應(yīng)制劑，其中所述涂層厚度約7至10μm。
替選實施方案DD替選實施方案U的反應(yīng)制劑，其中所述水溶性可膨脹聚合物的分子量低于約100000。
替選實施方案EE替選實施方案U的反應(yīng)制劑，其中所述不溶粒子標稱大小約1至10μm。
替選實施方案FF一種用于測量全血樣本中的葡萄糖的含量的測試條，包括(a)實質(zhì)上無孔的基質(zhì)；(b)置于所述基質(zhì)上的試劑層，所述試劑層包括(1)水溶性可膨脹的聚合物基體，(2)標稱大小約0.05至20μm的水不溶性粒子，(3)用于氧化所述葡萄糖的酶體系，和(4)指示劑；(c)用于(b)中所述試劑層的防護層；
(d)在所述試劑層和所述防護層之間的粘合層，所述粘合層具有接受所述血液樣本的毛細管通道。
替選實施方案GG替選實施方案FF的測試條，其中所述酶體系包括己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、葡萄糖脫氫酶-PQQ和葡萄糖氧化酶中的一種。
替選實施方案HH替選實施方案FF的測試條，其中所述酶體系包括葡萄糖脫氫酶、所述葡萄糖脫氫酶的輔助因子、四唑鹽指示劑和介質(zhì)。
替選實施方案II替選實施方案FF的測試條，其中所述水溶性可膨脹的聚合物基體是聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯磺酸鈉、聚丙烯酸膠乳、聚乙二醇、苯乙烯丙烯酸酯和其共聚體中的至少一種。
替選實施方案JJ替選實施方案FF的測試條，其中所述水不溶性粒子是二氧化鈦、碳酸鈣、二氧化硅、硫酸鋇、粉狀金屬和膠乳中的至少一種。
替選實施方案KK替選實施方案FF的測試條，其中b(2)中的反射粒子與b(1)中聚合物基體的重量比是約1/2至2/1。
替選實施方案LL替選實施方案FF的測試條，其中所述聚合物溶于經(jīng)緩沖以維持理想pH的溶液中。
替選實施方案MM替選實施方案FF的測試條，其中所述試劑層(b)中進一步包括至少一種表面活性劑、除垢劑或增稠劑。
替選實施方案NN替選實施方案MM的測試條，其中所述試劑層厚度約6至16μm。
替選實施方案OO替選實施方案NN的測試條，其中所述試劑層厚度約7至10μm。
替選實施方案PP替選實施方案FF的測試條，其中所述可膨脹聚合物的分子量低于約100000。
替選實施方案QQ替選實施方案FF的測試條，其中所述粒子標稱大小約1至10μm。
替選處理RR一種測量全血樣本中的葡萄糖的量的方法，其通過將血液樣本施加于測試條以獲得快速穩(wěn)定且對血液樣本量不敏感的響應(yīng)，所述方法包括(a)將所述血液樣本施加于所述測試條，所述測試條包括無孔基質(zhì)，無孔基質(zhì)上沉積了含在制劑中的用于與所述葡萄糖反應(yīng)的酶體系的薄膜，其中的制劑包括水溶性可膨脹的聚合物基體、標稱大小約0.05至20μm的水不溶性粒子、及指示劑；和(b)測量所述指示劑的響應(yīng)，并測定所述血液樣本中所述葡萄糖的量。
替選處理SS替選處理RR的方法，其中所述酶體系包括葡萄糖氧化酶或葡萄糖脫氫酶。
替選處理TT替選處理RR的方法，其中所述薄膜厚度約6至16μm。
替選處理UU替選處理TT的方法，其中所述薄膜厚度約7至10μm。
替選處理VV替選處理TT的方法，其中所述粒子與所述基體的重量比是約1/2至2/1。
替選處理WW替選處理RR的方法，其中粒子標稱大小約1至10μm。
替選處理XX替選處理RR的方法，其中所述水溶性可膨脹的聚合物基體包括聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯磺酸鈉、聚丙烯酸膠乳、聚乙二醇、苯乙烯丙烯酸酯和其共聚體中的至少一種。
替選處理YY替選處理RR的方法，其中所述粒子是二氧化鈦、碳酸鈣、二氧化硅、硫酸鋇、粉狀金屬和膠乳中的至少一種。
替選處理ZZ替選處理RR的方法，其中所述水溶性可膨脹聚合物的分子量低于約100000。
權(quán)利要求
1.一種用于測量生物液體中的分析物的量的反應(yīng)制劑，包括(a)水溶性可膨脹的聚合物基體；(b)標稱大小約0.05至20μm的水不溶性粒子；(c)與所述分析物反應(yīng)的酶體系；和其中所述水不溶性粒子與所述水溶性可膨脹的聚合物基體的重量比是約1/2至2/1。
2.如權(quán)利要求1所述的反應(yīng)制劑，其中所述酶體系配制成與葡萄糖、乳酸鹽、膽固醇、甘油三酯、游離脂肪酸、膽紅素、抗壞血酸、過氧化氫和尿酸中的成員反應(yīng)。
3.如權(quán)利要求1所述的反應(yīng)制劑，其中所述分析物是葡萄糖，并且所述酶體系包括己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、葡萄糖脫氫酶-PQQ和葡萄糖氧化酶中的成員。
4.如權(quán)利要求1所述的反應(yīng)制劑，其中所述粒子是二氧化鈦、碳酸鈣、二氧化硅、硫酸鋇、粉狀金屬和膠乳中的至少一種。
5.如權(quán)利要求1所述的反應(yīng)制劑，其中所述水溶性可膨脹的聚合物基體包括聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯磺酸鈉、聚丙烯酸膠乳、聚乙二醇、苯乙烯丙烯酸酯和它們的共聚體中的至少一種。
