專利名稱：使用生物標(biāo)志的測(cè)定法和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本文所述的發(fā)明涉及用于檢測(cè)可預(yù)示哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)Apo2L/TRAIL和/或死亡受體激動(dòng)劑抗體的敏感性的生物標(biāo)志的方法和測(cè)定法。
背景技術(shù)：
本技術(shù)領(lǐng)域中已鑒定了多種屬于腫瘤壞死因子(TNF)超家族的配體和受體。這樣的配體包括腫瘤壞死因子α(“TNF-α”)、腫瘤壞死因子β(“TNF-β”或“淋巴毒素-α”)、淋巴毒素-β(“LT-β”)，CD30配體，CD27配體，CD40配體，OX-40配體，4-1BB配體，LIGHT，Apo-1配體(也稱Fas配體或CD95配體)，Apo-2配體(也稱Apo2L或TRAIL)，Apo-3配體(也稱TWEAK)，APRIL，OPG配體(也稱RANK配體，ODF，或TRANCE)，和TALL-1(也稱BlyS，BAFF或THANK)(參考例如Ashkenazi，Nature Review，2420-430(2002)；Ashkenazi和Dixit，Science，2811305-1308(1998)；Ashkenazi和Dixit，Curr.Opin.Cell Biol.，11255-260(2000)；Golstein，Curr.Biol.，7750-753(1997)Wallach，Cytokine Reference，Academic Press，2000，377-411頁(yè)；Locksley等人，Cell，104487-501(2001)；Gruss和Dower，Blood，853378-3404(1995)；Schmid等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，831881(1986)；Dealtry等人，Eur.J.Immunol.，17689(1987)；Pitti等人，J.Biol.Chem.，27112687-12690(1996)；Wiley等人，Immunity，3673-682(1995)；Browning等人，Cell，72847-856(1993)；Armitage等人Nature，35780-82(1992)；公開(kāi)于1997年1月16日的WO97/01633；公開(kāi)于1997年7月17日的WO97/25428，Marsters等人，Curr.Biol.，8525-528(1998)；Chicheportiche等人，Biol.Chem.，27232401-32410(1997)；Hahne等人，J.Exp.Med.，1881185-1190(1998)；1998年7月2日公開(kāi)的WO98/28426；1998年10月22日公開(kāi)的WO98/46751；1998年5月7日公開(kāi)的WO/98/18921；Moore等人，Science，285260-263(1999)；Shu等人，J.Leukocyte Biol.，65680(1999)；Schneider等人，J.Exp.Med.，1891747-1756(1999)；Mukhopadhyay等人，J.Biol.Chem.，27415978-15981(1999))。
由這樣的TNF家族配體所介導(dǎo)的多種細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)，典型地是由它們與特定的細(xì)胞受體的結(jié)合所引發(fā)的。某些，但不是所有的TNF家族配體結(jié)合細(xì)胞表面的“死亡受體”并通過(guò)其誘發(fā)多種生物活性，以活化胱天蛋白酶(caspases)或執(zhí)行細(xì)胞死亡或凋亡途徑的酶(Salvesen等人，Cell，91443-446(1997))。目前已鑒定的TNF受體超家族成員包括TNFR1，TNFR2，TACI，GITR，CD27，OX-40，CD30，CD40，HVEM，F(xiàn)as(也稱Apo-1或CD95)，DR4(也稱TRAIL-R1)，DR5(也稱Apo-2或TRAIL-R2)，DcR1，DcR2，護(hù)骨蛋白(OPG)，RANK和Apo-3(也稱DR3或TRAMP)(參見(jiàn)例如，Ashkenazi，Nature Reviews，2420-430(2002)；Ashkenazi和Dixit，Science，2811305-1308(1998)；Ashkenazi和Dixit，Curr.Opin.Cell Biol.，11255-260(2000)；Golstein，Curr.Biol.，7750-753(1997)Wallach，CytokineReference，Academic Press，2000，377-411頁(yè)；Locksley等人，Cell，104487-501(2001)；Gruss和Dower，Blood，853378-3404(1995)；Hohman等人，J.Biol.Chem.，26414927-14934(1989)；Brockhaus等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，873127-3131(1990)；1991年3月20日公開(kāi)的EP417,563；Loetscher等人，Cell，61351(1990)；Schall等人，Cell，61361(1990)；Smith等人，Science，2481019-1023(1990)；Lewis等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，882830-2834(1991)；Goodwin等人，Mol.Cell.Biol.，113020-3026(1991)；Stamenkovic等人，EMBO J.，81403-1410(1989)；Mallett等人，EMBO J.，91063-1068(1990)；Anderson等人，Nature，390175-179(1997)；Chicheportiche等人，J.Biol.Chem.，27232401-32410(1997)；Pan等人，Science，276111-113(1997)；Pan等人，Science，277815-818(1997)；Sheridan等人，Science，277818-821(1997)；Degli-Esposti等人，J.Exp.Med.，1861165-1170(1997)；Marsters等人，Curr.Biol.，71003-1006(1997)；Tsuda等人，BBRC，234137-142(1997)；Nocentini等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，946216-6221(1997)；vonBulow等人，Science，278138-141(1997))。
上述的TNF受體家族成員大部分具有共同的細(xì)胞表面受體典型結(jié)構(gòu)，包括胞外、跨膜和胞內(nèi)區(qū)，而其它的成員則天然地作為缺少跨膜和胞內(nèi)區(qū)的可溶性蛋白出現(xiàn)。典型的TNFR的胞外部分含有從NH2末端開(kāi)始的多個(gè)富半胱氨酸域(CRD)的重復(fù)氨基酸序列模式。
稱為Apo-2L或TRAIL的配體是在數(shù)年前作為TNF細(xì)胞因子家族的成員被鑒定的(參見(jiàn)例如，Wiley等人，Immunity，3673-682(1995)；Pitti等人，J.Biol.Chem.，27112697-12690(1996)；WO97/01633；WO97/25428；1998年6月9日授權(quán)的美國(guó)專利5,763,223；2001年9月4日授權(quán)的美國(guó)專利6,284,236)。全長(zhǎng)天然序列的人Apo2L/TRAIL多肽是281個(gè)氨基酸長(zhǎng)的II型跨膜蛋白。某些細(xì)胞通過(guò)酶切割這種多肽的胞外區(qū)(Mariani等人，J.Cell.Biol.，137221-229(1997))可以產(chǎn)生天然可溶形式的該多肽。對(duì)可溶形式的Apo2L/TRAIL的晶體學(xué)研究揭示了與TNF和其它相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)類似的同源三聚體結(jié)構(gòu)的存在(Hymowitz等人，Molec.Cell，4563-571(1999)；Cha等人，Immunity，11253-261(1999)；Mongkolsapaya等人，NatureStructural Biology，61048(1999)；Hymowitz等人，Biochemistry，39633-644(2000))。但是與其它TNF家族成員不同，Apo2L/TRAIL被發(fā)現(xiàn)具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征，即三個(gè)半胱氨酸殘基(在同源三聚體中每個(gè)亞基的第230位)共同與一個(gè)鋅原子配位，且鋅結(jié)合對(duì)三聚體的穩(wěn)定性和生物活性是重要的(Hymowitz等人，同上；Bodmer等人，J.Biol.Chem.，27520632-20637(2000))。
文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道，Apo2L/TRAIL可能在免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)，包括自身免疫疾病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中起作用[參見(jiàn)例如，Thomas等人，J.Immunol.，1612195-2200(1998)；Johnsen等人，Cytokine，11664-672(1999)；Griffith等人，J.Exp.Med.，1891343-1353(1999)；Song等人，J.Exp.Med.，1911095-1103(2000)]。
可溶性形式的Apo2L/TRAIL也被報(bào)道在多種癌細(xì)胞中，包括結(jié)腸、肺、乳腺、前列腺、膀胱、腎、卵巢和腦腫瘤，以及黑色素瘤、白血病和多發(fā)性骨髓瘤中誘導(dǎo)凋亡(參見(jiàn)例如，Wiley等人，同上；Pitti等人，同上；2000年2月29日授權(quán)的美國(guó)專利6,030,945；2004年6月8日授權(quán)的美國(guó)專利6,746,668；Rieger等人，F(xiàn)EBS Letters，427124-128(1998)；Ashkenazi等人，J.Clin.Invest.，104155-162(1999)；Walczak等人，Nature Med.，5157-163(1999)；Keane等人，Cancer Research，59734-741(1999)；Mizutani等人，Clin.Cancer Res.，52605-2612(1999)；Gazitt，Leukemia，131817-1824(1999)；Yu等人，Cancer Res.，602384-2389(2000)；Chinnaiyan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，971754-1759(2000))。在鼠腫瘤模型中進(jìn)行的體內(nèi)研究進(jìn)一步提示，Apo2L/TRAIL單獨(dú)地或與化學(xué)治療或放射治療組合使用時(shí)可產(chǎn)生顯著的抗腫瘤作用(參見(jiàn)例如，Ashkenazi等人，同上；Walzcak等人，同上；Gliniak等人，Cancer Res.，596153-6158(1999)；Chinnaiyan等人，同上；Roth等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.，2651999(1999)；PCT申請(qǐng)US/00/15512；PCT申請(qǐng)US/01/23691)。與多種腫瘤細(xì)胞相反，大多數(shù)正常的人細(xì)胞種類似乎對(duì)某些重組形式的Apo2L/TRAIL的凋亡誘導(dǎo)具有抗性(Ashkenazi等人，同上；Walzcak等人，同上)。Jo等人報(bào)道，一種帶多組氨酸標(biāo)簽的可溶形式的Apo2L/TRAIL在體外誘導(dǎo)了正常的分離的人類而不是非人類肝細(xì)胞的凋亡(Jo等人，Nature Med.，6564-567(2000)；另參見(jiàn)Nagata，NatureMed.，6502-503(2000))。人們認(rèn)為特定的重組Apo2L/TRAIL制備物在生化性質(zhì)或相對(duì)正常細(xì)胞對(duì)疾病細(xì)胞的生物活性方面可能有變化，這依賴于例如標(biāo)簽分子的存在或缺失，鋅含量，和％三聚體含量(參見(jiàn)，Lawrence等人，Nature Med.，Letter to the Editor，7383-385(2001)；Qin等人，Nature Med.，Letter to the Editor，7385-386(2001))。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Apo2L/TRAIL與至少5種不同的受體結(jié)合。結(jié)合Apo2L/TRAIL的受體中的至少兩種含有功能性的胞質(zhì)死亡域(deathdomain)。一種這樣的受體被稱為“DR4”(或者TR4或TRAIL-R1)(Pan等人，Science，276111-113(1997)；另見(jiàn)1998年7月30日公開(kāi)的WO98/32856；1999年7月29日公開(kāi)的WO99/37684；2000年12月7日公開(kāi)的WO00/73349；2002年8月13日授權(quán)的US6,433,147；2002年10月8日授權(quán)的US6,461,823，和2002年1月29日授權(quán)的US6,342,383)。
另一種這樣的Apo2L/TRAIL受體被稱為DR5(其也被稱為Apo-2；TRAIL-R或TRAIL-R2，TR6，Tango-63，hAPO8，TRICK2或KILLER)(參見(jiàn)例如，Sheridan等人，Science，277818-821(1997)，Pan等人，Science，277815-818(1997)，1998年11月19日公開(kāi)的WO98/51793；1998年9月24日公開(kāi)的WO98/41629；Screaton等人，Curr.Biol.，7693-696(1997)；Walczak等人，EMBO J.，165386-5387(1997)；Wu等人，Nature Genetics，17141-143(1997)；1998年8月20日公開(kāi)的WO98/35986；1998年10月14日公開(kāi)的EP870,827；1998年10月22日公開(kāi)的WO98/46643；1999年1月21日公開(kāi)的WO99/02653；1999年2月25日公開(kāi)的WO99/09165；1999年3月11日公開(kāi)的WO99/11791；2002年8月13日公開(kāi)的US2002/0072091；2001年12月7日公開(kāi)的US2002/0098550；2001年12月6日授權(quán)的US6,313,269；2001年8月2日公開(kāi)的US2001/0010924；2003年7月3日公開(kāi)的US2003/01255540；2002年10月31日公開(kāi)的US2002/0160446，2002年4月25日公開(kāi)的US2002/0048785；2002年2月授權(quán)的US6,342,369；2003年5月27日授權(quán)的US6,569,642，2000年6月6日授權(quán)的US6,072,047，2003年11月4日授權(quán)的US6,642,358；2004年6月1日授權(quán)的IS6,743,625)。和DR4類似，DR5被報(bào)道含有胞質(zhì)死亡域，并能夠在結(jié)合配體時(shí)(或結(jié)合模擬該配體的活性的分子，例如激動(dòng)劑抗體(agonist antibody)時(shí))傳遞凋亡信號(hào)。Hymowitz等人，Molecular Cell，4563-571(1999)描述了Apo-2L/TRAIL和DR5之間形成的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。
在配體結(jié)合時(shí)，DR4和DR5都可獨(dú)立地通過(guò)稱為FADD/Mort1的含死亡域的銜接分子募集并活化凋亡起始因子(apoptosis initiator)胱天蛋白酶-8，從而引發(fā)凋亡[Kischkel等人，Immunity，12611-620(2000)；Sprick等人，Immunity，12599-609(2000)；Bodmer等人，Nature Cell Biol.，2241-243(2000)]。
據(jù)報(bào)道Apo2L/TRAIL還結(jié)合被稱為DcR1，DcR2和OPG的受體，這些受體被認(rèn)為起信號(hào)傳遞的抑制物而非轉(zhuǎn)導(dǎo)物(transducers)的作用(參見(jiàn)例如DCR1(也稱TRID，LIT或TRAIL-R3)[Pan等人，Science，276111-113(1997)；Sheridan等人，Science，277818-821(1997)；McFarlane等人，J.Biol.Chem.，27225417-25420(1997)；Schneider等人，F(xiàn)EBS Letters，416329-334(1997)；Degli-Esposti等人，J.Exp.Med.，1861165-1170(1997)；及Mongkolsapaya等人，J.Immunol.，1603-6(1998)；DCR2(又稱TRUNDD或TRAIL-R4)[Marsters等人，Curr.Biol.，71003-1006(1997)；Pan等人，F(xiàn)EBS Letters，42441-45(1998)；Degli-Esposti等人，Immunity，7813-820(1997)]，和OPG[Simonet等人，同上]。與DR4和DR5相反，DcR1和DcR2受體不傳遞凋亡信號(hào)。
文獻(xiàn)中報(bào)道了某些結(jié)合DR4和/或DR5受體的抗體。例如，針對(duì)DR4受體且在某些哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有激動(dòng)或凋亡活性的抗DR4抗體在例如1999年7月29日公開(kāi)的WO99/37684；2000年7月12日公開(kāi)的WO00/73349；2000年7月12日公開(kāi)的WO03/066661中有記載。還參見(jiàn)例如Griffith等人，J.Immunol.，1622597-2605(1999)；Chuntharapai等人，J.Immunol.，1664891-4898(2001)；2002年12月2日公開(kāi)的WO02/097033；2003年5月22日公開(kāi)的WO03/042367；2003年5月8日公開(kāi)的WO03/038043；2003年5月8日公開(kāi)的WO03/037913。同樣，某些抗DR5抗體也已被描述，參見(jiàn)例如，1998年11月8日公開(kāi)的WO98/51793；Griffith等人，J.Immunol.，1622597-2605(1999)；Ichikawa等人，Nature Med.，7954-960(2001)；Hylander等人，“An Antibody to DR5(TRAIL-receptor2)Suppresses the Growth of Patient Derived Gastrointestinal Tumors Grown inSCID mice”，摘要，2d International Congress on Monoclonal Antibodies inCancers，2002年8月29日至9月1日，Banff，Alberta，加拿大；2003年5月8日公開(kāi)的WO03/038043；2003年5月8日公開(kāi)的WO03/037913。另外，還描述了某些與DR4和DR5受體有交叉反應(yīng)性的抗體(參見(jiàn)例如，2001年6月26日授權(quán)的美國(guó)專利6,252,050)。
某些哺乳動(dòng)物細(xì)胞的瘤性轉(zhuǎn)化在特定情況下與唾液酰Lewis A和唾液酰Lewis X抗原的表達(dá)的特征性改變相關(guān)聯(lián)。相對(duì)高量的唾液酰Lewis A/X在例如某些人類結(jié)腸、胰腺和胃的腺癌中出現(xiàn)，而且使用針對(duì)這些抗原上的糖結(jié)構(gòu)的抗體的測(cè)定法已經(jīng)被用作胰腺和胃腸癌的檢測(cè)手段(參見(jiàn)例如，Ugorski等人，Acta Biochimica Polonica，492303-311(2002))。這些糖類腫瘤標(biāo)志的表達(dá)水平也已經(jīng)和臨床結(jié)果、患者存活時(shí)間和轉(zhuǎn)移性疾病的指標(biāo)相互關(guān)聯(lián)起來(lái)。
唾液酰Lewis A和唾液酰Lewis X都已被證明與一類糖結(jié)合蛋白家族結(jié)合，這類蛋白稱為選擇素，與細(xì)胞從血流外滲有關(guān)。一些報(bào)道提出唾液酰Lewis A和X是E-選擇素的配體，而且可能負(fù)責(zé)人癌細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮的黏著。呈現(xiàn)于癌細(xì)胞表面的唾液酸化Lewis結(jié)構(gòu)被糖蛋白和糖脂的糖鏈所攜帶，并與呈現(xiàn)于內(nèi)皮細(xì)胞上的E-選擇素結(jié)合。因此，選擇素及其糖配體可能在轉(zhuǎn)移過(guò)程中的腫瘤細(xì)胞的選擇性歸巢(homing)中起重要作用。
唾液酰Lewis A和X的生物合成被認(rèn)為依賴于細(xì)胞類型特異性和發(fā)育階段特異性的酶將巖藻糖從鳥(niǎo)苷二磷酸-巖藻糖(GDP-Fuc)通過(guò)α(1，3)和α(1，4)鍵最終添加到唾液酸化的前體上，該步驟被α-1，3/1，4-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(α-1，3/1，4 Fuc-T，F(xiàn)UT)所催化。