6.如權(quán)利要求1所述的反應(yīng)制劑，進一步包括至少一種表面活性劑、除垢劑或增稠劑。
7.如權(quán)利要求1所述的反應(yīng)制劑，用作厚度約6至16μm的涂層。
8.如權(quán)利要求7所述的反應(yīng)制劑，其中所述涂層厚度約7至10μm。
9.如權(quán)利要求1所述的反應(yīng)制劑，其中所述水溶性可膨脹聚合物的分子量低于約100000。
10.如權(quán)利要求1所述的反應(yīng)制劑，其中所述水不溶性粒子標稱大小約1至10μm。
11.通過將生物液體樣本施加于測試條或電化學(xué)傳感器上并獲得快速穩(wěn)定且對所述樣本量不敏感的響應(yīng)來測量所述生物液體中的分析物的量的方法，所述方法包括(a)將所述生物液體樣本施加于所述測試條或電化學(xué)傳感器上，所述測試條或電化學(xué)傳感器包括無孔基質(zhì)，無孔基質(zhì)上沉積了含在制劑中的用于與所述分析物反應(yīng)的酶體系的薄膜，所述制劑包括水溶性可膨脹的聚合物基體及標稱大小約0.05至20μm的水不溶性粒子；和(b)通過光學(xué)或電化學(xué)方法測量所述樣本對所述酶體系的響應(yīng)，并測定所述生物液體中存在的所述分析物的量。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的分析物是葡萄糖，且所述的生物液體是全血。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述酶體系包括葡萄糖氧化酶或葡萄糖脫氫酶。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述薄膜厚度約6至16μm。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述薄膜厚度約7至10μm。
16.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述粒子與所述聚合物基體的重量比是約1/2至2/1。
17.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述水溶性可膨脹的聚合物基體包括聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯磺酸鈉、聚丙烯酸膠乳、聚乙二醇、苯乙烯丙烯酸酯和它們的共聚體中的至少一種。
18.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述粒子包括二氧化鈦、碳酸鈣、二氧化硅、硫酸鋇、粉狀金屬和膠乳中的至少一種。
19.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述可膨脹聚合物的分子量低于約100000。
20.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述不溶粒子標稱大小約1至10μm。
21.一種用于測量全血中的葡萄糖含量的反應(yīng)制劑，包括(a)水溶性可膨脹的聚合物基體；(b)標稱大小約0.05至20μm的水不溶性粒子；(c)用于氧化所述葡萄糖的酶體系；(d)指示劑；其中(b)中的反射粒子與聚合物基體的重量比是約1/2至2/1。
22.如權(quán)利要求21所述的反應(yīng)制劑，其中所述酶體系包括己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、葡萄糖脫氫酶-PQQ和葡萄糖氧化酶中的一種。
23.如權(quán)利要求21所述的反應(yīng)制劑，其中所述酶體系含有葡萄糖脫氫酶、所述葡萄糖脫氫酶的輔助因子、四唑鹽指示劑和介質(zhì)。
24.如權(quán)利要求21所述的反應(yīng)制劑，其中所述粒子是二氧化鈦、碳酸鈣、二氧化硅、硫酸鋇、粉狀金屬和膠乳中的至少一種。
25.如權(quán)利要求21所述的反應(yīng)制劑，其中所述水溶性可膨脹的聚合物基體包括聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯磺酸鈉、聚丙烯酸膠乳、聚乙二醇、苯乙烯丙烯酸酯和其共聚體中的至少一種。
26.如權(quán)利要求21所述的反應(yīng)制劑，其中所述水溶性可膨脹聚合物溶于經(jīng)緩沖以維持理想pH的溶液中。
27.如權(quán)利要求21所述的反應(yīng)制劑，進一步包括至少一種表面活性劑、除垢劑或增稠劑。
28.如權(quán)利要求21所述的反應(yīng)制劑，用作厚度約6至16μm的涂層。
29.如權(quán)利要求28所述的反應(yīng)制劑，其中所述涂層厚度約7至10μm。
30.如權(quán)利要求21所述的反應(yīng)制劑，其中所述水溶性可膨脹聚合物的分子量低于約100000。
31.如權(quán)利要求21所述的反應(yīng)制劑，其中所述不溶粒子標稱大小約1至10μm。