目前已經(jīng)克隆和定性了數(shù)種巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因。這些基因(FUT 3-7)和它們的酶產(chǎn)物(Fuc-TIII-VII)的表達(dá)似乎是組織特異性的。由這5種基因編碼的酶名為FUTIII，F(xiàn)UTIV，F(xiàn)UTV，F(xiàn)UTVI和FUTVII。編碼FUTIII，F(xiàn)UTV和FUTVI的三個(gè)基因位于染色體19p13.3上鄰近的物理位置。生化和分子克隆研究提示，唾液酰Lewis A/X部分的譜系特異性(lineage-specific)的表達(dá)是由α-1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因的譜系特異性的表達(dá)所決定的，這些基因的酶產(chǎn)物作用于組成性地表達(dá)的寡糖前體以產(chǎn)生定位于表面的(surface-localized)唾液酰Lewis A/X決定簇(determinants)。負(fù)責(zé)上皮組織中的活性的人巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是FUT3和FUT6。FUT3[又稱Lewis α-(1，3/1，4)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因]和FUT6[血漿α-(1，3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因]的轉(zhuǎn)錄物在正常和轉(zhuǎn)化的組織中都存在。巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)錄物也在多種腺癌細(xì)胞系中普遍存在，其中在結(jié)腸癌中具有顯著的FUT3和6的高表達(dá)(參見(jiàn)例如Ugorski等人，Acta Biochimica Polonica，49303-311(2002)；Nakamori等人，Dis.Colon Rectum.，40420-431(1997)；Takada等人，CancerRes.，53354-361(1993)；Ichikawa等人，J.Surg.Oncol.，7598-102(2000))；Nakagoe等人，J Exp Clin Cancer Res.，2002.03；21(1)107-13；Matsumoto等人，Br J Cancer.2002.01.21；86(2)161-7；Ito等人，J Gastroenterol.2001.12；36(12)823-9；Nakagoe等人，Cancer Detect Prev.2001；25(3)299-308；Kumamoto等人，Cancer Res.2001.06.01；61(11)4620-7；Murata等人，Dis Colon Rectum.2001.04；44(4)A2-A4；Nakagoe等人，J Exp Clin CancerRes.2001.03；20(1)85-90；Nakagoe等人，J Gastroenterol.2001.03；36(3)166-72；Nakagoe等人，Tumour Biol.2001.03-04；22(2)115-22；Nakagoe等人，Can J Gastroenterol.2000.10；14(9)753-60；Izawa等人，Cancer Res.2000.03.01；60(5)1410-6；Tanaka等人，Hepatogastroenterology.1999.03-04；46(26)875-82；Matsushita等人，Cancer Lett.1998.11.27；133(2)151-60；Sato等人，Anticancer Res.1997.09-10；17(5A)3505-11；Yamada等人，Br J Cancer.1997；76(5)582-7；Nakamori等人，Dis Colon Rectum.1997.04；40(4)420-31；Srinivas等人，Scand J Immunol.1996.09；44(3)197-203；Matsushita等人，Lab Invest.1990.12；63(6)780-91；Ashizawa等人，J Exp Clin Cancer Res.2003.03；22(1)91-8；Nakagoe等人，J Exp Clin Cancer Res.2002.09；21(3)363-9；Nakagoe等人，Anticancer Res.2002.01-02；22(1A)451-8；Nakagoe等人，J Clin Gastroenterol.2002.04；34(4)408-15；Nakagoe等人，Cancer Lett.2002.01.25；175(2)213-21；Tatsumi等人，Clin Exp Metastasis.1998.11；16(8)743-50；Ikeda等人，J Surg Oncol.1996.07；62(3)171-6；Ikeda等人，Eur J Surg Oncol.1995.04；21(2)168-75；Togayachi等人，Int J Cancer.1999.09.24；83(1)70-9；Satoh等人，Clin Cancer Res.1997.04；3(4)495-9；Satoh等人，Respiration.1998；65(4)295-8；Satoh等人，Anticancer Res.1998.07-08；18(4B)2865-8；Fukuoka等人，Lung Cancer.1998.05；20(2)109-16；Fujiwara等人，Anticancer Res.1998.03-04；18(2A)1043-6；Ogawa等人，Int J Cancer.1997.04.22；74(2)189-92；Ogawa等人，J ThoracCardiovasc Surg.1994.08；108(2)329-36；Asao等人，Cancer.1989.12.15；64(12)2541-5；Narita等人，Breast Cancer.1996.03.29；3(1)19-23；Yamaguchi等人，Oncology.1998.07-08；55(4)357-62；Sikut等人，Int J Cancer.1996.05.29；66(5)617-23；Saito等人，Anticancer Res.2003.07-08；23(4)3441-6；Fujii等人，Urol Int.2000；64(3)129-33；Idikio等人，GlycoconjJ.1997.11；14(7)875-7；Inoue等人，Obstet Gynecol.1992.03；79(3)434-40；Yamashita等人，Eur J Cancer.2000.01；36(1)113-20；Hamanaka等人，Pancreas.1996.08；13(2)160-5；Ho等人，Cancer Res.1995.08.15；55(16)3659-63)。
發(fā)明概述本文所公開(kāi)的發(fā)明提供檢查哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞樣品中的一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)的方法和測(cè)定法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)可預(yù)示所述組織或細(xì)胞樣品是否將對(duì)凋亡誘導(dǎo)劑例如Apo2L/TRAIL及抗-DR5激動(dòng)劑抗體敏感。在本發(fā)明的不同實(shí)施方案中，所述方法和測(cè)定法檢查生物標(biāo)志的表達(dá)，例如某些巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(fucosyltransferase)，特別是巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶3(FUT3)和/或巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶6(FUT6)，以及唾液酰(sialyl)Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的表達(dá)。
如上面所討論的，大多數(shù)正常人細(xì)胞類型似乎對(duì)某些重組形式的Apo2L/TRAIL的凋亡誘導(dǎo)具有抗性(Ashkenazi等人，同上；Walzcak等人，同上)。還觀察到人類疾病細(xì)胞類型的某些群體(例如癌細(xì)胞的某些群體)對(duì)某些重組形式的Apo2L/TRAIL的凋亡誘導(dǎo)(Ashkenazi等人，J.Clin.Invest.，1999，同上；Walczak等人，Nature Med.，1999，同上)是抵抗的。因此，通過(guò)進(jìn)行某種測(cè)定方法檢查哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞樣品的特定生物標(biāo)志的表達(dá)，就可以方便和高效地得到對(duì)于評(píng)估治療患者的合適或有效的療法有用的信息。例如，從檢測(cè)哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞樣品中的FUT3或FUT6表達(dá)的測(cè)定所得的信息，可以為內(nèi)科醫(yī)生提供有用的數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)可以用來(lái)為患有例如癌癥等疾病的病人確定最佳的治療方案(使用Apo2L/TRAIL或死亡受體激動(dòng)劑抗體)。
本發(fā)明提供預(yù)測(cè)哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞樣品(例如癌細(xì)胞)對(duì)Apo2L/TRAIL或死亡受體激動(dòng)劑抗體的敏感性的方法。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括得到哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞樣品并檢查該組織或細(xì)胞的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶3或巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶6的表達(dá)。所述方法還包括檢查該組織或細(xì)胞的其它生物標(biāo)志例如唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的表達(dá)。這些方法可以以多種測(cè)定模式實(shí)施，包括檢測(cè)mRNA表達(dá)的測(cè)定，檢測(cè)酶活性存在的酶測(cè)定，免疫組化測(cè)定和本文中描述的其它測(cè)定。確定這樣的生物標(biāo)志在所述組織或細(xì)胞中的表達(dá)可預(yù)示所述組織或細(xì)胞樣品是否將對(duì)凋亡誘導(dǎo)劑例如Apo2L/TRAIL及死亡受體抗體敏感。在可選的實(shí)施方案中，還可以檢查所述組織或細(xì)胞的DR4，DR5，DcR1或DcR2受體的表達(dá)。
本發(fā)明的其它方法包括在哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞樣品中誘導(dǎo)凋亡的方法，其包括下列步驟得到哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞樣品，檢查該組織或細(xì)胞的一種或多種生物標(biāo)志，例如巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶3，巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶6，唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的表達(dá)，并且一旦確定了所述組織或細(xì)胞樣品表達(dá)所述一種或多種生物標(biāo)志，則使組織或細(xì)胞樣品暴露于有效量的Apo2L/TRAIL或死亡受體激動(dòng)劑抗體。檢查一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)的方法中的步驟可以以多種測(cè)定模式進(jìn)行，包括檢測(cè)mRNA表達(dá)的測(cè)定，檢測(cè)酶活性存在的酶測(cè)定，和免疫組化測(cè)定。在可選的實(shí)施方案中，所述方法還包括檢查組織或細(xì)胞樣品的DR4，DR5，DcR1，或DcR2受體的表達(dá)。任選地，所述組織或細(xì)胞樣品包括癌組織或細(xì)胞。
本發(fā)明的其它方法包括治療哺乳動(dòng)物中的疾病，例如免疫相關(guān)的疾病或癌癥的方法，包括下列步驟得到哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞樣品，檢查該組織或細(xì)胞的一種或多種生物標(biāo)志，例如巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶3，巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶6，唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的表達(dá)，并且一旦確定了所述組織或細(xì)胞樣品表達(dá)所述一種或多種生物標(biāo)志，則對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用有效量的Apo2L/TRAIL或死亡受體激動(dòng)劑抗體。檢查一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)的方法中的步驟可以以多種測(cè)定模式進(jìn)行，包括檢測(cè)mRNA表達(dá)的測(cè)定，檢測(cè)酶活性存在的酶測(cè)定，和免疫組化測(cè)定。在可選的實(shí)施方案中，所述方法還包括檢查組織或細(xì)胞樣品的DR4，DR5，DcR1，或DcR2受體的表達(dá)。任選地，這些方法包括治療哺乳動(dòng)物中的癌癥。任選地，所述方法除了施用有效量的Apo2L/TRAIL和/或死亡受體激動(dòng)劑抗體以外，還包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用化學(xué)治療劑或放射治療。
進(jìn)一步的實(shí)施方案由下面的權(quán)利要求更具體地公開(kāi)1.預(yù)測(cè)哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞樣品對(duì)Apo2L/TRAIL的敏感性的方法，包括下列步驟得到哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞樣品；檢查所述組織或細(xì)胞樣品以檢測(cè)選自巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶3、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶6、唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)，其中，所述一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)預(yù)示所述組織或細(xì)胞樣品對(duì)Apo2L/TRAIL的凋亡誘導(dǎo)活性敏感。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)是通過(guò)檢測(cè)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶3或巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶6的mRNA表達(dá)來(lái)檢查的。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)是通過(guò)免疫組化檢測(cè)唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的表達(dá)來(lái)檢查的。
4.權(quán)利要求1的方法，還包括檢查所述組織或細(xì)胞樣品中DR4、DR5、DcR1或DcR2受體的表達(dá)的步驟。
5.權(quán)利要求1的方法，其中組織或細(xì)胞樣品包括癌組織或細(xì)胞。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述癌細(xì)胞是結(jié)腸、結(jié)腸直腸、胃腸或胰腺的癌細(xì)胞或組織。
7.在哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞樣品中誘導(dǎo)凋亡的方法，包括下列步驟得到哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞樣品；檢查所述組織或細(xì)胞樣品以檢測(cè)選自巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶3、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶6、唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)，及檢測(cè)到所述一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)后，使所述組織或細(xì)胞樣品暴露于有效量的Apo2L/TRAIL。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)是通過(guò)檢測(cè)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶3或巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶6的mRNA表達(dá)來(lái)檢查的。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)是通過(guò)免疫組化檢測(cè)唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的表達(dá)來(lái)檢查的。
10.權(quán)利要求7的方法，還包括檢查所述組織或細(xì)胞樣品中DR4、DR5、DcR1或DcR2受體的表達(dá)的步驟。
11.權(quán)利要求7的方法，其中組織或細(xì)胞樣品包括癌組織或細(xì)胞。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述癌細(xì)胞是結(jié)腸、結(jié)腸直腸、胃腸或胰腺的癌細(xì)胞或組織。
13.權(quán)利要求7的方法，其中所述細(xì)胞被暴露于有效量的Apo2L/TRAIL多肽，該Apo2L/TRAIL多肽包括圖1的氨基酸114-281。
14.治療哺乳動(dòng)物中的疾病，例如免疫相關(guān)疾病或癌癥的方法，包括下列步驟得到所述哺乳動(dòng)物的組織或細(xì)胞樣品；檢查所述組織或細(xì)胞樣品以檢測(cè)選自巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶3、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶6、唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)，及檢測(cè)到所述一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)后，對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用有效量的Apo2L/TRAIL。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)是通過(guò)檢測(cè)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶3或巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶6的mRNA表達(dá)來(lái)檢查的。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)是通過(guò)免疫組化檢測(cè)唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的表達(dá)來(lái)檢查的。
17.權(quán)利要求14的方法，還包括檢查所述組織或細(xì)胞樣品中DR4、DR5、DcR1或DcR2受體的表達(dá)的步驟。
18.權(quán)利要求14的方法，其中組織或細(xì)胞樣品包括癌組織或細(xì)胞。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述癌細(xì)胞或組織包含結(jié)腸、結(jié)腸直腸、胃腸或胰腺的癌細(xì)胞或組織。
20.權(quán)利要求14的方法，其中對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用有效量的Apo2L/TRAIL多肽，該Apo2L/TRAIL多肽包括圖1的氨基酸114-281。
21.權(quán)利要求14的方法，其中還對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用化學(xué)治療劑或放射療法。
22.權(quán)利要求14的方法，其中還對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用細(xì)胞因子、細(xì)胞毒劑或生長(zhǎng)抑制劑。
23.權(quán)利要求7的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽連接于聚乙二醇分子。
24.權(quán)利要求14的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽連接于聚乙二醇分子。
25.權(quán)利要求6的方法，其中所述癌細(xì)胞是結(jié)腸或結(jié)腸直腸癌細(xì)胞。
26.權(quán)利要求1的方法，其中所述Apo2L/TRAIL是包含圖1(SEQ IDNO1)的氨基酸41-281的多肽，或其生物活性片段。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述Apo2L/TRAIL是包括圖1(SEQ IDNO1)的氨基酸114-281的多肽。
28.權(quán)利要求12的方法，其中所述癌細(xì)胞是結(jié)腸或結(jié)腸直腸癌細(xì)胞。
29.權(quán)利要求20的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽由圖1(SEQ IDNO1)的氨基酸114-281組成。
30.預(yù)測(cè)哺乳動(dòng)物的結(jié)腸或結(jié)腸直腸癌細(xì)胞對(duì)Apo2L/TRAIL的敏感性的方法，包括下列步驟得到哺乳動(dòng)物結(jié)腸或結(jié)腸直腸癌細(xì)胞；檢查所述癌細(xì)胞以檢測(cè)選自巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶3、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶6、唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)，其中所述一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)預(yù)示所述癌細(xì)胞對(duì)Apo2L/TRAIL的凋亡誘導(dǎo)活性敏感。
31.在哺乳動(dòng)物結(jié)腸或結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的方法，包括下列步驟得到哺乳動(dòng)物結(jié)腸或結(jié)腸直腸癌細(xì)胞；檢查所述癌細(xì)胞以檢測(cè)選自巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶3、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶6、唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)，及在檢測(cè)所述一種或多種生物標(biāo)志表達(dá)后，將所述癌細(xì)胞暴露于有效量的Apo2L/TRAIL多肽。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽包括圖1(SEQ IDNO1)的氨基酸41-281，或其具有凋亡活性的片段。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽連接于聚乙二醇分子。
34.權(quán)利要求32的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽包括圖1(SEQ IDNO1)的氨基酸114-281。
35.治療哺乳動(dòng)物中結(jié)腸或結(jié)腸直腸的癌癥的方法，包括下列步驟得到所述哺乳動(dòng)物結(jié)腸或結(jié)腸直腸癌細(xì)胞樣品；檢查所述癌細(xì)胞樣品以檢測(cè)選自巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶3、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶6、唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)，及在檢測(cè)所述一種或多種生物標(biāo)志表達(dá)后，對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用有效量的Apo2L/TRAIL。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽包括圖1(SEQ IDNO1)的氨基酸41-281，或其具有凋亡活性的片段。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽連接于聚乙二醇分子。
38.權(quán)利要求36的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽包括圖1(SEQ IDNO1)的氨基酸114-281。


圖1顯示人Apo-2配體cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO2)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO1)。第447位核苷酸處的“N”表示該核苷酸堿基可以是“T”或“G”。
圖2A和2B顯示全長(zhǎng)人DR4 cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO4)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO3)。Pan等人，Science，276111(1997)中也分別報(bào)道了人DR4的核苷酸和氨基酸序列。
圖3A顯示如1998年11月19日的WO98/51793所公開(kāi)的人DR5的411個(gè)氨基酸的序列(SEQ ID NO5)。人DR5的轉(zhuǎn)錄剪接變體是本領(lǐng)域已知的。該DR5剪接變體編碼圖3B和3C所示的人DR5的440個(gè)氨基酸的序列(SEQID NO6)，如1998年8月20日的WO98/35986所公開(kāi)的。
圖3D顯示全長(zhǎng)人DcR1 cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO7)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO8)。WO98/58062中也分別描述了人DcR1(特別是其各個(gè)域)的核苷酸和氨基酸序列。
圖3E顯示全長(zhǎng)人DcR2 cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO9)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO10)。WO99/10484中也分別描述了人DcR2(特別是其各個(gè)域)的核苷酸和氨基酸序列。
圖4顯示全長(zhǎng)人(1，3/1，4)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FUT3)cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO9)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO12)。這些序列對(duì)應(yīng)于GenBank登錄號(hào)HSU27328，并在例如Kukowska-Latallo等人，Genes Dev.1990 Aug；4(8)1288-303中有記載。
圖5顯示全長(zhǎng)人α(1，3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FUT6)cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO9)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO12)。這些序列對(duì)應(yīng)于GenBank登錄號(hào)HSU27333，并在例如Koszdin和Bowen，Biochem BiophysRes Commun.1992 Aug 31；187(1)152-7中有記載。
圖6提供分析28個(gè)結(jié)腸或結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系對(duì)Apo2L(+0.5％胎牛血清“FBS”或10％FBS)或DR5單克隆抗體“mab”(交聯(lián)的“XL”或非交聯(lián)的，+0.5％胎牛血清“FBS”或10％FBS)的凋亡活性的敏感性或抗性，及其FUT 3、FUT 6、唾液酰Lewis A和唾液酰Lewis X的表達(dá)，所得數(shù)據(jù)的匯總表。
圖7提供不同的結(jié)腸或結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系對(duì)DR5抗體的抗性及由定量PCR測(cè)量的FUT3的表達(dá)的比較。
圖8提供不同的結(jié)腸或結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系對(duì)DR5抗體(加上交聯(lián)物)的敏感性或抗性及由FACS確定的唾液酰Lewis X或A的表達(dá)的比較。
圖9A顯示分析不同的結(jié)腸或結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系的敏感性或抗性與FUT3表達(dá)之間的相關(guān)性的Spearman等級(jí)相關(guān)性檢驗(yàn)。
圖9B顯示分析不同的結(jié)腸或結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系的敏感性(“sens”)或抗性(“res”)的Fisher’s Exact檢驗(yàn)結(jié)果，和FUT3和唾液酰Lewis A/X的表達(dá)與各細(xì)胞系對(duì)DR5抗體凋亡活性的敏感性之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
圖10比較不同的結(jié)腸或結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系的DcR1或DcR2受體的表達(dá)(由定量PCR確定)及特定的細(xì)胞系對(duì)Apo2L或DR5抗體的狀態(tài)(敏感或抵抗)。
圖11比較不同的結(jié)腸或結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系的DcR1或DcR2受體的表達(dá)(由FACS確定)及特定的細(xì)胞系對(duì)Apo2L或DR5抗體的狀態(tài)(敏感或抵抗)。
圖12顯示在4種結(jié)腸直腸細(xì)胞癌細(xì)胞系CaCo2，SW 1417，DLD-1，和Colo 205中對(duì)唾液酰Lewis A和X的免疫組化染色，及其與唾液酰LewisA和X的表達(dá)(如FACS測(cè)量的)的關(guān)聯(lián)和與對(duì)Apo2L的敏感性的關(guān)聯(lián)。
圖13是顯示正常結(jié)腸粘膜、正常肝組織、原發(fā)性結(jié)腸癌和結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的組織樣品中的唾液酰Lewis A和X的表達(dá)的IHC實(shí)驗(yàn)的總結(jié)。
發(fā)明詳述本文所描述或引用的技術(shù)和程序是通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員所充分理解，并使用常規(guī)的方法普遍采用的，例如被廣泛使用的、由Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual第二版(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y所描述的分子克隆方法。除了另有說(shuō)明的以外，涉及使用可商購(gòu)的試劑盒和試劑的程序通常按照制造商給定的規(guī)程和/或參數(shù)進(jìn)行，視何者適用而定。
在描述本發(fā)明的方法和測(cè)定法以前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不應(yīng)局限于所描述的具體的方法、操作規(guī)程、細(xì)胞系、動(dòng)物屬或種，構(gòu)建體和試劑，因?yàn)檫@些理所當(dāng)然是可以變化的。還應(yīng)當(dāng)理解這里所用的術(shù)語(yǔ)只是為了描述具體的實(shí)施方案，并非意在限制本發(fā)明的范圍，該范圍僅由所附權(quán)利要求所限定。
應(yīng)當(dāng)指出，本文中和所附的權(quán)利要求中使用的單數(shù)形式(“a”，“an”，“the”)包括復(fù)數(shù)的被指稱事物，除非上下文明確地另有指示。因此，例如，“遺傳改變”(“a genetic alteration”)包括多個(gè)這樣的改變，而“探針”(“a probe”)包括一個(gè)或多個(gè)探針及其為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的等同物，等等。
本文中提到的所有出版物在此都通過(guò)引用并入本文，以公開(kāi)并描述連同這些出版物被引用的方法和/或材料。本文所引用的出版物，被引用的是其在本發(fā)明的申請(qǐng)日之前的公開(kāi)。這里的一切都不應(yīng)被理解為承認(rèn)本發(fā)明人無(wú)權(quán)基于更早的優(yōu)先權(quán)日期或在先的發(fā)明日期使這些出版物日期提前。另外，真實(shí)的出版日期可能和所示的不同，需要獨(dú)立的核實(shí)。
定義本文的術(shù)語(yǔ)“Apo2L/TRAIL”、“Apo-2L”和“TRAIL”是用來(lái)指包括圖1所示的氨基酸序列中的氨基酸殘基114-281(含)，95-281(含)，殘基92-281(含)，殘基91-281(含)，殘基41-281(含)，殘基15-281(含)，或殘基1-281(含)，及上述序列的生物活性片段，缺失、插入或替代性變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽序列包括圖1的殘基114-281，及任選地，由圖1的殘基114-281組成。任選地，所述多肽序列包括圖1的殘基92-281或殘基91-281。Apo-2L多肽可以由圖1所示的天然核苷酸序列編碼。任選地，編碼圖1中Pro119殘基的密碼子可以是“CCT”或“CCG”。在其它的實(shí)施方案中，所述片段或變體是生物活性的，且與任一上述的Apo2L/TRAIL序列具有至少約80％的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少約90％的同一性，更優(yōu)選地，具有至少95％，96％，97％，98％，或99％的序列同一性。任選地，所述Apo2L/TRAIL多肽被在嚴(yán)緊條件下與圖1提供的編碼核苷酸序列雜交的核苷酸序列所編碼。該定義涵蓋Apo2L/TRAIL的替代性變體，其中它的至少一個(gè)天然氨基酸被替代為丙氨酸殘基。具體的Apo2L/TRAIL的替代性變體包括至少一個(gè)氨基酸被替代為丙氨酸殘基的變體。這些替代性變體包括例如標(biāo)識(shí)為“D203A”、“D218A”和“D269A”的那些變體。該術(shù)語(yǔ)被用來(lái)標(biāo)識(shí)第203、218和/或269位(使用圖1所示的編號(hào))的天冬氨酸被替代為丙氨酸殘基的Apo2L/TRAIL變體?？蛇x地，所述Apo2L/TRAIL變體可包含公開(kāi)的PCT申請(qǐng)WO01/00832的表I中所述的一種或多種丙氨酸替代。替代性變體包括2001年1月4日公開(kāi)的WO01/00832的表I指明的殘基替代。該定義還涵蓋從Apo2L/TRAIL源分離的，或通過(guò)重組或合成方法制備的天然序列的Apo2L/TRAIL。本發(fā)明的Apo2L/TRAIL包括PCT申請(qǐng)WO97/01633和WO97/25428中公開(kāi)的、稱為Apo2L/TRAIL或TRAIL的多肽。術(shù)語(yǔ)“Apo2L/TRAIL”或“Apo2L”用來(lái)泛指Apo2L/TRAIL的形式，包括該多肽的單體、二聚體或三聚體形式。Apo2L序列中提到的所有氨基酸殘基的編號(hào)都使用根據(jù)圖1的編號(hào)，除非另有特別說(shuō)明。例如，“D203”或“Asp203”指圖1中提供的序列的第203位的天冬氨酸殘基。
術(shù)語(yǔ)“Apo2L/TRAIL胞外域”或“Apo2L/TRAIL ECD”是指Apo2L/TRAIL的基本上沒(méi)有跨膜和胞質(zhì)域的形式。通常，ECD將具有少于1％的所述跨膜和胞質(zhì)域，且優(yōu)選地，將具有少于0.5％的所述域。應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)本發(fā)明的多肽而言，任何被鑒定的跨膜域都是根據(jù)本領(lǐng)域中鑒定那種疏水域的常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)鑒定的?？缒び虻拇_切邊界可以是變化的，但最有可能是在最初鑒定的域的任一末端處不多于約5個(gè)氨基酸的變化。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，ECD由所述多肽的可溶性胞外域序列組成，基本上沒(méi)有跨膜和胞質(zhì)或胞內(nèi)域(而且不是膜結(jié)合的)。具體的Apo-2L/TRAIL胞外域序列在PCT申請(qǐng)WO97/01633和WO97/25428中有描述。
術(shù)語(yǔ)“Apo2L/TRAIL單體”或“Apo2L單體”指Apo2L的胞外域序列的共價(jià)鏈。
術(shù)語(yǔ)“Apo2L/TRAIL二聚體”或“Apo2L二聚體”指通過(guò)二硫鍵共價(jià)鍵連接的2個(gè)Apo-2L單體。用于本文的該術(shù)語(yǔ)包括游離存在的Apo2L二聚體和三聚體形式的Apo2L中的Apo2L二聚體(即，與另一第三Apo2L單體聯(lián)合)。
術(shù)語(yǔ)“Apo2L/TRAIL聚集體(aggregate)”用于指自聯(lián)合(self-associated)的較高級(jí)寡聚體形式的Apo2L/TRAIL，例如Apo2L/TRAIL三聚體，其形成例如六聚體和九聚體形式的Apo2L/TRAIL。使用本領(lǐng)域已知的方法和測(cè)定法(及使用可商購(gòu)的材料)，例如天然(native)大小排阻HPLC(“SEC”)、使用十二烷基硫酸鈉的變性大小排阻色譜(“SDS-SEC”)，反相HPLC和毛細(xì)管電泳，可以確定Apo2L/TRAIL單體、二聚體或三聚體(及其它聚集體)的存在和數(shù)量。
“Apo-2配體受體”包括本領(lǐng)域稱為“DR4”和“DR5”的受體，其多核苷酸和多肽序列分別如圖2和3所示。Pan等人描述了被稱為“DR4”的TNF受體家族成員(Pan等人，Science，276111-113(1997)；另參見(jiàn)1998年7月30日公開(kāi)的WO98/32856；1999年7月29日公開(kāi)的WO99/37684；2000年12月7日公開(kāi)的WO00/73349；2002年8月13日授權(quán)的US6,433,147；2002年10月8日授權(quán)的US6,461,823，2002年1月29日授權(quán)的US6,342,383)。Sheridan等人，Science，277818-821(1997)和Pan等人，Science，277815-818(1997)描述了另一種Apo2L/TRAIL的受體(1998年11月19日公開(kāi)的WO98/51793；1998年9月24日公開(kāi)的WO98/41629)。該受體被稱為DR5(該受體又被稱為Apo-2；TRAIL-R，TR6，Tango-63，hAPO8，TRICK2或KILLER；Screaton等人，Curr.Biol.，7693-696(1997)；Walczak等人，EMBO J.，165386-5387(1997)；Wu等人，Nature Genetics，17141-143(1997)；1998年8月20日公開(kāi)的WO98/35986；1998年10月14日公開(kāi)的EP870，827；1998年10月22日公開(kāi)的WO98/46643；1999年1月21日公開(kāi)的WO99/02653；1999年2月25日公開(kāi)的WO99/09165；1999年3月11日公開(kāi)的WO99/11791；2002年8月13日公開(kāi)的US2002/0072091；2002年12月7日公開(kāi)的US2002/0098550；2001年12月6日授權(quán)的US6,313,269；2001年8月2日公開(kāi)的US2001/0010924；2003年7月3日公開(kāi)的US；2002年10月31日公開(kāi)的US2002/0160446，2002年4月25日公開(kāi)的US2002/0048785；2003年5月27日授權(quán)的US6,569,642，2000年6月6日授權(quán)的US6,072,047，2003年11月4日授權(quán)的US6,642,358)。如上所述，其它Apo-2L受體包括DcR1，DcR2，和OPG(參見(jiàn)，Sheridan等人，同上；Marsters等人，同上；和Simonet等人，同上)。術(shù)語(yǔ)“Apo-2L受體”當(dāng)用于本文時(shí)，包括天然序列的受體和受體變體。這些術(shù)語(yǔ)涵蓋在多種哺乳動(dòng)物，包括人類中表達(dá)的Apo-2L受體。Apo-2L受體可以如多種人類組織譜系中天然存在的那樣內(nèi)源表達(dá)，或通過(guò)重組或合成方法表達(dá)。“天然序列的受體”包括與來(lái)自自然界的Apo-2L受體具有相同氨基酸序列的多肽。因此，天然序列的Apo-2L受體可具有來(lái)自任何哺乳動(dòng)物的天然存在的Apo-2L受體的氨基酸序列。這樣的天然序列Apo-2L受體可以從自然界分離或者可以通過(guò)重組或合成手段生產(chǎn)。術(shù)語(yǔ)“天然序列Apo-2L受體”特別涵蓋該受體的天然存在的截短的或分泌形式(例如，含有例如胞外域序列的可溶形式)，天然存在的變體形式(例如以可選方式剪接的形式)和天然存在的等位變體。受體變體可包括天然序列Apo-2L受體的片段或缺失突變體。圖3A顯示人DR5的411個(gè)氨基酸的序列，如WO98/51793于1998年11月19日所公開(kāi)的。人DR5轉(zhuǎn)錄剪接變體是本領(lǐng)域已知的。該DR5剪接變體編碼圖3B和3C所示的人DR5的440個(gè)氨基酸的序列，如WO98/35986于1998年8月20日所公開(kāi)的。
“死亡受體抗體”在本文中用來(lái)泛指針對(duì)腫瘤壞死因子受體超家族中的并含有可傳遞凋亡信號(hào)的死亡域(death domain)的受體的抗體，這樣的抗體包括DR5抗體和DR4抗體。
“DR5受體抗體”，“DR5抗體”，或“抗-DR5抗體”用來(lái)廣義地指結(jié)合至少一種形式的DR5受體或其胞外域的抗體?？蛇x地，該DR5抗體與異源序列或分子連接或融合。優(yōu)選地，該異源序列允許或幫助所述抗體形成較高級(jí)或寡聚復(fù)合物?？蛇x地，DR5抗體結(jié)合DR5受體，但不與任何其它Apo-2L受體(例如DR4，DcR1，或DcR2)結(jié)合或交叉反應(yīng)。可選地，所述抗體是DR5信號(hào)傳遞活性的激動(dòng)劑。
可選地，本發(fā)明的DR5抗體以約0.1nM到約20mM的濃度范圍結(jié)合DR5受體，如BIAcore結(jié)合測(cè)定所測(cè)得的?？蛇x地，本發(fā)明的DR5抗體顯示約0.6nM到約18mM的Ic50值，如BIAcore結(jié)合測(cè)定所測(cè)得的。
“DR4受體抗體”，“DR4抗體”，或“抗-DR4抗體”用來(lái)廣義地指結(jié)合至少一種形式的DR4受體或其胞外域的抗體?？蛇x地，該DR4抗體與異源序列或分子融合或連接。優(yōu)選地，該異源序列允許或幫助所述抗體形成較高級(jí)或寡聚復(fù)合物。可選地，DR4抗體結(jié)合DR4受體，但不與任何其它Apo-2L受體(例如DR5，DcR1，或DcR2)結(jié)合或交叉反應(yīng)?？蛇x地，所述抗體是DR4信號(hào)傳遞活性的激動(dòng)劑。
可選地，本發(fā)明的DR4抗體以約0.1nM到約20mM的濃度范圍結(jié)合DR4受體，如BIAcore結(jié)合測(cè)定所測(cè)得的?？蛇x地，本發(fā)明的DR4抗體顯示約0.6nM到約18mM的Ic50值，如BIAcore結(jié)合測(cè)定所測(cè)得的。
術(shù)語(yǔ)“激動(dòng)劑”是在最廣義的意義上使用的，包括任何在體外、體內(nèi)或原位部分地或完全地增強(qiáng)、刺激或活化Apo2L/TRAIL，DR4或DR5的一種或多種生物活性的分子。這樣的Apo2L/TRAIL與DR4或DR5結(jié)合的生物活性的例子包括凋亡和文獻(xiàn)中報(bào)道的其它活性。所述激動(dòng)劑可以直接或間接的方式起作用。例如，激動(dòng)劑可直接結(jié)合DR4或DR5，導(dǎo)致受體活化或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，結(jié)果起到在體外、原位或體內(nèi)部分地或完全地增強(qiáng)、刺激或活化DR4或DR5的一種或多種生物活性的作用。所述激動(dòng)劑也可以例如刺激另一種效應(yīng)分子，然后該分子導(dǎo)致DR4或DR5活化或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，結(jié)果間接地起到在體外、原位或體內(nèi)部分地或完全地增強(qiáng)、刺激或活化DR4或DR5的一種或多種生物活性的作用。本文認(rèn)為激動(dòng)劑可充當(dāng)增強(qiáng)分子(enhancermolecule)，間接地起增強(qiáng)或增加DR4或DR5活化或活性的作用。例如，所述激動(dòng)劑可增強(qiáng)哺乳動(dòng)物中內(nèi)源Apo-2L的活性。這可以通過(guò)，例如，預(yù)先復(fù)合(pre-complexing)DR4或DR5，或通過(guò)穩(wěn)定DR4或DR5受體與其各自配體的復(fù)合物(例如穩(wěn)定Apo-2L和DR4或DR5形成的天然復(fù)合物)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
本申請(qǐng)中使用的術(shù)語(yǔ)“生物標(biāo)記”泛指一種分子，包括基因、蛋白質(zhì)、糖結(jié)構(gòu)，或糖脂，其在哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞中的表達(dá)可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法(或本文中公開(kāi)的方法)測(cè)定，且該表達(dá)可預(yù)示哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞對(duì)Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體的敏感性。本發(fā)明所考慮的這樣的生物標(biāo)志包括但不限于“(1，3/1，4)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶”或“FUT3”，“α(1，3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶”或“FUT6”，“唾液酰Lewis A”，和“唾液酰Lewis X”?？蛇x地，該生物標(biāo)志測(cè)得的表達(dá)高于對(duì)照組織或細(xì)胞樣品中觀察到的表達(dá)?？蛇x地，例如，通過(guò)PCR或FACS測(cè)定所測(cè)得的該生物標(biāo)志在待測(cè)組織或細(xì)胞樣品中的表達(dá)，比在對(duì)照組織或樣品中觀察到的表達(dá)高至少50倍，或優(yōu)選至少100倍?？蛇x地，通過(guò)IHC測(cè)定所測(cè)得的該生物標(biāo)志的表達(dá)，其著色強(qiáng)度(stainingintensity)得分將至少為2或更高。
“(1，3/1，4)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶”或“FUT3”在本文中用來(lái)指這樣的分子其具有如本文所述的結(jié)構(gòu)特征，且可選地催化巖藻糖殘基從供體底物GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)移給受體底物，與GlcNAc形成α3或α4鍵連接(FUT III-VII及IX)。人FUT3的DNA序列和氨基酸序列在圖4中給出。這些序列對(duì)應(yīng)于GenBank登錄號(hào)HSU27328，并在例如Kukowska-Latallo等人，Genes Dev.1990 Aug；4(8)1288-303中有描述。FUT通常是存在于高爾基體空泡中的II型跨膜糖蛋白，典型地由N末端胞質(zhì)尾部、跨膜區(qū)和高爾基體中朝向腔內(nèi)的催化域組成。在跨膜區(qū)和催化域之間是稱為主干(stem)的區(qū)域(Paulson和Colley，J.Biol.Chem.，26417615-17618(1989))。
“α(1，3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶”或“FUT6”在本文中用來(lái)指這樣的分子，其在結(jié)構(gòu)上與例如圖5給出的人FUT6的DNA序列及氨基酸序列相關(guān)。這些序列對(duì)應(yīng)于GenBank登錄號(hào)HSU27333，并在例如Koszdin和Bowen，BiochemBiophys Res Commun.1992 Aug 31；187(1)152-7中有描述。FUT 6通常在上皮細(xì)胞和肝、腎及胃腸組織中，特別是胃、空腸和結(jié)腸中表達(dá)(并且通常在脾、肺和子宮頸中表達(dá)最少)。通常在腦、腎上腺皮質(zhì)或外周血淋巴細(xì)胞中檢測(cè)不到FUT 6。
“唾液酰Lewis A”(sialyl Lewis A)在本文中用于指具有下述序列或結(jié)構(gòu)的四糖碳水化合物結(jié)構(gòu)或抗原，其可以為膜結(jié)合的，或者為可溶性形式，在例如血漿中循環(huán)
NeuAcα2--＞3Galβ1--＞3[Fucα1--＞4]GlcNAcβ1--＞R(NeuAcα2--＞3Galβ1--＞3(Fucα1--＞4)GlcNAcβ1--＞R) “唾液酰Lewis X”(sialyl Lewis X)在本文中用于指具有下述序列或結(jié)構(gòu)的四糖碳水化合物結(jié)構(gòu)或抗原，其可以為膜結(jié)合的，或者為可溶性形式，在例如血清中循環(huán)NeuAcα2--＞3Galβ1--＞4[Fucα1--＞3]GlcNAcβ1--＞R(NeuAcα2--＞3Galβ1--＞4(Fucα1--＞3)GlcNAcβ1--＞R) “受試者”或“患者”意指任何需要治療的單個(gè)對(duì)象，包括人、牛、犬、豚鼠、兔、雞、昆蟲(chóng)等。作為受試者還意在包括任何臨床研究試驗(yàn)中涉及的、不顯示任何疾病臨床征象的對(duì)象，或流行病學(xué)研究中涉及的對(duì)象，或用作對(duì)照的對(duì)象。
術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”在本文中指任何歸類為哺乳動(dòng)物的哺乳動(dòng)物，包括人、牛、馬、犬和貓。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物是人。
“組織或細(xì)胞樣品”指從受試者或患者的組織得到的類似細(xì)胞的集合。所述組織或細(xì)胞樣品的來(lái)源可以是固體組織，如來(lái)自新鮮的、冷凍的和/或防腐保存的(preserved)器官或組織樣品或活檢物(biopsy)或抽吸物(aspirate)的固體組織；血液或任何血液組分；體液例如腦脊液，羊水，腹水，腹膜液(peritoneal fluid)或間質(zhì)液(interstitial fluid)；來(lái)自受試者的妊娠或發(fā)育過(guò)程中的任意時(shí)間的細(xì)胞。該組織樣品也可以是原代或培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)胞系。可選地，該組織或細(xì)胞樣品是從原發(fā)性或轉(zhuǎn)移的腫瘤得到的。組織樣品可含有不與天然狀態(tài)下的所述組織天然地混合的化合物，例如防腐劑、抗凝血?jiǎng)?、緩沖劑、固定劑、營(yíng)養(yǎng)素、抗生素等。