32.一種用于測量全血樣本中葡萄糖含量的測試條，包括(a)實質(zhì)上無孔的基質(zhì)；(b)置于所述基質(zhì)上的試劑層，所述試劑層包括(1)水溶性可膨脹的聚合物基體，(2)標稱大小約0.05至20μm的水不溶性粒子，(3)用于氧化所述葡萄糖的酶體系，和(4)指示劑；(c)用于(b)中所述試劑層的防護層；(d)在所述試劑層和所述防護層之間的粘合層，所述粘合層具有接受所述血液樣本的毛細管通道。
33.如權(quán)利要求32所述的測試條，其中所述酶體系包括己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、葡萄糖脫氫酶-PQQ和葡萄糖氧化酶中的成員。
34.如權(quán)利要求32所述的測試條，其中所述酶體系含有葡萄糖脫氫酶、所述葡萄糖脫氫酶的輔助因子、四唑鹽指示劑和介質(zhì)。
35.如權(quán)利要求32所述的測試條，其中所述水溶性可膨脹的聚合物基體是聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯磺酸鈉、聚丙烯酸膠乳、聚乙二醇、苯乙烯丙烯酸酯和其共聚體中的至少一種。
36.如權(quán)利要求32所述的測試條，其中所述水不溶性粒子是二氧化鈦、碳酸鈣、二氧化硅、硫酸鋇、粉狀金屬和膠乳中的至少一種。
37.如權(quán)利要求32所述的測試條，其中b(2)中反射粒子與b(1)中聚合物基體的重量比是約1/2至2/1。
38.如權(quán)利要求32所述的測試條，其中所述聚合物溶于經(jīng)緩沖以維持理想pH的溶液中。
39.如權(quán)利要求32所述的測試條，其中所述試劑層(b)中進一步包括至少一種表面活性劑、除垢劑或增稠劑。
40.如權(quán)利要求39所述的測試條，其中所述試劑層厚度約6至16μm。
41.如權(quán)利要求40所述的測試條，其中所述試劑層厚度約7至10μm。
42.如權(quán)利要求32所述的測試條，其中所述可膨脹聚合物的分子量低于約100000。
43.如權(quán)利要求32所述的測試條，其中所述粒子標稱大小約1至10μm。
44.通過將血液樣本施加于測試條上并獲得快速穩(wěn)定的且對血液樣本量不敏感的響應(yīng)來測量全血樣本中的葡萄糖的量的方法，所述方法包括(a)將所述血液樣本施加于所述測試條上，所述測試條包括無孔基質(zhì)，無孔基質(zhì)上沉積了含在制劑中的用于與所述葡萄糖反應(yīng)的酶體系的薄膜，所述的制劑包括水溶性可膨脹的聚合物基體、標稱大小約0.05至20μm的水不溶性粒子及指示劑；和(b)測量所述指示劑的響應(yīng)，并測定所述血液樣本中所述葡萄糖的量。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述酶體系包括葡萄糖氧化酶或葡萄糖脫氫酶。
46.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述薄膜厚度約6至16μm。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其中所述薄膜厚度約7至10μm。
48.如權(quán)利要求46所述的方法，其中所述粒子與所述基體的重量比是約1/2至2/1。
49.如權(quán)利要求44所述的方法，其中粒子標稱大小約1至10μm。
50.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述水溶性可膨脹的聚合物基體包括聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯磺酸鈉、聚丙烯酸膠乳、聚乙二醇、苯乙烯丙烯酸酯和其共聚體中的至少一種。
51.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述粒子是二氧化鈦、碳酸鈣、二氧化硅、硫酸鋇、粉狀金屬和膠乳中的至少一種。
52.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述水溶性可膨脹聚合物的分子量低于約100000。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于測量生物液體中的分析物的量如全血中的葡萄糖含量的測試條或電化學(xué)傳感器，其包括有使用了用于與分析物反應(yīng)的酶體系的自我限定大小的試劑制劑，所述反應(yīng)體系混合到含標稱大小約0.05至20μm，優(yōu)選約1至10μm的不溶于水的小粒子的水溶性可膨脹的聚合物基體中，其中水不溶性粒子與水溶性可膨脹的聚合物基體的重量比是約1/2至2/1，且所述試劑制劑沉積在無孔基質(zhì)上以形成約6至16μm厚的薄層，以提供對應(yīng)用的樣本產(chǎn)生快速穩(wěn)定且對樣本量不敏感的響應(yīng)。
文檔編號C12Q1/28GK101076601SQ200580042703
公開日2007年11月21日 申請日期2005年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月13日
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