對(duì)本文而言組織樣品的“切片”(section)是組織樣品的單個(gè)部分或片段，例如從組織樣品切下的組織或細(xì)胞薄片?？梢岳斫猓梢詮慕M織樣品取多個(gè)切片并根據(jù)本發(fā)明加以分析，只要理解本發(fā)明包括同時(shí)在形態(tài)學(xué)水平和分子水平上分析同一組織樣品的切片，或?qū)ν唤M織樣品的切片同時(shí)分析蛋白質(zhì)和核酸的方法。
“相互關(guān)聯(lián)”是指以任何方式比較第一分析或程序的執(zhí)行情況和/或結(jié)果與第二分析或程序的執(zhí)行情況和/或結(jié)果。例如，可以第二程序的執(zhí)行中使用第一分析或程序的結(jié)果，并且/或者，可以使用第一分析或程序的結(jié)果來(lái)確定是否應(yīng)該進(jìn)行第二分析或程序。對(duì)于免疫組化分析或程序，可以使用IHC的結(jié)果來(lái)確定是否應(yīng)該執(zhí)行特定的治療方案。
“核酸”意圖包括任何DNA或RNA。例如，存在于組織樣品中的染色體、線粒體、病毒和/或細(xì)菌核酸。術(shù)語(yǔ)“核酸”涵蓋雙鏈核酸分子的任一或兩條鏈，并包括完整核酸分子的任何片段或部分。
“基因”意指在編碼或轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)或調(diào)節(jié)其它基因的表達(dá)中起功能性作用的任何核酸序列或其部分?；蚩捎韶?fù)責(zé)編碼功能性蛋白質(zhì)的所有核酸組成，或僅由負(fù)責(zé)編碼或表達(dá)蛋白質(zhì)的核酸的一部分組成。核酸序列在外顯子、內(nèi)含子、起始或終止區(qū)域、啟動(dòng)子序列、其它調(diào)節(jié)序列或所述基因的獨(dú)特的鄰近區(qū)域中可含有遺傳異常(genetic abnormality)。
術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”在本文中用來(lái)指這樣的化合物或組合物，其直接或間接地與例如核酸探針或抗體等試劑偶聯(lián)或融合，并有助于檢測(cè)與其偶聯(lián)或融合的所述試劑。標(biāo)記本身可以是可檢測(cè)的(例如放射性同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記)，或者，對(duì)酶標(biāo)記而言，可催化可檢測(cè)的底物反應(yīng)物或組合物的化學(xué)變化。
術(shù)語(yǔ)“抗體”在本文中使用其最廣的含義，具體覆蓋完整的單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(如雙特異性抗體)、及抗體片段，只要它們展示所需生物學(xué)活性。
“抗體片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)。抗體片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。
“天然抗體”通常是由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)構(gòu)成的分子量約150,000道爾頓的異型四聚體糖蛋白。每條輕鏈通過(guò)一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈連接，而二硫鍵的數(shù)目在具有不同免疫球蛋白同種型的重鏈中有所變化。每條重鏈和輕鏈還具有間隔規(guī)律的鏈內(nèi)二硫橋。每條重鏈在一端具有一個(gè)可變區(qū)(VH)，接著是多個(gè)恒定區(qū)。每條輕鏈在一端具有一個(gè)可變區(qū)(VL)，而另一端是一個(gè)恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)排列在一起，而輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)排列在一起。認(rèn)為特定的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變區(qū)之間形成界面。
術(shù)語(yǔ)“可變的”指可變區(qū)中的某些部分在抗體序列中差異廣泛，且用于每種特定抗體針對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性的事實(shí)。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個(gè)可變區(qū)。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中稱作高變區(qū)的三個(gè)區(qū)段?？勺儏^(qū)中更加高度保守的部分稱作框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)各自包含四個(gè)FR，它們大多采取β-折疊構(gòu)象，通過(guò)形成環(huán)狀連接且在某些情況中形成β-折疊結(jié)構(gòu)一部分的三個(gè)高變區(qū)連接。每條鏈中的高變區(qū)通過(guò)FR非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的高變區(qū)一起促成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成(參見(jiàn)Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，(1991))。恒定區(qū)不直接涉及抗體與抗原的結(jié)合，但顯示出多種效應(yīng)物功能，諸如抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)中抗體的參與。
用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，稱作“Fab”片段，各自具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，和一個(gè)殘余“Fc”片段，其名稱反映了它易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個(gè)F(ab′)2片段，它具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，并且仍能夠交聯(lián)抗原。
“Fv”是包含完整抗原識(shí)別和抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。該區(qū)域由緊密、非共價(jià)結(jié)合的一個(gè)重鏈可變區(qū)和一個(gè)輕鏈可變區(qū)的二聚體組成。正是在這種構(gòu)造中，各個(gè)可變區(qū)的三個(gè)高變區(qū)相互作用而在VH-VL二聚體表面確定了一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。六個(gè)高變區(qū)共同賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個(gè)可變區(qū)(或只包含對(duì)抗原特異的三個(gè)高變區(qū)的半個(gè)Fv)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，盡管親和力低于完整結(jié)合位點(diǎn)。
Fab片段還包含輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一恒定區(qū)(CH1)。Fab’片段因在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了少數(shù)殘基而與Fab片段有所不同，包括來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。本文中Fab’-SH是其中恒定區(qū)的半胱氨酸殘基攜帶至少一個(gè)游離硫醇基的Fab’的稱謂。F(ab′)2抗體片段最初是作為成對(duì)Fab’片段生成的，在Fab’片段之間具有鉸鏈半胱氨酸。還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)。
來(lái)自任何脊椎動(dòng)物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”，根據(jù)其恒定區(qū)的氨基酸序列，可歸入兩種截然不同類型中的一種，稱作卡帕(κ)和拉姆達(dá)(λ)。
根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，可將抗體歸入不同的類別。完整抗體有五種主要的類別IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可進(jìn)一步分為亞類(同種型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。將與不同抗體類別對(duì)應(yīng)的重鏈恒定區(qū)分別稱作α、δ、ε、γ和μ。不同類別免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是眾所周知的。
“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包含抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈上。優(yōu)選的是，該Fv多肽在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽接頭，使得scFv形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述參見(jiàn)Plückthun，在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies中，第113卷，Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag，New York，269-315，(1994)。
術(shù)語(yǔ)“雙抗體”指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小型抗體片段，該片段在同一條多肽鏈(VH-VL)中包含相連的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)。通過(guò)使用過(guò)短的接頭使得同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間不能配對(duì)，迫使結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，并產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙抗體更完整的描述于例如EP404,097；WO1993/11161；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448，(1993)。
術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”在用于本文時(shí)指由一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體是相同的和/或結(jié)合相同的表位，除了天然發(fā)生的、可能以極少量存在的突變以外。單克隆抗體是高度特異性的，針對(duì)單個(gè)抗原性位點(diǎn)。另外，與包含針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)多克隆抗體制品不同，每種單克隆抗體針對(duì)抗原上的單個(gè)決定簇。除了它們的特異性以外，單克隆抗體的優(yōu)越性體現(xiàn)在它們是由雜交瘤培養(yǎng)物合成的，未受到其它免疫球蛋白的污染。修飾語(yǔ)“單克隆”指示由基本上同質(zhì)的抗體群獲得的抗體的特征，并不解釋為需要通過(guò)任何特定方法來(lái)生產(chǎn)抗體。例如，依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過(guò)最初由Kohler等人，Nature256495(1975)描述的雜交瘤方法來(lái)制備，或者可通過(guò)重組DNA方法來(lái)制備(參見(jiàn)例如美國(guó)專利4,816,567)。“單克隆抗體”還可使用例如Clacksonet al.，Nature 352624-628(1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.222581-597(1991)中描述的技術(shù)由噬菌體抗體庫(kù)分離。
單克隆抗體在本文中明確包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們顯示出所需的生物學(xué)活性(美國(guó)專利4,816,567；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-6855(1984))。本文中感興趣的嵌合抗體包括包含衍生自非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(如舊大陸猴類(Old World Monkey)，諸如狒狒、恒河猴或獼猴)的可變區(qū)抗原結(jié)合序列以及人恒定區(qū)序列的“靈長(zhǎng)類化(primatized)”抗體(美國(guó)專利5,693,780)。
非人源(如鼠源)抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人源免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。通常，人源化抗體指人源免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區(qū)殘基用具有所需特異性、親和力和容量的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長(zhǎng)類的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人源免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人源殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的殘基。進(jìn)行這些修飾是為了進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能。通常，人源化抗體將包含基本上不少于至少一個(gè)、通常兩個(gè)如下可變區(qū)，其中所有或基本上所有的高變環(huán)對(duì)應(yīng)于非人源免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有的FR是人源免疫球蛋白序列的FR。任選的是，人源化抗體還將包含至少部分的免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人源免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細(xì)節(jié)參見(jiàn)Jones等人，Nature 321522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332323-329(1988)；及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。
術(shù)語(yǔ)“高變區(qū)”在用于本文時(shí)指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)包含來(lái)自“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(如輕鏈可變區(qū)中的殘基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)及重鏈可變區(qū)中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991)和/或來(lái)自“高變環(huán)”的殘基(例如輕鏈可變區(qū)中的殘基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及重鏈可變區(qū)中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196901-917(1987))。“框架”或“FR”殘基指本文定義的高變區(qū)殘基以外的可變區(qū)殘基。
“結(jié)合”目的抗原的抗體是這樣的抗體，其能夠以充分的親和力和/或親和力結(jié)合該抗原，因而該抗體可用作靶向表達(dá)該抗原的細(xì)胞的治療或診斷劑。
對(duì)本文而言，“免疫療法”指用抗體治療哺乳動(dòng)物(優(yōu)選人類患者)的方法，其中所述抗體可以是未偶聯(lián)的或“裸露的”抗體，或者該抗體可以與異源的分子或藥劑，例如一種或多種細(xì)胞毒劑偶聯(lián)或融合，從而產(chǎn)生“免疫偶聯(lián)物”。
“分離的”抗體指已經(jīng)由其天然環(huán)境的一種成分鑒別和分離和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染成分指將會(huì)干擾抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性或非蛋白質(zhì)性的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將抗體純化至(1)根據(jù)Lowry方法的測(cè)定，抗體重量超過(guò)95％，最優(yōu)選重量超過(guò)99％，(2)足以通過(guò)使用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀獲得至少15個(gè)殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)通過(guò)使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選銀染的還原或非還原條件下的SDS-PAGE達(dá)到均一。分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體，因?yàn)榭贵w的天然環(huán)境的至少一種成分不會(huì)存在，然而，分離的抗體通常將通過(guò)至少一個(gè)純化步驟來(lái)制備。
表述“有效量”指預(yù)防、改善或治療所述疾病或病癥有效的量的藥劑(例如Apo2L/TRAIL，抗DR4或DR5抗體等)。
本文中所用的術(shù)語(yǔ)“治療”和“療法”指治愈性療法和預(yù)防性(prophylactic及preventative)療法。連續(xù)治療或施用是指至少每日一次的、治療中無(wú)間斷的、經(jīng)過(guò)一日或多日的治療。間歇性治療或施用，或間歇式治療或施用，指非連續(xù)性，而是周期性的治療。
術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞因子”是由一細(xì)胞群體所釋放的、作為細(xì)胞間的媒介對(duì)另一細(xì)胞起作用的蛋白質(zhì)。這樣的細(xì)胞因子的例子有淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素。細(xì)胞激素包括生長(zhǎng)激素例如人生長(zhǎng)激素，N-甲硫胺酰人生長(zhǎng)激素，和牛生長(zhǎng)激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原(prorelaxin)；糖蛋白激素例如促卵泡激素(FSH)，促甲狀腺素(TSH)，和黃體生成素(LH)；肝生長(zhǎng)因子(hepatic growth factor)；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；促乳素；胎盤催乳激素(placental lactogen)；腫瘤壞死因子-α和-β；中腎旁管抑制物質(zhì)(mullerian-inhibiting substance)；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；激活蛋白；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO)；神經(jīng)生長(zhǎng)因子；血小板生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGFs)例如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和II；紅細(xì)胞生成素；骨誘導(dǎo)因子(osteoinductive factors)；干擾素例如干擾素-α，-β和-γ；集落刺激因子(CSFs)例如巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF)；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-CSF(GM-CSF)和粒細(xì)胞-CSF(G-CSF)；白細(xì)胞介素(ILs)例如IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12，IL-13，IL-17；和其它多肽因子包括LIF和kit配體(KL)。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞因子”包括來(lái)自天然來(lái)源或來(lái)自重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)，和天然序列的細(xì)胞因子的生物學(xué)活性的等同物。
術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒劑”在本文中用來(lái)指抑制或防止細(xì)胞的機(jī)能，和/或造成細(xì)胞的破壞的物質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)意欲包括放射性同位素(例如I131，I125，Y90和Re186)，化學(xué)治療劑，及毒素，例如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來(lái)源的酶活性的毒素或其片段。
“化學(xué)治療劑”是可用于治療癌癥的化學(xué)化合物?；焺┑睦影ㄍ榛瘎╊悾T如噻替哌(thiotepa)和環(huán)膦酰胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類(aziridines)，諸如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和烏瑞替哌(uredopa)；乙撐亞胺類(ethylenimines)和甲基蜜胺類(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撐硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝內(nèi)酯類(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜樹(shù)堿(camptothecin)(包括合成類似物拓?fù)涮婵?topotecan))、苔蘚抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多來(lái)新(adozelesin)、卡折來(lái)新(carzelesin)和比折來(lái)新(bizelesin)合成類似物)；隱藻素類(cryptophycins)(特別是隱藻素1和隱藻素8)；多拉司他丁(dolastatin)；duocarmycin(包括合成類似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海綿抑素(spongistatin)；氮芥類(nitrogen mustards)，諸如氯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、異磷酰胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxidehydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、松龍苯芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲類(nitrosureas)，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素類，諸如烯二炔類(enediyne)抗生素(如加利車霉素(calicheamicin)，尤其是加利車霉素γ1I和加利車霉素ψI1(見(jiàn)例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33183-186(1994)))；蒽環(huán)類抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；二膦酸鹽類(bisphosphonate)，諸如氯膦酸鹽(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新抑癌菌素(neocarzinostatin)發(fā)色團(tuán)和相關(guān)色蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團(tuán)、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放線菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、氮絲氨酸(azaserine)、博來(lái)霉素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(ADRIAMYCINTM)(包括嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脫氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依達(dá)比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素(mitomycin)諸如絲裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、諾加霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培來(lái)霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲霉素(streptozocin)、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物類，諸如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、甲氨喋呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達(dá)拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥(niǎo)嘌呤；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、多西氟尿啶(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)、羥甲雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內(nèi)酯(testolactone)；抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、曼托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補(bǔ)充劑，諸如亞葉酸；醋葡內(nèi)酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；氨苯吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依達(dá)曲沙(edatraxate)；defofamine；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elfornithine)；醋酸羥吡咔唑(elliptinium acetate)；epothilone；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼達(dá)明(lonidamine)；美登木素生物堿類(maytansinoids)，諸如美登素(maytansine)和安絲菌素(ansamitocin))；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達(dá)醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲蘭(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細(xì)交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecene)(尤其是T-2毒素、verracurin A、桿孢菌素(roridin)A和蛇形菌素(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長(zhǎng)春地辛(vindesine)；達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；環(huán)磷酰胺；噻替哌(thiotepa)；類紫杉醇(taxoids)，如紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和多西他塞(doxetaxel)(TAXOTERE，Rhne-Poulenc Rorer，Antony，法國(guó))；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；GEMZAR吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥(niǎo)嘌呤；巰基嘌呤；甲氨喋呤；鉑類似物，諸如順鉑和卡鉑；長(zhǎng)春堿(vinblastine)；鉑；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；異磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；長(zhǎng)春新堿(vincristine)；長(zhǎng)春瑞賓(vinorelbine)(NAVELBINETM)；諾安托(novantrone)；替尼泊甙(teniposide)；依達(dá)曲沙(edatrexate)；柔紅霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；希羅達(dá)(xeloda)；伊拜膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥(niǎo)氨酸(DMFO)；類維A酸，諸如視黃酸；卡培他濱(capecitabine)；以及上述任何物質(zhì)的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。該定義還包括作用于調(diào)節(jié)或抑制激素對(duì)腫瘤的作用的抗激素劑，諸如抗雌激素類和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NolvadexTM)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、keoxifene、LY117018、奧那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(FARESTONTM)；抑制調(diào)節(jié)腎上腺中雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4(5)-咪唑、氨魯米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)(MegaseTM)、依西美坦(exemestane)、福美司坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、伏羅唑(vorozole)(RIVISORTM)、來(lái)曲唑(letrozole)(FemaraTM)和阿納托唑(anastrozole)(ArimidexTM)；及抗雄激素類，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及上述任何物質(zhì)的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。
生長(zhǎng)抑制劑用于本文時(shí)指在體內(nèi)或體外抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，特別是過(guò)表達(dá)任何本文中鑒定的基因的癌細(xì)胞生長(zhǎng)的化合物或組合物。因此，生長(zhǎng)抑制劑顯著地減少在S期過(guò)表達(dá)這些基因的細(xì)胞的百分比。生長(zhǎng)抑制劑的例子包括阻斷細(xì)胞周期進(jìn)行(在不同于S期的他處)的藥劑，例如誘導(dǎo)G1停滯和M期停滯的藥劑。經(jīng)典的M期阻斷劑包括長(zhǎng)春胺(vincas)(長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春堿)，紫杉醇和拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑(topo II inhibitors)，例如多柔比星、表柔比星、柔紅霉素、依托泊苷和博來(lái)霉素。導(dǎo)致G1停滯的藥劑還會(huì)進(jìn)而導(dǎo)致S期停滯，例如，DNA烷基化劑諸如他莫昔芬、潑尼松(prednisone)、達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)、雙氯乙基甲胺、順鉑(cisplatin)、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶，和阿糖胞苷。更多信息可以在The Molecular Basis ofCancer，Mendelsohn和Israel編，第一章題為“Cell cycle regulation，oncogens，and antineoplastic drugs”作者為Murakami等人(WB SaundersPhiladelphia，1995)，特別是第13頁(yè)找到。
術(shù)語(yǔ)“凋亡”和“凋亡活性”在本文中以其廣義使用，指哺乳動(dòng)物中有序或受控形式的細(xì)胞死亡，其典型地伴隨著一種或多種特征性的細(xì)胞變化，包括細(xì)胞質(zhì)的濃縮，質(zhì)膜微絨毛的喪失，細(xì)胞核的片段化，染色體DNA的降解或線粒體功能的喪失。該活性可以通過(guò)例如本領(lǐng)域已知的細(xì)胞存活力測(cè)定(例如Alamar blue測(cè)定或MTT測(cè)定)、FACS分析、胱天蛋白酶活化、DNA斷裂(見(jiàn)例如Nicoletti等人，J.Immunol.Methods，139271-279(1991))、及聚-ADP核糖聚合酶“PARP”，切割分析等確定和測(cè)量。
本文使用的“障礙(疾病)”(disorder)泛指任何可從使用本文描述的組合物的治療受益的狀況，包括任何可用有效量的Apo2L/TRAIL、抗DR4抗體，和/或抗DR5抗體治療的疾病或障礙。這包括慢性和急性的障礙，以及使得所述哺乳動(dòng)物易于遭受所述障礙的病理狀態(tài)。本文中要治療的障礙的非限制性例子包括良性和惡性癌；炎性、血管發(fā)生性和免疫性障礙，自身免疫障礙，關(guān)節(jié)炎(包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)，多發(fā)性硬化，和HIV/AIDS。
術(shù)語(yǔ)“癌癥”(cancer)、“癌性”(cancerous)或“惡性”(malignant)是指代或描述哺乳動(dòng)物中的典型地以不受調(diào)控的細(xì)胞生長(zhǎng)為特征的生理狀態(tài)。癌癥的例子包括但不限于，癌瘤(carcinoma)，淋巴瘤，白血病，母細(xì)胞瘤，和肉瘤。所述癌癥的更具體的例子包括鱗狀細(xì)胞癌、骨髓瘤、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、膠質(zhì)瘤、胃腸(道)癌、腎癌(renal cancer)、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、急性淋巴細(xì)胞白血病、淋巴細(xì)胞白血病、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌(kidney cancer)、前列腺癌、甲狀腺癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、胰腺癌、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、宮頸癌、腦癌、胃癌、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、乳腺癌、結(jié)腸癌和頭頸癌(head and neck cancer)。
術(shù)語(yǔ)“免疫相關(guān)疾病”指哺乳動(dòng)物中免疫系統(tǒng)成分引起、介導(dǎo)、或以其它方式促成哺乳動(dòng)物發(fā)病的疾病。還包括刺激或干預(yù)免疫應(yīng)答對(duì)疾病發(fā)展具有改善作用的疾病。此術(shù)語(yǔ)包括自身免疫病、免疫介導(dǎo)的炎性疾病、非免疫介導(dǎo)的炎性疾病、傳染病、和免疫缺陷病?？梢勒毡景l(fā)明治療的免疫相關(guān)和炎性疾病的例子，其中有些是免疫或T細(xì)胞介導(dǎo)的，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年型慢性關(guān)節(jié)炎、脊椎關(guān)節(jié)病、系統(tǒng)性硬化病(硬皮病)、特發(fā)性炎性肌病(皮肌炎、多肌炎)、斯耶格倫氏綜合征、系統(tǒng)性血管炎、結(jié)節(jié)病、自身免疫性溶血性貧血(免疫性全血細(xì)胞減少癥、陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿)、自身免疫性血小板減少癥(特發(fā)性血小板減少性紫癜、免疫介導(dǎo)的血小板減少癥)、甲狀腺炎(格雷夫斯氏病、橋本氏甲狀腺炎、幼年型淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎、萎縮性甲狀腺炎)、糖尿病、免疫介導(dǎo)的腎病(腎小球腎炎、腎小管間質(zhì)性腎炎)、中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘病諸如多發(fā)性硬化病、特發(fā)性脫髓鞘多神經(jīng)病或格-巴二氏綜合征、和慢性炎性脫髓鞘多神經(jīng)病、肝膽病諸如傳染性肝炎(甲型、乙型、丙型、丁型、戊型和其它非嗜肝病毒肝炎)、自身免疫性慢性活動(dòng)性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、肉芽腫性肝炎、和硬化性膽管炎、炎性和纖維化肺病諸如炎性腸病(潰瘍性結(jié)腸炎克羅恩氏病)、麩膠敏感性腸病、和惠普爾氏病、自身免疫性或免疫介導(dǎo)的皮膚病包括大皰性皮膚病、多形紅斑和接觸性皮炎、銀屑病、變應(yīng)性疾病諸如哮喘、變應(yīng)性鼻炎、特應(yīng)性皮炎、食物超敏反應(yīng)和蕁麻疹、肺的免疫學(xué)疾病諸如嗜曙紅細(xì)胞性肺炎、特發(fā)性肺纖維化和超敏感性肺炎、移植相關(guān)疾病包括移植物排斥和移植物抗宿主疾病。傳染病包括AIDS(HIV感染)、甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎、細(xì)菌感染、真菌感染、原生動(dòng)物感染和寄生蟲(chóng)感染。
“自身免疫疾病”使用其廣義、一般性的意義，指哺乳動(dòng)物中的障礙或病癥，其中所述哺乳動(dòng)物個(gè)體對(duì)其自身組織成分的體液或細(xì)胞免疫反應(yīng)導(dǎo)致正?；蚪】到M織的破壞。例子包括，但不限于，紅斑狼瘡，甲狀腺炎，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，銀屑病，多發(fā)性硬化，自身免疫性糖尿病(autoimmunediabetes)，及炎性腸病(IBD)。
術(shù)語(yǔ)“帶標(biāo)簽的”(tagged)在本文中用來(lái)指包含與“標(biāo)簽多肽”融合的抗體或多肽的嵌合分子標(biāo)簽多肽具有足夠的殘基來(lái)提供可針對(duì)其制造抗體的表位，或提供其它的某些功能例如寡聚化(例如具有亮氨酸拉鏈的肽所發(fā)生的)的能力，但該多肽又足夠短，使得其通常不影響所述抗體或多肽的活性。所述標(biāo)簽多肽優(yōu)選地還具有相當(dāng)?shù)莫?dú)特性，使得針對(duì)標(biāo)簽特異性的抗體不與其它表位發(fā)生顯著的交叉反應(yīng)。合適的標(biāo)簽多肽一般具有至少6個(gè)氨基酸殘基，通常為約8個(gè)到約50個(gè)氨基酸殘基(優(yōu)選地，約10到約20個(gè)殘基之間)。
術(shù)語(yǔ)“二價(jià)金屬離子”指具有兩個(gè)正電荷的金屬離子。二價(jià)金屬離子的例子包括但不限于鋅、鈷、鎳、鎘、鎂和錳。所述金屬的可以利用的具體形式包括鹽形式(例如藥學(xué)上可接受的鹽形式)，例如上述二價(jià)金屬的氯化物、乙酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽和硫酸鹽形式?？蛇x地，用于本發(fā)明的二價(jià)金屬離子是鋅，優(yōu)選為鹽形式硫酸鋅或氯化鋅。
“分離的”當(dāng)用于描述本文所公開(kāi)的各種肽或蛋白質(zhì)時(shí)，意思是肽或蛋白質(zhì)已經(jīng)由其天然環(huán)境的成分鑒別和分離和/或回收。其天然環(huán)境的污染性成分是可通常干擾所述肽或蛋白質(zhì)的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素和其它蛋白質(zhì)性的或非蛋白質(zhì)性的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將所述肽或蛋白質(zhì)純化至(1)根據(jù)Lowry方法的測(cè)定，抗體重量超過(guò)95％，最優(yōu)選重量超過(guò)99％，(2)足以通過(guò)使用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀獲得至少15個(gè)殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)通過(guò)使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選銀染的還原或非還原條件下的SDS-PAGE達(dá)到均一。分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體，因?yàn)榭贵w的天然環(huán)境的至少一種成分不會(huì)存在，然而，分離的肽或蛋白質(zhì)通常將通過(guò)至少一個(gè)純化步驟來(lái)制備。
針對(duì)本文中鑒定的序列的“氨基酸序列同一性百分率(％)”定義為，在比對(duì)所述序列，并且必要的話引入缺口，以達(dá)到最大的序列同一性百分率以后，候選序列中與參考序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分?jǐn)?shù)，并且不將任何保守性替代看作序列同一性的部分。為確定氨基酸序列同一性百分率所作的比對(duì)可以通過(guò)本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)之內(nèi)的多種方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定合適的衡量序列匹配的參數(shù)，包括在被比較的全長(zhǎng)序列上實(shí)現(xiàn)最大序列匹配所需的指認(rèn)算法(assigning algorithms)。對(duì)本文而言，氨基酸同一性百分率的值可以使用序列比較計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2獲得，該程序由Genentech Inc.創(chuàng)作，其源代碼和用戶文檔已提交到美國(guó)版權(quán)局(US Copyright Office，Washington DC，20559)，注冊(cè)為美國(guó)版權(quán)注冊(cè)號(hào)TXU510087。公眾可通過(guò)Genentech，Inc.，South San Francisco，CA.獲取ALIGN-2程序。所有序列比較參數(shù)都由ALIGN-2程序設(shè)定并且不改變。
雜交反應(yīng)的“嚴(yán)緊度”可由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員容易地確定，其通常是根據(jù)探針長(zhǎng)度、洗滌溫度和鹽濃度經(jīng)驗(yàn)計(jì)算的。一般而言，較長(zhǎng)的探針需要較高的溫度來(lái)進(jìn)行合適的退火，而較短的探針需要的溫度較低。雜交通常依賴于變性的DNA在它們的熔點(diǎn)溫度以下環(huán)境中存在互補(bǔ)鏈時(shí)重新退火的能力。探針與可雜交的序列之間所需的同一性程度越高，可使用的相對(duì)溫度就越高。從而，較高的相對(duì)溫度傾向于使反應(yīng)條件更嚴(yán)緊，而較低的溫度則較少如此。更多的細(xì)節(jié)以及雜交反應(yīng)的嚴(yán)緊度的解釋可參見(jiàn)Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley IntersciencePublishers，(1995)。
本文所定義的“高嚴(yán)緊度條件”由下面的條件確定(1)洗滌使用低離子強(qiáng)度和高的溫度；0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％十二烷基硫酸鈉，50℃；(2)在雜交過(guò)程中使用變性劑；50％(v/v)甲酰胺和0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液，pH 6.5，及750mM氯化鈉，75mM檸檬酸鈉，42℃；或(3)使用50％甲酰胺，5xSSC(0.75M NaCl，0.075M檸檬酸鈉)，50mM磷酸鈉(pH 6.8)，0.1％焦磷酸鈉，5xDenhardt溶液，超聲處理過(guò)的鮭精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS及10％硫酸葡聚糖，42℃，并在42℃下，0.2xSSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)中和55℃下，50％甲酰胺中洗滌，然后進(jìn)行由55℃的含EDTA的0.1xSSC組成的高嚴(yán)緊度洗滌。
“中度嚴(yán)緊條件”可以如Sambrook等人，Molecular CloningALaboratory Manual，New YorkCold Spring Harbor Press，1989所述確定，包括在包含20％甲酰胺，5xSSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH 7.6)，5xDenhardt溶液，10％硫酸葡聚糖和20mg/ml變性剪切的鮭精DNA的溶液中37℃下溫育過(guò)夜，然后在1xSSC中37-50℃下洗滌濾液。本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解如何按需要調(diào)節(jié)溫度、離子強(qiáng)度等以適應(yīng)探針長(zhǎng)度等因素。
術(shù)語(yǔ)“引物”指這樣的寡核苷酸序列，其與互補(bǔ)RNA或DNA目標(biāo)多核苷酸雜交，并作為起點(diǎn)，在核苷酰轉(zhuǎn)移酶的作用下，由單核苷酸逐步合成多核苷酸，如在多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中發(fā)生的那樣。
術(shù)語(yǔ)“控制序列”指DNA序列在特定的宿主生物中表達(dá)可操作地連接的編碼序列所需要的DNA序列。例如，適于原核生物的控制序列包括啟動(dòng)子，可選地操縱子序列，和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞使用啟動(dòng)子、聚腺苷酸化信號(hào)和增強(qiáng)子。
當(dāng)核酸序列被置于與另一核酸序列的功能關(guān)系中時(shí)，其被“可操作地連接”。例如，前序列或分泌前導(dǎo)序列的DNA如果表達(dá)為參與多肽的分泌的前蛋白，則所述前序列或分泌前導(dǎo)序列的DNA與所述多肽的DNA是可操作地連接的；啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的DNA如果影響某編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則其與該編碼序列是可操作地連接的；或者，核糖體結(jié)合位點(diǎn)如果位于便于翻譯的位置，則其與編碼序列是可操作地連接的。通常，“可操作地連接”意味著被連接的DNA序列是鄰接的，并且，就分泌前導(dǎo)序列而言，是連續(xù)的并且共閱讀框(in reading phase)。但是，增強(qiáng)子不需要是鄰接的。連接是通過(guò)在方便的限制性位點(diǎn)進(jìn)行連接反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的。如果這樣的位點(diǎn)不存在，則根據(jù)常規(guī)的做法使用合成的寡核苷酸銜接子或接頭。
“抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性”和“ADCC”指由細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá)Fc受體(FcR)的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞(如天然殺傷(NK)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)識(shí)別靶細(xì)胞上的結(jié)合抗體，隨后引起靶細(xì)胞溶解。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞——NK細(xì)胞，只表達(dá)FcγRIII，而單核細(xì)胞表達(dá)FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9457-92(1991)中第464頁(yè)表3總結(jié)了造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)。為了評(píng)估目的分子的ADCC活性，可進(jìn)行體外ADCC測(cè)定法，諸如美國(guó)專利5,500,362或5,821,337中所描述的?？捎糜诖祟悳y(cè)定法的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞。或者/另外，可在體內(nèi)評(píng)估目的分子的ADCC活性，例如在動(dòng)物模型中，諸如Clynes等人，PNAS(USA)95652-656(1998)中所公開(kāi)的。
“人效應(yīng)細(xì)胞”指表達(dá)一種或多種FcR并行使效應(yīng)物功能的白細(xì)胞。優(yōu)選的是，該細(xì)胞至少表達(dá)FcγRIII并執(zhí)行ADCC效應(yīng)物功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的例子包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)“Fc受體”或“FcR”用于描述與抗體Fc區(qū)結(jié)合的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列人FcR。此外，優(yōu)選的FcR是與IgG抗體結(jié)合的FcR(γ受體)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體和可變剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA(“激活受體”)和FcγRIIB(“抑制受體”)，它們具有相似的氨基酸序列，區(qū)別主要在于其胞質(zhì)域。激活受體FcγRIIA在其胞質(zhì)域中包含基于免疫受體酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其胞質(zhì)域中包含基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參見(jiàn)Daron，Annu.Rev.Immunol.15203-234(1997))。FcR的綜述參見(jiàn)Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9457-492(1991)；Capel等人.，Immunomethods 425-34(1994)；及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126330-341(1995))。術(shù)語(yǔ)“FcR”在本文中涵蓋其它FcR，包括未來(lái)將會(huì)鑒定的FcR。該術(shù)語(yǔ)還包括新生兒受體，F(xiàn)cRn，它負(fù)責(zé)將母體的IgG轉(zhuǎn)移給胎兒(Guyer等人，J.Immunol.117587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24249(1994))。這里，F(xiàn)cR包括多態(tài)性，例如在編碼FcγRIIIa的基因中的遺傳二態(tài)性，造成該受體結(jié)合IgG1的區(qū)域中158位上的氨基酸為苯丙氨酸(F)或纈氨酸(V)。相對(duì)于純合的苯丙氨酸FcγRIIIa(FcγRIIIa-158F)或雜合的(FcγRIIIa-158F/V)受體，純合的纈氨酸FcγRIIIa(FcγRIIIa-158V)已被證明對(duì)人IgG1具有更高的親和性，且其體外介導(dǎo)的ADCC增加。
“補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性”或“CDC”指在存在補(bǔ)體時(shí)分子溶解靶物的能力。補(bǔ)體激活途徑是由補(bǔ)體系統(tǒng)第一組分(C1q)結(jié)合與關(guān)聯(lián)抗原復(fù)合的分子(如抗體)起始的。為了評(píng)估補(bǔ)體激活，可進(jìn)行CDC測(cè)定法，例如Gazzano-Santoro等人.，J.Immunol.Methods 202163(1996)中所描述的。
II本發(fā)明的典型方法和材料本文所公開(kāi)的方法和測(cè)定法涉及檢查哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞樣品中的一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)，其中一種或多種所述生物標(biāo)志的表達(dá)的確定預(yù)示或表明所述組織或細(xì)胞樣品是否將對(duì)凋亡誘導(dǎo)劑例如Apo2L/TRAIL和抗DR5激動(dòng)劑抗體敏感。所述方法和測(cè)定法包括那些檢查諸如某些巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，特別是巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶3(FUT3)和/或巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶6(FUT6)，及唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原等生物標(biāo)志的表達(dá)的方法。
如上面討論的，一些人類疾病細(xì)胞類型的群體(例如某些癌細(xì)胞群體)對(duì)凋亡誘導(dǎo)具有抗性。因此相信這里公開(kāi)的方法和測(cè)定法可提供方便、高效且潛在的經(jīng)濟(jì)的(cost-effective)手段，來(lái)獲得有用的數(shù)據(jù)和信息用于評(píng)估治療患者的合適的或有效的療法。例如，已經(jīng)被診斷為患有癌癥或免疫相關(guān)病癥的患者可以進(jìn)行活檢以獲得組織或細(xì)胞樣品，然后通過(guò)多種體外測(cè)定檢查該樣品以確定該患者的細(xì)胞是否會(huì)對(duì)治療劑例如Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體敏感。
本發(fā)明提供預(yù)測(cè)哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞樣品(例如癌細(xì)胞)對(duì)Apo2L/TRAIL或死亡受體激動(dòng)劑抗體的敏感性的方法。在這些方法中，獲得哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞樣品并檢查其一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)。這些方法可使用多種測(cè)定模式進(jìn)行，包括檢測(cè)mRNA表達(dá)的測(cè)定，檢測(cè)酶活性存在的酶測(cè)定，免疫組化測(cè)定和本文中描述的其它測(cè)定。所述生物標(biāo)志的表達(dá)的確定預(yù)示或表明所述組織或細(xì)胞樣品將對(duì)Apo2L/TRAIL和死亡受體抗體抗體敏感。申請(qǐng)人驚奇地發(fā)現(xiàn)，這些生物標(biāo)志的表達(dá)與這些組織和細(xì)胞對(duì)凋亡誘導(dǎo)劑例如Apo2L/TRAIL和死亡受體激動(dòng)劑抗體的敏感性相互關(guān)聯(lián)。
如下所述，樣品中許多生物標(biāo)志的表達(dá)可以用多種方法來(lái)分析，這些中很多是本領(lǐng)域已知并為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，包括但不限于，免疫組化和/或Western分析，定量的基于血液的測(cè)定(例如血清ELISA)(例如用來(lái)檢查蛋白表達(dá)水平)，生化酶活性測(cè)定，原位雜交，mRNA的Northern分析和/或PCR分析，和基因組Southern分析(例如用來(lái)檢查基因缺失或擴(kuò)增)，以及多種可通過(guò)基因和/或組織陣列分析進(jìn)行的測(cè)定中的任何一種。評(píng)估基因和基因產(chǎn)物狀況的典型規(guī)程可見(jiàn)例如Ausubel等人編，1995，Current Protocols In Molecular Biology，第2(Northern印跡)，第4(Southern印跡)，第15(免疫印跡)和第18(PCR分析)單元。
為了舉例說(shuō)明，下面提供涉及特定生物標(biāo)志，例如巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶3(FUT3)，巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶6(FUT6)，唾液酰Lewis A，和唾液酰Lewis X的檢測(cè)的規(guī)程。
本發(fā)明的可選的方法包括檢查或檢驗(yàn)哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞樣品中唾液酰Lewis A(sialyl Lewis A)和/或唾液酰Lewis X蛋白質(zhì)的存在的規(guī)程?？梢允褂枚喾N方法來(lái)檢測(cè)唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis相關(guān)蛋白，例如免疫組化分析，免疫沉淀，Western印跡分析，分子結(jié)合測(cè)定，ELISA，ELIFA，熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)等。例如，一種檢測(cè)組織或樣品中唾液酰LewisA和/或唾液酰Lewis X相關(guān)蛋白的表達(dá)的可選方法包括將樣品與唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗體、其唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X反應(yīng)性片段，或含有唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗體的抗原結(jié)合區(qū)域的重組蛋白接觸；然后檢測(cè)樣品中唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X相關(guān)蛋白的結(jié)合。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，使用免疫組化和染色規(guī)程來(lái)檢查樣品中唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X蛋白的表達(dá)。組織切片的免疫組化染色已被證明是評(píng)估或檢測(cè)樣品中蛋白質(zhì)的存在的可靠方法。免疫組化(“IHC”)技術(shù)使用抗體來(lái)原位探測(cè)并顯現(xiàn)細(xì)胞抗原，通常利用生色或熒光方法。
樣品的制備可以使用來(lái)自哺乳動(dòng)物(通常為人類患者)的組織或細(xì)胞樣品。樣品的例子包括但不限于癌細(xì)胞，例如結(jié)腸、乳腺、前列腺、卵巢、肺、胃、胰腺、淋巴瘤和白血病的癌細(xì)胞。所述樣品可以通過(guò)本領(lǐng)域的多種已知方法獲得，包括但不限于手術(shù)切除、抽吸或活檢。所述組織可以是新鮮的或冷凍的。在一個(gè)實(shí)施方案中，該樣品被固定并包埋在石蠟等中。
組織樣品可以用常規(guī)方法固定(及保存)(見(jiàn)，例如，“Manual ofHistological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology，”第三版(1960)Lee G.Luna，HT(ASCP)編，The Blakston Division McGraw-HillBook Company，New York；The Armed Forces Institute of Pathology AdvancedLaboratory Methods in Histology and Pathology(1994)Ulreka V.Mikel編，Armed Forces Institute of Pathology，American Registry of Pathology，Washington，D.C.)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，固定劑的選擇取決于對(duì)該樣品作組織染色或其它分析的目的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還將理解，固定的時(shí)間長(zhǎng)短依賴于組織樣品的大小和所用的固定劑。舉例而言，中性緩沖的福爾馬林、布安固定液(Bouin’s)或多聚甲醛都可以用來(lái)固定樣品。
一般而言，首先將樣品固定，然后通過(guò)遞增系列濃度的醇脫水，用石蠟或其它切片介質(zhì)浸潤(rùn)并包埋，使組織樣品可切片。作為選擇，可以將組織切片，并固定所得的切片。舉例而言，可以根據(jù)常規(guī)的方法將組織樣品包埋在石蠟中并處理(見(jiàn)例如“Manual of Histological Staining Method of theArmed Forces Institute of Pathology”，同上)?？墒褂玫氖灥睦影ǖ幌抻赑araplast，Broloid和Tissuemay。一旦組織樣品被包埋，則可用切片機(jī)等將組織切片(見(jiàn)例如“Manual of Histological Staining Method of theArmed Forces Institute of Pathology”，同上)。舉例而言，該方法切片的厚度可為約3微米到約5微米。切片后，即可使用多種標(biāo)準(zhǔn)方法將切片附著在玻片上。玻片的粘合劑的例子包括但不限于硅烷、明膠、聚-L-賴氨酸等。例如，石蠟包埋的切片可以附著于帶正電的玻片和/或聚L-賴氨酸包被的玻片。
如果包埋材料使用的是石蠟，組織切片通常被脫石蠟(deparaffinize)并用水重新水化。組織切片可以用數(shù)種標(biāo)準(zhǔn)方法脫石蠟。例如，可以使用二甲苯和逐漸降低的系列濃度的醇(見(jiàn)例如“Manual of Histological StainingMethod of the Armed Forces Institute of Pathology”，同上)?；蛘呖墒褂每缮藤?gòu)的非有機(jī)脫石蠟劑例如Hemo-De7(CMS，Houston，Texas)。
可選地，制備樣品以后，可使用IHC分析組織切片。IHC可與其它的技術(shù)例如形態(tài)學(xué)染色(morphological staining)和/或熒光原位雜交組合使用?？捎玫腎HC方法有兩種直接和間接測(cè)定。根據(jù)第一種測(cè)定法，直接確定抗體對(duì)目標(biāo)抗原(例如唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X)的結(jié)合。該直接測(cè)定使用使用無(wú)需進(jìn)一步抗體相互作用即可顯現(xiàn)的標(biāo)記試劑，例如熒光標(biāo)簽或酶標(biāo)記的第一抗體。在典型的間接測(cè)定中，非偶聯(lián)的第一抗體結(jié)合抗原，然后標(biāo)記的第二抗體結(jié)合該第一抗體。在第二抗體與酶標(biāo)記物結(jié)合的情況下，加入生色或熒光底物以顯現(xiàn)抗原。由于數(shù)個(gè)不同的第二抗體可與第一抗體的不同表位反應(yīng)，產(chǎn)生信號(hào)的放大。
免疫組化所用的第一和/或第二抗體通常用可檢測(cè)的部分標(biāo)記?？捎玫臉?biāo)記物很多，通?？梢苑譃橄旅鎺最?a)放射性同位素，例如35S，14C，125I，3H，和131I。例如，可以根據(jù)Current Protocols in Immunology，第1、2卷，Coligen等人編，Wiley-Interscience，New York，New York，Pubs.(1991)中描述的方法用放射性同位素標(biāo)記抗體，放射性可以用閃爍計(jì)數(shù)法測(cè)量。
(b)膠體金顆粒。
(c)熒光標(biāo)記，包括但不限于稀土螯合物(銪螯合物)，德克薩斯紅，羅丹明，螢光素，丹磺酰，麗絲胺(Lissamine)，傘形酮，藻紅蛋白(phycocrytherin)，藻藍(lán)蛋白，或可商購(gòu)的熒光團(tuán)，例如SPECTRUMORANGE7和SPECTRUM GREEN7和/或上述一種或多種的衍生物。熒光標(biāo)記物可以例如用Current Protocols in Immunology，同上，公開(kāi)的技術(shù)與抗體偶聯(lián)。熒光可以用熒光計(jì)定量。
(d)可用的酶底物有很多，美國(guó)專利4,275,149綜述了其中的一些。酶通常催化生色底物發(fā)生可以用多種技術(shù)測(cè)量的化學(xué)改變。例如，酶可催化底物中的顏色變化，該變化可以用分光光度方法測(cè)量?；蛘?，酶可改變底物的熒光或化學(xué)發(fā)光。定量熒光變化的技術(shù)如上所述?；瘜W(xué)發(fā)光底物通過(guò)化學(xué)反應(yīng)成為電子激發(fā)狀態(tài)，然后可能發(fā)射可測(cè)量(例如使用化學(xué)發(fā)光分析儀)的光，或者將能量供給熒光受體。酶標(biāo)記物的例子包括螢光素酶(例如螢火蟲(chóng)熒光素酶和細(xì)菌熒光素酶；美國(guó)專利4,737,456；熒光素，2，3-二氫肽嗪二酮(2，3-dihydrophthalazinediones)，蘋果酸脫氫酶(malatedehydrogenase)，脲酶，過(guò)氧化物酶例如辣根過(guò)氧化物酶(HRPO)，堿性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)，雜環(huán)氧化酶(例如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)，乳過(guò)氧化物酶，微過(guò)氧化物酶等。將酶偶聯(lián)到抗體的技術(shù)在O′Sullivan等人，Methods for the Preparation of Enzyme-抗體Conjugatesfor use in Enzyme Immunoassay，于Methods in Enzym.中(J.Langone和H.VanVunakis編)，Academic press，New York，73147-166(1981)中有描述。
酶-底物組合的例子包括，例如(i)辣根過(guò)氧化物酶(HRPO)及底物過(guò)氧化氫，其中該過(guò)氧化物酶氧化染料前體(例如正苯二胺(OPD)或鹽酸3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)；(ii)堿性磷酸酶(AP)及生色底物對(duì)-磷酸硝基苯酯；和(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)及生色底物(例如對(duì)硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或熒光底物(例如4-甲基傘形基-β-D-半乳糖苷酶)。
對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言可用的其它酶-底物組合有很多。關(guān)于這些的一般性綜述可參見(jiàn)美國(guó)專利4,275,149和4,318,980。有時(shí)，標(biāo)記物和抗體是間接地偶聯(lián)的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可知道多種實(shí)現(xiàn)此目的的技術(shù)。例如，可以將抗體和生物素偶聯(lián)，并將上述四大類標(biāo)記物中的任意標(biāo)記物與抗生物素蛋白偶聯(lián)，反之亦然。生物素選擇性地與抗生物素蛋白結(jié)合，這樣所述標(biāo)記物就可以間接地與所述抗體結(jié)合。或者，為了實(shí)現(xiàn)標(biāo)記物和抗體的間接偶聯(lián)，將抗體與小的半抗原偶聯(lián)，將上述不同類型標(biāo)記物中的一種與抗半抗原抗體偶聯(lián)。這樣，可實(shí)現(xiàn)所述標(biāo)記物與抗體的間接偶聯(lián)。
除了上面討論的樣品制備方法，可能需要在IHC之前、之中和之后進(jìn)一步處理所述組織切片。例如可進(jìn)行表位修復(fù)(epitope retrieval)方法，例如在檸檬酸緩沖液中加熱組織樣品(參見(jiàn)例如，Leong等人Appl.Immunohistochem.4(3)201(1996))。
在可選的封閉步驟后，將組織切片在合適的條件下暴露于第一抗體充分的時(shí)間，使得第一抗體結(jié)合組織樣品中的目標(biāo)蛋白質(zhì)抗原。實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)的合適條件可以通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。通過(guò)使用上述的任一種可檢測(cè)標(biāo)記物來(lái)確定抗體結(jié)合樣品的程度。優(yōu)選地，標(biāo)記物是酶標(biāo)記物(例如HRPO)，其催化生色底物例如3，3’-二氨基聯(lián)苯胺生色團(tuán)的化學(xué)變化。優(yōu)選地，所述酶標(biāo)記物與特異性結(jié)合第一抗體的抗體偶聯(lián)(例如，第一抗體是兔多克隆抗體，第二抗體是山羊抗兔抗體)。
可選地，IHC分析中用來(lái)檢測(cè)唾液酰Lewis A或唾液酰Lewis X的表達(dá)的抗體分別是抗唾液酰Lewis A和抗唾液酰Lewis X抗體?？蛇x地，所述抗唾液酰Lewis A和抗唾液酰Lewis X抗體是單克隆抗體?？雇僖乎ewis A和抗唾液酰Lewis X抗體在本領(lǐng)域中是很容易得到的，包括從多個(gè)商業(yè)來(lái)源獲得。
這樣制備的樣品可以封固并加蓋玻片。然后對(duì)樣品進(jìn)行評(píng)估，例如使用顯微鏡，而且可以使用本領(lǐng)域常規(guī)使用的染色強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)。在抗原是唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X蛋白質(zhì)的情況下，可以如下評(píng)估染色強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)表1

典型地，在這樣的IHC測(cè)定中，2+左右或更高的染色型態(tài)被認(rèn)為預(yù)示或表明哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞)對(duì)Apo2L/TRAIL或死亡受體激動(dòng)劑抗體的敏感性。
在其它的方法中，可以使樣品和對(duì)所述生物標(biāo)志特異性的抗體在足以形成抗體-生物標(biāo)志復(fù)合物的條件下接觸，然后檢測(cè)所述復(fù)合物。生物標(biāo)志的存在可以通過(guò)多種方式檢測(cè)，例如通過(guò)Western印跡和ELISA方法來(lái)測(cè)定多種組織和樣品，包括血漿或血清。使用這樣的測(cè)定模式的免疫測(cè)定技術(shù)有很多，參見(jiàn)例如，美國(guó)專利4,016,043，4,424,279和4,018,653。上述這些包括非競(jìng)爭(zhēng)性類型的單位點(diǎn)和雙位點(diǎn)或“夾心”測(cè)定法，以及傳統(tǒng)的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法。這些測(cè)定法還包括標(biāo)記的抗體直接結(jié)合目標(biāo)生物標(biāo)志。
夾心測(cè)定法是最有用和最常用的測(cè)定法之一。夾心測(cè)定技術(shù)存在多種變化形式，本發(fā)明意圖涵蓋所有這些變化形式。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在典型的正向測(cè)定(forward assay)中，將未標(biāo)記的抗體固定在固相支持物上，將待測(cè)樣品與所述結(jié)合的分子接觸。在一段合適的時(shí)間的溫育后，其中溫育時(shí)間足以允許抗體-抗原復(fù)合物的形成，加入對(duì)所述抗原特異性的、且用能夠產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的報(bào)道分子標(biāo)記的第二抗體并溫育，提供充分的時(shí)間供另一抗體-抗原-標(biāo)記抗體的復(fù)合物形成。洗去任何未反應(yīng)的物質(zhì)，然后通過(guò)觀察報(bào)道分子產(chǎn)生的信號(hào)確定抗原的存在。這些結(jié)果可以是通過(guò)簡(jiǎn)單觀察可視信號(hào)而得的定性結(jié)果，也可以通過(guò)與含有已知量的生物標(biāo)志的對(duì)照樣品比較而定量。
正向測(cè)定的變化形式包括同時(shí)測(cè)定(simultaneous assay)，其中樣品和標(biāo)記的抗體被同時(shí)施加于結(jié)合的抗體。這些技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是熟知的，包括顯而易見(jiàn)的微小變化。在典型的正向夾心測(cè)定中，對(duì)生物標(biāo)志具有特異性的第一抗體共價(jià)地或被動(dòng)地(passively)結(jié)合到固體表面。固體表面通常是玻璃或聚合物，其中最常用的聚合物為纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。所述固相支持物的形式可以是管、珠子、微量培養(yǎng)板的盤，或任何其它適于實(shí)施免疫測(cè)定的表面。結(jié)合過(guò)程是本領(lǐng)域熟知的，通常由交聯(lián)共價(jià)結(jié)合或物理吸附組成，在制備待測(cè)樣品的過(guò)程中洗滌所述聚合物-抗體復(fù)合物。然后將等份待測(cè)樣品施加于固相復(fù)合物并在合適的條件下(例如從室溫到40℃，如25℃到32℃之間(含二端點(diǎn)))溫育足夠的時(shí)間(例如2-40分鐘或者過(guò)夜，如果更方便的話)以允許抗體中存在的任何亞基的結(jié)合。溫育階段以后，將抗體亞基固相洗滌并干燥，并與對(duì)所述生物標(biāo)志的部分特異的第二抗體溫育。第二抗體與報(bào)道分子連接，報(bào)道分子用來(lái)表征該第二抗體與該分子標(biāo)志的結(jié)合。
另外一種方法涉及將樣品中的目標(biāo)生物標(biāo)志固定，然后將被固定的目標(biāo)暴露于特異性的抗體，該抗體可以用也可以不用報(bào)道分子標(biāo)記。依賴于目標(biāo)的量和報(bào)道分子信號(hào)的強(qiáng)度，結(jié)合的目標(biāo)可通過(guò)用抗體直接標(biāo)記而得以檢測(cè)?；蛘?，將對(duì)第一抗體特異性的且被標(biāo)記的第二抗體暴露于目標(biāo)-第一抗體復(fù)合物，形成目標(biāo)-第一抗體-第二抗體三元復(fù)合物。通過(guò)報(bào)道分子發(fā)出的信號(hào)檢測(cè)該復(fù)合物。本說(shuō)明書(shū)中使用的“報(bào)道分子”指這樣的分子，其由于自身化學(xué)性質(zhì)提供可分析鑒定的信號(hào)，該信號(hào)使結(jié)合抗原的抗體能夠被檢測(cè)。在這種類型的測(cè)定法中最常用的報(bào)道分子是酶，熒光團(tuán)或含放射性核素的分子(即放射性同位素)，和化學(xué)發(fā)光的分子。
在酶免疫測(cè)定中，酶與第二抗體偶聯(lián)，一般是通過(guò)戊二醛或高碘酸鹽偶聯(lián)。但是很容易認(rèn)識(shí)到，存在本領(lǐng)域技術(shù)人員容易得到的多種不同的偶聯(lián)技術(shù)。常用的酶包括辣根過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶和堿性磷酸酶等等。通常，選擇在特定酶水解時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)的顏色變化的底物來(lái)與相應(yīng)的酶一起使用?？墒褂玫拿傅睦影▔A性磷酸酶和過(guò)氧化物酶。也可以使用熒光底物，其產(chǎn)生熒光產(chǎn)物而不是上述的生色底物。在所有的情況下，將酶標(biāo)記的抗體施加于所述第一抗體-分子標(biāo)志復(fù)合物，讓其結(jié)合，然后去除多余的試劑。然后向該抗體-抗原-抗體復(fù)合物施加含有合適底物的溶液。底物將與和第二抗體連接的酶反應(yīng)，產(chǎn)生定性的可視信號(hào)，該信號(hào)可以進(jìn)一步定量，通常通過(guò)分光光度法，來(lái)指示樣品中存在的生物標(biāo)志的量?；蛘撸梢詫晒饣衔?，例如熒光素和羅丹明，化學(xué)偶聯(lián)到抗體上，而不影響其結(jié)合能力。當(dāng)受特定波長(zhǎng)的光照射而被活化時(shí)，熒光團(tuán)標(biāo)記的抗體吸收光能，誘導(dǎo)分子內(nèi)導(dǎo)致可激發(fā)的狀態(tài)，然后發(fā)射可以用光學(xué)顯微鏡檢測(cè)的特征性顏色的光。如酶免疫測(cè)定(EIA)中那樣，讓熒光標(biāo)記的抗體與第一抗體-分子標(biāo)志復(fù)合物結(jié)合。洗去未結(jié)合的試劑后，再將余下的三元復(fù)合物暴露于合適波長(zhǎng)的光，觀察到的熒光指示目標(biāo)分子標(biāo)志的存在。免疫熒光和EIA方法在本領(lǐng)域都是非常成熟的。但是，其它的報(bào)道分子，例如放射性同位素，化學(xué)發(fā)光性或生物發(fā)光性分子，也可以使用。
本文認(rèn)為上述的方法也可以用來(lái)檢測(cè)FUT3或FUT6多肽的表達(dá)。
本發(fā)明的方法還包括檢查組織或細(xì)胞樣品中mRNA，例如FUT3和/或FUT6mRNA的存在和/或表達(dá)的規(guī)程。評(píng)估細(xì)胞中的mRNA的方法是熟知的，包括，例如，使用互補(bǔ)DNA探針的雜交測(cè)定(例如使用標(biāo)記的FUT3和/或FUT6核糖核酸探針的原位雜交，Northern印跡和相關(guān)技術(shù))和多種核酸擴(kuò)增測(cè)定(例如使用FUT3和/或FUT6特異性互補(bǔ)引物的RT-PCR，和其它擴(kuò)增型檢測(cè)方法，例如分支DNA，SISBA，TMA等)。
可以使用Northern、斑點(diǎn)雜交或PCR分析方便地對(duì)來(lái)自哺乳動(dòng)物的組織或細(xì)胞樣品進(jìn)行例如FUT3和/或FUT6mRNA的測(cè)定。例如，RT-PCR，例如定量PCR測(cè)定，是本領(lǐng)域熟知的。在本發(fā)明的一個(gè)說(shuō)明性的實(shí)施方案中，一種檢測(cè)生物樣品中的FUT3和/或FUT6mRNA的方法包括使用至少一種引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，從該樣品產(chǎn)生cDNA；使用FUT3和/或FUT6多核苷酸作為有義和反義引物擴(kuò)增所產(chǎn)生的cDNA，以擴(kuò)增其中的FUT3和/或FUT6cDNA；并檢測(cè)被擴(kuò)增的FUT3和/或FUT6cDNA的存在。
另外，這樣的方法可包括一個(gè)或多個(gè)可確定生物樣品中FUT3和/或FUT6mRNA水平的步驟(例如通過(guò)同時(shí)檢測(cè)比較性對(duì)照“持家”基因例如肌動(dòng)蛋白家族成員的mRNA序列水平)。可選地，可以確定被擴(kuò)增的FUT3和/或FUT6 cDNA的序列。
本發(fā)明的這個(gè)方面的重要的實(shí)施方案包括FUT3和/或FUT6引物和引物對(duì)，其允許特異性擴(kuò)增本發(fā)明的多核苷酸或其任意特定的部分；以及選擇性地或特異性地與本發(fā)明的核酸分子或其任意部分雜交的探針。探針可以用可檢測(cè)的標(biāo)志例如放射性同位素、熒光化合物、生物發(fā)光性化合物、化學(xué)發(fā)光性化合物、金屬螯合物或酶來(lái)標(biāo)記。這樣的探針和引物可以用來(lái)檢測(cè)樣品中FUT3和/或FUT6多核苷酸的存在，或作為檢測(cè)表達(dá)FUT3和/或FUT6蛋白的細(xì)胞的手段。如本領(lǐng)域技術(shù)人員了解的，基于本文提供的序列可以制備很多種不同的引物和探針，用來(lái)有效地?cái)U(kuò)增、克隆和/或確定FUT3和/或FUT6mRNA的存在和/或水平。
本發(fā)明的可選的方法包括通過(guò)微陣列(microarray)技術(shù)檢查或檢測(cè)組織或細(xì)胞樣品中的mRNA，例如FUT3和FUT6或其它巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶mRNA的規(guī)程。使用核酸微陣列，來(lái)自測(cè)試和對(duì)照組織樣品的測(cè)試和對(duì)照mRNA樣品被反轉(zhuǎn)錄和標(biāo)記，以生成cDNA探針。然后將這些探針與固定在固體載體上的核酸陣列雜交。該陣列這樣配置，使陣列的各個(gè)成員的序列和位置都是已知的。例如，可以用一組選定的可能在特定疾病狀態(tài)中表達(dá)的基因在固體載體上形成陣列。標(biāo)記的探針與特定的陣列成員發(fā)生雜交表明該探針?biāo)鶃?lái)源的樣品表達(dá)該基因。疾病組織的差異基因表達(dá)的分析可提供有價(jià)值的信息。微陣列技術(shù)使用核酸雜交技術(shù)和計(jì)算技術(shù)在單次實(shí)驗(yàn)中評(píng)估數(shù)以千計(jì)的基因的mRNA表達(dá)模式。(參見(jiàn)例如，2001年10月11日公開(kāi)的WO01/75166 published October 11，2001；(制備陣列的討論可參見(jiàn)例如，U.S.5,700,637，美國(guó)專利5,445,934，和美國(guó)專利5,807,522，Lockart，NatureBiotechnology，141675-1680(1996)；Cheung，V.G.等人，Nature Genetics21(Suppl)15-19(1999))。DNA微陣列是含有基因片段的微型陣列，這些基因片段或者直接被合成到，或者被點(diǎn)樣到玻璃或其它支持物上。單個(gè)陣列中通常有數(shù)以千計(jì)的基因。典型的微陣列實(shí)驗(yàn)涉及下面的步驟1.由從樣品分離的RNA制備熒光標(biāo)記的目標(biāo)，2.標(biāo)記的目標(biāo)與微陣列雜交，3.洗滌，染色，并掃描陣列，4.分析掃描的圖像，和5.生成基因表達(dá)模式。目前有兩種類型的DNA微陣列在使用寡核苷酸(通常是25至70mer)陣列和含有從cDNA制備的PCR產(chǎn)物的基因表達(dá)陣列。形成陣列時(shí)，寡核苷酸可以預(yù)先合成再點(diǎn)樣到表面，或直接在表面上(原位)合成。
Affymetrix GeneChip系統(tǒng)是一種可商購(gòu)的微陣列系統(tǒng)，其包含通過(guò)直接在玻璃表面上合成寡核苷酸而制造的陣列。探針/基因陣列通過(guò)組合使用基于半導(dǎo)體的光刻和固相化學(xué)合成技術(shù)，通常為25聚體的寡核苷酸被直接合成在玻璃晶片上。每個(gè)陣列含有多達(dá)400,000種不同的寡聚物，每種寡聚物以數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的拷貝數(shù)存在。由于寡核苷酸是在陣列上的已知位置合成的，使用Affymetrix Microarray Suite軟件，雜交模式和信號(hào)強(qiáng)度可以解析為基因的同一性和相對(duì)表達(dá)水平。每種基因在該陣列上由一系列的不同寡核苷酸探針?biāo)?。每個(gè)探針組由一完全匹配的寡核苷酸和一錯(cuò)配的寡核苷酸組成。完全匹配的探針具有與特定基因完全互補(bǔ)的序列，由此量度該基因的表達(dá)。錯(cuò)配的探針和完全匹配的探針的不同之處在于中心堿基位置有單個(gè)堿基的替換，干擾了目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合。這有助于確定背景和對(duì)完全匹配的寡聚物的測(cè)得的信號(hào)有影響的非特異性雜交。該MicroarraySuite軟件從完全匹配的探針的雜交強(qiáng)度中減去錯(cuò)配探針的雜交強(qiáng)度，以確定每個(gè)探針組的絕對(duì)強(qiáng)度或比強(qiáng)度值。探針是基于Genbank和其它核苷酸庫(kù)的現(xiàn)有信息來(lái)選擇的。這些序列被認(rèn)為識(shí)別基因的3’端的獨(dú)特區(qū)域。使用GeneChip雜交爐(“rotisserie”爐)進(jìn)行一次多達(dá)64個(gè)陣列的雜交。射流工作站(fluidics station)執(zhí)行探針陣列的洗滌和染色。它是完全自動(dòng)化的，包括四個(gè)組件，每個(gè)組件持有一個(gè)探針陣列。每個(gè)組件通過(guò)Microarray Suite軟件使用預(yù)編程的射流規(guī)程被獨(dú)立地控制。掃描裝置是共聚焦激光掃描儀，其測(cè)量與探針陣列結(jié)合的標(biāo)記cRNA所發(fā)射的熒光的強(qiáng)度。配備MicroarraySuite軟件的計(jì)算機(jī)工作站控制所述射流工作站和掃描儀。Microarray Suite軟件使用為預(yù)編程的探針陣列雜交、洗滌和染色規(guī)程可控制多達(dá)8個(gè)射流工作站。該軟件還采集雜交強(qiáng)度信號(hào)并通過(guò)合適的算法將其轉(zhuǎn)換為每個(gè)基因的有/無(wú)判定。最后，該軟件通過(guò)比較分析檢測(cè)實(shí)驗(yàn)之間基因表達(dá)的改變，并以.txt文件的格式輸出，該文件可以供其它軟件程序用來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析。
所選的生物標(biāo)志的表達(dá)也可以通過(guò)檢查基因缺失或基因擴(kuò)增來(lái)評(píng)估。基因缺失或擴(kuò)增可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種規(guī)程中的任一種來(lái)測(cè)量，例如通過(guò)使用合適地標(biāo)記的探針進(jìn)行常規(guī)的Southern印跡，Northern印跡以定量mRNA的轉(zhuǎn)錄(Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，775201-5205(1980))，斑點(diǎn)雜交(DNA分析)，或原位雜交(例如FISH)，或使用合適地標(biāo)記的探針進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)方法或比較基因組雜交(CGH)。例如，可以使用這些方法來(lái)檢測(cè)FUT3和/或FUT6基因的缺失或擴(kuò)增。
另外，可以檢查組織或細(xì)胞樣品中生物標(biāo)志例如FUT3和/或FUT6基因的甲基化狀態(tài)。CpG島的異常去甲基化和/或過(guò)度甲基化在永生化和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中經(jīng)常發(fā)生，并可能造成多種基因的表達(dá)改變。本領(lǐng)域中有很多檢查基因的甲基化狀態(tài)的測(cè)定法是公知的。例如，在Southern雜交方法中，可以使用甲基化敏感的限制酶來(lái)評(píng)估CpG島的甲基化狀態(tài)，該酶不能切割含甲基化CpG位點(diǎn)的序列。另外，MSP(甲基化特異PCR)可以容易地描述給定基因的CpG島中的所有CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。該方法包括首先用亞硫酸氫鈉修飾DNA(這將把所有非甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶)，然后用甲基化DNA特異性(相對(duì)于非甲基化DNA)的引物擴(kuò)增。涉及甲基化干擾的規(guī)程還可以在例如下列文獻(xiàn)中找到Current Protocols In Molecular Biology，第12單元，F(xiàn)rederick M.Ausubel等人編，1995；De Marzo等人，Am.J.Pathol.155(6)1985-1992(1999)；Brooks等人，Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.，1998，7531-536)；及Lethe等人，Int.J.Cancer 76(6)903-908(1998)。
所選生物標(biāo)志在組織或細(xì)胞樣品中的表達(dá)也可以通過(guò)基于功能或活性的測(cè)定來(lái)檢查。例如，如果生物標(biāo)志是酶，則可以進(jìn)行本領(lǐng)域已知的測(cè)定來(lái)確定或檢測(cè)所述組織或細(xì)胞樣品中特定的酶活性的存在。
在本發(fā)明的方法中，認(rèn)為還可以檢查所述組織或細(xì)胞樣品中Apo2L/TRAIL的表達(dá)或結(jié)合Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體的受體的表達(dá)。如上所述和本領(lǐng)域已知的，目前認(rèn)為Apo2L/TRAIL結(jié)合至少5種不同的受體DR4，DR5，DcR1，DcR2，和OPG。使用本領(lǐng)域已知的方法，包括本文描述的方法，可以在mRNA和蛋白質(zhì)水平上檢測(cè)Apo2L/TRAIL，DR4，DR5，DcR1，DcR2，和/或OPG的表達(dá)。如圖10和11所示，從數(shù)據(jù)可知，檢查組織或細(xì)胞樣品的DcR1和/或DcR2受體表達(dá)，可能提供更多有關(guān)該組織或細(xì)胞樣品是否會(huì)對(duì)Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體敏感的信息。例如，可以使用上面描述的IHC技術(shù)來(lái)檢測(cè)所述樣品中一種或多種這樣的分子的存在。本文認(rèn)為，對(duì)于不但檢查組織或樣品FUT或Lewis抗原標(biāo)志的存在，還檢查例如DR4，DR5或DcR1的存在的方法，可以從相同的組織或樣品制備不同的玻片，并用對(duì)各種特定的生物標(biāo)志或受體特異的試劑來(lái)測(cè)試各個(gè)玻片?；蛘?，可以從組織或細(xì)胞樣品制備單個(gè)玻片，并使用針對(duì)各種生物標(biāo)志或受體的抗體進(jìn)行多顏色染色程序，從而得以顯現(xiàn)和檢測(cè)各種生物標(biāo)志或受體。
本文認(rèn)為，確定了所述組織或細(xì)胞樣品表達(dá)一種或多種指示該組織或細(xì)胞樣品對(duì)Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體的活性敏感的生物標(biāo)志以后，可以對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用有效量的Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體來(lái)治療疾病，例如該哺乳動(dòng)物正患有的癌癥或免疫相關(guān)疾病。哺乳動(dòng)物中本文所述的多種病理狀態(tài)的診斷可以由相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)行。診斷技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，其允許例如診斷哺乳動(dòng)物中的癌癥或免疫相關(guān)疾病。例如，癌癥可以通過(guò)包括但不限于扣診、血液分析、x射線、NMR等技術(shù)來(lái)鑒定。免疫相關(guān)疾病也可以容易地鑒定。
Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體可以根據(jù)已知的方法來(lái)施用，例如以推注或經(jīng)歷時(shí)程的連續(xù)輸注的形式靜脈施用，經(jīng)由肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)(intracerebrospinal)，皮下，關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、表面、或吸入途徑?？蛇x地，施用可以使用多種可商購(gòu)的裝置通過(guò)微泵(mini-pump)進(jìn)行。
施用Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體的有效劑量和方案可以基于經(jīng)驗(yàn)確定，對(duì)這些的確定是本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)范圍之內(nèi)的?？梢允褂脝蝹€(gè)或多個(gè)劑量。目前認(rèn)為，單獨(dú)使用的Apo2L/TRAIL的有效劑量或量可為每日約1μg/kg到約100mg/kg體重或更高。劑量的種間縮放(interspecies scaling)可以以本領(lǐng)域已知的方式進(jìn)行，例如Mordenti等人，Pharmaceut.Res.，81351(1991)所公開(kāi)的。
當(dāng)采用Apo2L/TRAIL體內(nèi)施用時(shí)，正常的劑量可為每日約10ng/kg到100mg/kg哺乳動(dòng)物體重或更高，優(yōu)選約1μg/kg/日到10mg/kg/日，依賴于施用途徑。文獻(xiàn)中提供了具體的劑量和送遞方法，見(jiàn)，例如，美國(guó)專利4,657,760；5,206,344；或5,225,212。本文預(yù)期，對(duì)于不同的治療化合物和不同的疾病有效的劑型將是不同的，例如以一種器官或組織為目標(biāo)的施用可以需要與以另一種器官或組織為目標(biāo)的施用不同的送遞方式。
本文還認(rèn)為所述方法中還可以采用其它療法。所述一種或多種其它療法可包括但不限于施用放射療法、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)抑制劑、化學(xué)治療劑、細(xì)胞毒劑、酪氨酸激酶抑制劑、ras法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、血管發(fā)生抑制劑，和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，這些是本領(lǐng)域已知的，并由上述的特征進(jìn)一步限定。本文認(rèn)為所述其它療法可以作為Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體之外的藥劑使用。另外，還可使用基于靶向腫瘤抗原的治療性抗體，例如RituxanTM或HerceptinTM，及抗血管發(fā)生抗體，如抗VEGF。
化學(xué)治療劑的配制和劑量給藥方案可以根據(jù)制造商的指示，或者如相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員經(jīng)驗(yàn)確定的使用。所述化學(xué)治療法的配制和劑量給藥方案還在Chemotherapy Service，M.C.Perry編，Williams & Wilkins，Baltimore，MD(1992)中有描述?；瘜W(xué)治療劑可在Apo2L/TRAIL或死亡受體抗體施用之前或之后，或與之同時(shí)施用。
除此之外還施用針對(duì)其它抗原的抗體可能是理想的，例如結(jié)合CD20，CD11a，CD18，CD40，ErbB2，EGFR，ErbB3，ErbB4，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、或其它TNFR家族成員(例如OPG，TNFR1，TNFR2，GITR，Apo-3，TACI，BCMA，BR3)。或者/并且，可以對(duì)患者共同施用結(jié)合相同抗原或兩種或多種不同抗原的兩種或多種不同抗體。施用后，可以分析體外處理的細(xì)胞。如果進(jìn)行了體內(nèi)處理，可以使用相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種方法監(jiān)測(cè)被處理的哺乳動(dòng)物。例如，可對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行病理學(xué)檢查以測(cè)定壞死，或者分析血清的免疫系統(tǒng)反應(yīng)。
本發(fā)明還提供用于上面描述或提示過(guò)的用途的試劑盒或制品。這樣的試劑盒可包含載體裝置，其被分為區(qū)室以密閉地容納一種或多種容器裝置例如小瓶、管等等。每個(gè)容器裝置包含方法中要使用的不同元件中的一種。例如，容器裝置中的一個(gè)可包含探針，該探針是或可以是可檢測(cè)地標(biāo)記的。這樣的探針可以是分別針對(duì)FUT3和/或FUT6蛋白或FUT3和/或FUT6基因或信使分子特異性的抗體或多核苷酸。在所述試劑盒利用核酸雜交來(lái)檢測(cè)目的核酸時(shí)，該試劑盒還可以具有含有核苷酸的容器，該核苷酸用于擴(kuò)增目標(biāo)核酸序列，和/或具有包含報(bào)道工具的容器，所述報(bào)道工具，例如生物素結(jié)合蛋白，如抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白，與報(bào)道分子例如酶、熒光或放射性同位素標(biāo)記物結(jié)合。
本發(fā)明的試劑盒通常包括上面描述的容器，和一種或多種其它的容器，這些其它的容器包含從商業(yè)和使用者觀點(diǎn)看來(lái)需要的材料，包括緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭、注射器，以及帶使用說(shuō)明的包裝說(shuō)明書(shū)。容器上可能有標(biāo)識(shí)，提示該組合物用于特定的療法或非治療性的用途，還可以提示體內(nèi)或體外用途的指導(dǎo)，例如上面描述的那些用途。
本發(fā)明的試劑盒有多種實(shí)施方案。一種典型的實(shí)施方案是一種試劑盒，包括容器、所述容器上的標(biāo)識(shí)、及所述容器內(nèi)含有的組合物，其中所述組合物包括結(jié)合FUT3和/或FUT6多肽序列的第一抗體，所述容器上的標(biāo)識(shí)指示該組合物可用于評(píng)估至少一類哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的FUT3和/或FUT6蛋白質(zhì)的存在，以及使用FUT3和/或FUT6抗體評(píng)估至少一類哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的FUT3和/或FUT6蛋白質(zhì)的存在的指導(dǎo)。該試劑盒可進(jìn)一步包括用于制備組織樣品和將抗體和探針施加于組織樣品的相同切片的一套指導(dǎo)和材料。該試劑盒可包括第一和第二抗體，其中第二抗體與標(biāo)記物偶聯(lián)，例如酶標(biāo)記物。
另一種實(shí)施方案是一種試劑盒，包括容器、所述容器上的標(biāo)識(shí)、及所述容器內(nèi)含有的組合物，其中所述組合物包括在嚴(yán)緊條件下與FUT3和/或FUT6多核苷酸互補(bǔ)物(complement)雜交的多核苷酸，所述容器上的標(biāo)識(shí)指示該組合物可用于評(píng)估至少一類哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的FUT3和/或FUT6的存在，以及使用FUT3和/或FUT6多核苷酸評(píng)估至少一類哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的FUT3和/或FUT6RNA或DNA的存在的指導(dǎo)。
該試劑盒中其它的可選組分包括一種或多種緩沖液(例如，封閉緩沖液、洗滌緩沖液、底物緩沖液，等等)，其它試劑例如被酶標(biāo)記物化學(xué)改變的底物(例如色原(chromogen))，抗原修復(fù)溶液，對(duì)照樣品(陽(yáng)性和/或陰性對(duì)照)，對(duì)照玻片等。
實(shí)施例通過(guò)下面的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的多個(gè)方面作進(jìn)一步的描述和說(shuō)明，所有這些實(shí)施例都不意在限制本發(fā)明的范圍。
方法和材料細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞系下面的人結(jié)腸直腸細(xì)胞系HCT-8，COLO 205，HCT 116，SW403，LoVo，SW948，Caco-2，COLO 201，SW1417，DLD-1，CX-1，HCT-15，LS 180，RKO，RKO-AS45-1，SK-CO-1，SW480，SW620，SW837，CL-40，COLO-206F，COLO 320DM，COLO 320HSR，COLO-678，HT-29，KM12，LS1034，SW1116得自ATCC(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)儲(chǔ)藏庫(kù)(Manassas，Virginia)、DSMZ(德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心)、JCRB(日本細(xì)胞資源銀行)或ECACC(歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心)，并在加有10％熱滅活的胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和10mM HEPES的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
細(xì)胞毒性測(cè)定MTT測(cè)定(CellTiter 96非放射性細(xì)胞增殖測(cè)定系統(tǒng)，來(lái)自Promega)，是一種基于活細(xì)胞將可溶性四唑鹽(MTT)還原為藍(lán)色甲晶體的能力的比色測(cè)定方法，使用MTT測(cè)定來(lái)確定Apo2L/TRAIL或DR5抗體處理后活細(xì)胞的數(shù)量。MTT測(cè)定通過(guò)在含不同濃度(0到1000ng/ml)的Apo2L/TRAIL或DR5抗體的96孔板的培養(yǎng)孔中加入預(yù)混合的經(jīng)過(guò)優(yōu)化的染料溶液來(lái)進(jìn)行。在4小時(shí)的溫育過(guò)程中，活細(xì)胞將染料溶液的四唑組分轉(zhuǎn)化為甲產(chǎn)物。然后向培養(yǎng)孔中加入溶解/終止溶液以溶解該甲產(chǎn)物，使用96孔板讀板器(SpectraMax)記錄570nm的吸光度。570nm吸光度的測(cè)量值與增殖測(cè)定中正常使用的細(xì)胞的數(shù)目成正比。雖然甲產(chǎn)物的最大吸收是570nm，而且純?nèi)芤猴@藍(lán)色，但測(cè)定終點(diǎn)時(shí)的顏色可能不是藍(lán)色，而是依賴于存在的甲相對(duì)于培養(yǎng)基中其它組分(包括血清、酸化的酚紅和未還原的MTT)的量。
通過(guò)進(jìn)行細(xì)胞滴定，在測(cè)定的線性范圍的高端的附近產(chǎn)生測(cè)定信號(hào)，來(lái)優(yōu)化細(xì)胞數(shù)目。由于不同的細(xì)胞類型具有不同的代謝活性水平，對(duì)各種細(xì)胞系分別進(jìn)行上述優(yōu)化。對(duì)于被檢查的大多數(shù)腫瘤細(xì)胞，使用每孔5,000細(xì)胞到每孔20,000細(xì)胞。
下面是所采用的測(cè)定法的逐步描述1.用于生物測(cè)定的細(xì)胞來(lái)自儲(chǔ)用培養(yǎng)物。
2.確定細(xì)胞數(shù)目和錐蟲(chóng)藍(lán)活力，以5,000到20,000細(xì)胞每孔的終數(shù)目懸浮細(xì)胞。
3.向96孔板中分別加入50μl細(xì)胞培養(yǎng)物。
4.在37℃、加濕的5％CO2氣氛下溫育該培養(yǎng)板過(guò)夜。
5.向所述96孔板的樣品中加入含0到100ng/ml的不同濃度的Apo2L/TRAIL或DR5抗體的50μl培養(yǎng)基。對(duì)照是50μl培養(yǎng)基(無(wú)Apo2L/TRAIL或DR5抗體)和100μl培養(yǎng)基(無(wú)細(xì)胞)。
每個(gè)實(shí)驗(yàn)都按一式三組孔進(jìn)行，并在獨(dú)立的三天中進(jìn)行?？字锌傮w積是100μl/孔。
6.在37℃、加濕的5％CO2氣氛下溫育培養(yǎng)板72小時(shí)。
7.向每個(gè)孔加入15μl染料溶液。
8.在37℃、加濕的5％CO2氣氛下溫育培養(yǎng)板4小時(shí)。
9.向每個(gè)孔加入100μl溶解/終止溶液。
10.在37℃溫育培養(yǎng)板過(guò)夜。
11.使用96孔板讀板器記錄570nm波長(zhǎng)的吸光度。使用750nm的參比波長(zhǎng)來(lái)減少細(xì)胞碎片、指紋和其它非特異性吸收帶來(lái)的背景。
12.用陰性對(duì)照的吸收值的平均值作為空白值，從其它所有的讀數(shù)中減去該值。用每個(gè)濃度的Apo2L/TRAIL或DR5抗體的吸收值的平均值除以陽(yáng)性對(duì)照(100％活細(xì)胞-未處理的)的吸收值的平均值，來(lái)計(jì)算活細(xì)胞的量(以％計(jì))。
13.以活細(xì)胞的百分率(Y軸)對(duì)Apo2L/TRAIL或DR5抗體的濃度(X軸，對(duì)數(shù)標(biāo)度)作圖，找到對(duì)應(yīng)于50％的活細(xì)胞的X軸的值(ng/ml)來(lái)確定IC50值。
Affymetrix標(biāo)記規(guī)程讀取所有樣品的OD260/280，在BioAnalyzer上運(yùn)行樣品。使用5μg的高質(zhì)量總RNA。
第一鏈cDNA合成1.引物雜交DEPC-H2O xμl 渦旋混合 快速旋轉(zhuǎn)DNA(5μg) yμl 在70℃溫育10分鐘示蹤物(Spike)(對(duì)5μg 1∶4稀釋儲(chǔ)液)1μl 快速旋轉(zhuǎn)并置于冰上T7-(dT)24引物 1μl體積 12μl2.溫度調(diào)節(jié)5X第一鏈cDNA緩沖液 4μl每個(gè)樣品加入 7μl(的左邊的混合物)。
0.1M DTT 2μl 渦旋混合.快速旋轉(zhuǎn)10mM dNTP混合物1μl 42℃溫育2分鐘。
體積 7μl3.第一鏈合成向每個(gè)樣品加入 1μl SSII RT。
SSII RT 1μl 用移液器吹吸或輕微渦旋混合快速旋轉(zhuǎn)總體積 20μl 42℃溫育1小時(shí)。
B.第二鏈cDNA合成1 將第一鏈反應(yīng)物放在冰上，短暫離心以帶下管壁上的凝結(jié)物2 制備下面的第二鏈主混合物(master-mix)DEPC處理的H2O 91μl5X第二鏈反應(yīng)混合物 30μl10mM dNTP混合物 3μl10U/μl DNA連接酶 1μl10U/μl DNA聚合酶I 4μl2U/μl RNA酶H 1μl總體積 130μl
3.向20μl第一鏈cDNA中加入130μl第二鏈主混合物(終體積＝150μl)4.用移液器吹吸或輕微渦旋混合，快速旋轉(zhuǎn)。
5.在冷卻水浴中16℃溫育2小時(shí)。
6.加入2μl[10U]T4 DNA聚合酶。用移液器吹吸或輕微渦旋混合?？焖傩D(zhuǎn)。
7.16℃溫育5分鐘。
8.加入10μl 0.5M EDTA，輕微渦旋?？焖傩D(zhuǎn)9.繼續(xù)進(jìn)行到cDNA凈化步驟，或者保存在-20℃?zhèn)溆谩?br> 雙鏈cDNA的凈化(GeneChip樣品凈化組件(module))1.向162μl最終的雙鏈cDNA合成制備物中加入600μl cDNA結(jié)合緩沖液。
渦旋3秒鐘混合。
2.檢查確認(rèn)混合物的顏色是黃色的(與沒(méi)有cDNA合成反應(yīng)物的cDNA結(jié)合緩沖液相似)。如果混合物的顏色是橙色或紫色的，加入10μl 3M乙酸鈉，pH 5.0，并混合?；旌衔锏念伾珜⒆兂牲S色。
3.將500μl樣品加到cDNA凈化旋轉(zhuǎn)柱上，該柱置于2ml的收集管中，≥8,000xg(≥10,000rpm)離心1分鐘。將流過(guò)物(flow-through)作為危險(xiǎn)廢物棄去。
4.再將剩余的混合物(262μl)加樣到旋轉(zhuǎn)柱上，并如上離心。流過(guò)物作為危險(xiǎn)廢物棄去，并棄去收集管。
5.將旋轉(zhuǎn)柱轉(zhuǎn)移到新的2ml收集管(有提供)中，用移液器加750μlcDNA洗滌緩沖液到旋轉(zhuǎn)柱上?！?,000xg(≥10,000rpm)離心1分鐘。棄去流過(guò)物。
6.打開(kāi)旋轉(zhuǎn)柱的蓋，并以最大速度(≤25,000xg)離心5分鐘，將柱放入離心機(jī)的槽中，每隔一個(gè)槽放入，使蓋位于旁邊的槽的上方，使得它們朝向與旋轉(zhuǎn)相反的方向，即，如果旋轉(zhuǎn)是順時(shí)針的，則使各個(gè)蓋朝向逆時(shí)針?lè)较颉＿@可以避免蓋的損傷。棄去流過(guò)物和收集管。
7.將旋轉(zhuǎn)柱轉(zhuǎn)移到1.5ml收集管中。用移液器將10μl cDNA洗脫緩沖液直接加到旋轉(zhuǎn)柱的膜上。確保cDNA洗脫緩沖液被直接地分施到膜上。室溫溫育1分鐘，然后在最大速度(≤25,000xg)離心1分鐘洗脫。
準(zhǔn)備和進(jìn)行IVT反應(yīng)EnzoBioarray高產(chǎn)率RNA轉(zhuǎn)錄物標(biāo)記試劑盒(件號(hào)900182)1.使用10μl的凈化的雙鏈cDNA2.制備下面的IVT主混合物蒸餾水或去離子水12μl10X HY反應(yīng)混合物4μl10x生物素標(biāo)記的核糖核苷酸4μl10X DTT 4μl10X RNA酶抑制劑混合物4μl20X T7 RNA聚合酶2μl總體積 30μl3.向10μl雙鏈cDNA中加入30μl的IVT主混合物(總體積＝40μl)。
4.用移液器吹吸或輕微渦旋混合，快速旋轉(zhuǎn)。
5.立即將管放在37℃水浴中溫育5小時(shí)。
6.如果不立即純化RNA，在-20℃保存。
生物素標(biāo)記的cRNA的凈化(GeneChip樣品凈化組件)1.向IVT反應(yīng)物中加入60μl H2O，渦旋混合3秒。
2.向該樣品中加入350μl IVT cRNA結(jié)合緩沖液，渦旋混合3秒。
3.向裂解物中加入250μl乙醇(96-100％)，通過(guò)移液器吹吸充分混合，不要離心。
4.將樣品(700μl)加到IVT cRNA凈化旋轉(zhuǎn)柱上，該柱置于2ml的收集管中，≥8,000xg(≥10,000rpm)離心15秒。
5.使洗脫物再過(guò)柱一次?！?,000xg(≥10,000rpm)離心15秒。將流過(guò)物作為危險(xiǎn)廢物棄去，并棄去收集管。
6.將旋轉(zhuǎn)柱轉(zhuǎn)移到新的2ml收集管(有提供)中。
7.加入500μl IVT cRNA洗滌緩沖液并以≥8,000xg(≥10,000rpm)離心15秒來(lái)洗滌。棄去流過(guò)物。
8.用移液器將500μl 80％(v/v)乙醇加到旋轉(zhuǎn)柱上，并以≥8,000xg(≥10,000rpm)離心15秒。棄去流過(guò)物。
9.打開(kāi)旋轉(zhuǎn)柱的蓋，以最大速度(≤25,000xg)離心5分鐘。棄去流過(guò)物和收集管。
10.將旋轉(zhuǎn)柱轉(zhuǎn)移到新的1.5ml收集管中。
11.用移液器將11μl無(wú)RNA酶的水直接加到旋轉(zhuǎn)柱的膜上。靜置1分鐘。以最大速度(≤25,000xg)離心1分鐘以洗脫。
12.用移液器將10μl無(wú)RNA酶的水直接加到旋轉(zhuǎn)柱的膜上。靜置1分鐘。以最大速度(≤25,000xg)離心1分鐘以洗脫。
定量cRNA(IVT產(chǎn)物)使用分光光度分析來(lái)確定RNA的產(chǎn)率。適用260nm處的1OD等于40μg/ml RNA的慣例。檢查260nm和280nm處的OD以確定樣品濃度和純度。對(duì)于純RNA，保持A260/A280接近2.0(1.9到2.1之間的比值是可接受的)。
當(dāng)使用總RNA作為起始材料時(shí)，定量cRNA，必須計(jì)算調(diào)整的cDNA產(chǎn)率，以反映未標(biāo)記的總RNA的殘余(carryover)。使用100％殘余的估計(jì)值時(shí)，使用下式來(lái)確定調(diào)整的cRNA產(chǎn)率調(diào)整的cRNA產(chǎn)率＝RNAm-(總RNAi)(y)RNAm＝IVT后測(cè)得的cRNA的量(μg)總RNAi＝總RNA的起始量(μg)y＝IVT中使用的cDNA反應(yīng)物的分?jǐn)?shù)斷裂cRNA以制備目標(biāo)斷裂使用調(diào)整的cRNA濃度。
1.對(duì)每8μl的RNA加水，加2μl的5x斷裂緩沖液20μg cRNA 1到32μl5X斷裂Buffer 8μl加無(wú)RNA酶水到40μl總體積40μl
2.在94℃溫育30分鐘。溫育后立即放在冰上。
制備雜交目標(biāo)1.將20X真核雜交對(duì)照(Eukaryotic Hybridization Controls)和Oligo B2在65℃加熱5分鐘。
Affymetrix GeneChip真核雜交對(duì)照試劑盒(件號(hào)900362(150rxns)。
2.輕微渦旋，旋轉(zhuǎn)使之沉降。
3.主混合物(假設(shè)斷裂的cRNA濃度是0.5μg/μl)標(biāo)準(zhǔn)陣列 (μl) 終濃度斷裂的cRNA 15μg 30 0.05μg/μlOligo B2(3nM)5 50pM20x對(duì)照示蹤物15 1.5，5，25，100pM(Bio B，C，D，Cre)鮭精DNA 3 0.1mg/ml乙?；疊SA3 0.5mg/ml人cot-1 DNA(1mg/ml) 30 0.1mg/ml2X MES Hyb緩沖液 150 1XH2O 64終體積 3004.將270μl等份的主混合物加入管中，并向每個(gè)管中加入30μl的斷裂的cRNA。這即是雜交混合物。
5.在即將使用之前使探針陣列平衡到室溫。
6.用1x MES Hyb緩沖液充滿探針陣列，在rotisserie爐中45℃、60rpm溫育10分鐘。
7.在99℃水浴中加熱雜交混合物5分鐘。
8.將雜交混合物轉(zhuǎn)移到45℃水浴中5分鐘。
9.以最大速度離心雜交混合物5分鐘。
10.從探針陣列中移去1x MES Hyb緩沖液。
11.將最上面的200μl雜交混合物充入探針陣列。
12.用Tough-Spots封閉隔板。
13.在45℃、60RPM雜交該探針陣列19小時(shí)。
14.按照Affymetrix的規(guī)程洗滌、染色并掃描該探針陣列。
項(xiàng)目供應(yīng)商目錄號(hào)T7-(dT)24引物 Biosearch Technologies自定義對(duì)照示蹤物 內(nèi)部來(lái)源 -Superscript II/5X第一鏈緩沖液/0.1M DTT Invitrogen18064-0145X第二鏈緩沖液 Invitrogen10812-01410mM dNTP Invitrogen18427-08810U/ul大腸桿菌DNA連接酶 Invitrogen18052-01910U/ul大腸桿菌DNA聚合酶IInvitrogen18010-0252U/ul RNA酶HInvitrogen18021-07110U/ul T4 DNA聚合酶 Invitrogen18005-0250.5M EDTA Sigma E-7889ENZO高產(chǎn)率RNA轉(zhuǎn)錄物標(biāo)記試劑盒 Affymetrix或ENZO 900182(ENZO)GeneChip樣品凈化組件Affymetrix900371乙?；Ｑ灏椎鞍? Invitrogen15561-020山羊IgG-試劑級(jí) Sigma I-5256抗鏈霉抗生物素蛋白抗體(山羊)，生物素化 Vector Labs BA-0500R-藻紅蛋白鏈霉抗生物素蛋白 Molecular Probes S-86620X SSPEBioWhittaker 51214真核對(duì)照試劑盒 Affymetrix900362水，分子生物學(xué)級(jí)Ambion9934人Cot-1 DNA Roche 1-581-0745M NaCl，無(wú)RNA酶，無(wú)DNA酶 Ambion9760消泡劑0-30 Sigma A-808210％Tween-20Pierce Chemical 28320MES游離酸單水合物 Sigma M5287MES鈉鹽 Sigma M3885EDTA二鈉鹽，0.5M溶液Sigma E7889Tough Spots Label Dots USA Scientific 9902GeneChip雜交爐640 Affymetrix800139
GeneChip掃描儀3000w/工作站 Affymetrix 00-0074射流工作站(Fluidics Station)Affymetrix 00-0081自動(dòng)上樣器w/外置條形碼讀碼器Affymetrix 00-0129定量PCRcDNA合成

溫育條件25℃10分鐘37℃2小時(shí)TaqMan反應(yīng)，使用ABI Prism 7700測(cè)序檢測(cè)器

熱循環(huán)條件
95℃10分鐘40個(gè)循環(huán)95℃15秒60℃1分鐘TaqMan探針Assays-on-DemandTM(TaqManMGB探針，F(xiàn)AMTM染料標(biāo)記的)擴(kuò)增內(nèi)源對(duì)照GAPDH(探針濃度100nM，正向和反向引物濃度200nM)來(lái)使加到每個(gè)反應(yīng)的樣品RNA(cDNA)的量標(biāo)準(zhǔn)化。
使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行相對(duì)定量。為了進(jìn)行針對(duì)內(nèi)源對(duì)照歸一化的定量，對(duì)目標(biāo)和內(nèi)源對(duì)照都制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品，由合適的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定目標(biāo)和內(nèi)源參照的量。然后，用目標(biāo)的量除以內(nèi)源參照的量以得到歸一化的目標(biāo)值。用實(shí)驗(yàn)樣品之一作為校正樣品，或1x樣品。然后用各個(gè)歸一化的目標(biāo)值除以校正樣品的歸一化的目標(biāo)值，生成相對(duì)表達(dá)水平。
FACS/流式細(xì)胞術(shù)(2°抗體染色規(guī)程)所有溫育和旋轉(zhuǎn)都在4℃下進(jìn)行，各管不在冰箱中時(shí)都保持在冰上。
1.通過(guò)確定要使用的細(xì)胞系、目標(biāo)抗體和任何特殊的條件或處理，來(lái)確定管的規(guī)格。
a.對(duì)照i.未染色的，2°抗體，如果熒光團(tuán)具有重疊的發(fā)射光譜則進(jìn)行補(bǔ)償。
b.舉例

2.標(biāo)記FACS管。
a.BD Falcon 12×75mm聚苯乙烯圓底。目錄號(hào)3520523.準(zhǔn)備用于染色的細(xì)胞a.用Accutase或胰蛋白酶處理貼壁細(xì)胞i.Innovative Cell Technologies Inc，Accutase.
ii.Gibco，胰蛋白酶。目錄號(hào)25200-106b.如果細(xì)胞懸浮則繼續(xù)下面的步驟4.將細(xì)胞等分在15mL或50mL錐形管中。
5. 4℃，1200rpm旋轉(zhuǎn)細(xì)胞5min。
6.吸出上清。
7.將細(xì)胞重懸于5mL的FACS緩沖液中。
8. 4℃，1200rpm旋轉(zhuǎn)細(xì)胞5min。
9.吸出上清。
10.將細(xì)胞重懸于封閉緩沖液中。
a.確定所需的封閉緩沖液的體積i.每種細(xì)胞系的管數(shù)/處理×100μl封閉緩沖液每管。
ii.每100μl封閉緩沖液需要1×106個(gè)細(xì)胞。
11.向合適的管中加入100μl等份的細(xì)胞。
a.基于預(yù)先確定的管的規(guī)格。
12.將1°抗體加入合適的管中。
a.Lewis Ai.每管使用0.2μg/μl的儲(chǔ)液10μl。
1.終濃度為2μg。
ii Chemicon抗-唾液酰Lewis A.目錄號(hào)MAB2095b.Lewis Xi.每管使用0.5μg/μl的儲(chǔ)液5μl。
1.終濃度為2.5μg。
ii.BD PharmingenCD15s(唾液酰Lewis X)目錄號(hào)551344。
13. 4℃溫育30min。
14.每管加入1mL FACS緩沖液。
15. 4℃，1200rpm旋轉(zhuǎn)細(xì)胞5min。
16.吸出上清17.輕柔地使管“過(guò)架(rack)”以懸起沉淀。
a.“過(guò)架”使管在12×75mm的試管架的表面上從一邊運(yùn)動(dòng)到另一邊18.重復(fù)步驟14-17。
19.向每個(gè)組中加入100μl封閉緩沖液。
20.將2°抗體加入合適的管中。
a.每管用10μlb.Jackson，山羊抗小鼠FITC.目錄號(hào)115-096-06821. 4℃溫育30分鐘。
22.重復(fù)步驟14-17兩次。
23.將細(xì)胞重懸于FACS緩沖液/PI中。
a.確定需要的體積i.每管需要1mL溶液。
ii.PI＝1μl每1mL緩沖液。
b.Molecular Probes，碘化丙錠.目錄號(hào)P356624.將管置于冰槽或冰鎮(zhèn)的試管架上。
25.用鋁箔覆蓋，送到FACS實(shí)驗(yàn)室，由合格的操作人員采樣并分析。
5％封閉緩沖液1.FBS到總體積的5％。
2.FACS緩沖液。
3.通過(guò)0.2μm濾器過(guò)濾該溶液。
FACS緩沖液1. 980mL PBS。
2. 8mL 0.25M EDTA3. 20mL FBS.
4.通過(guò)0.2μm濾器過(guò)濾該溶液。
免疫組化方法唾液酰Lewis A抗體唾液酰Lewis A AB-1克隆121SLE
供應(yīng)商N(yùn)eoMarkers目錄號(hào).MS-279-PIg物種小鼠IHC方法石蠟預(yù)處理無(wú)IHC操作自動(dòng)染色裝置(Autostainer)同種型小鼠IgM方法物種人IgG濃度200μg/ml常規(guī)步驟脫石蠟并用蒸餾水重新水化。
用Vector抗生物素蛋白生物素封閉系統(tǒng)(Vector Avidin Biotin BlockingSystem)封閉內(nèi)源生物素。
用TBS漂洗換液2次，每次5分鐘。
用10％正常馬血清室溫封閉30分鐘。
將切片與用10％正常馬血清稀釋到5μg/ml的小鼠單克隆唾液酰Lewis A抗體在室溫共溫育60分鐘。
將用10％正常馬血清稀釋到5μg/ml的小鼠同種型IgM作為陰性對(duì)照。
用TBS漂洗換液2次，每次5分鐘。
將切片與用10％正常馬血清1∶200稀釋的生物素化馬抗小鼠抗體在室溫共溫育30分鐘。
用TBS漂洗換液2次，每次5分鐘。
將切片與稀釋的Vector ABC Elite System在室溫共溫育30分鐘。
用TBS漂洗換液2次，每次5分鐘。
將切片與Pierce金屬增強(qiáng)DAB(PierceMetal Enhanced DAB)共溫育5分鐘在流動(dòng)的自來(lái)水中漂洗5分鐘。
用Mayers蘇木精復(fù)染1分鐘。
在流動(dòng)的自來(lái)水中漂洗5分鐘。
用Richard-Allan藍(lán)染試劑藍(lán)染蘇木精1分鐘。
在流動(dòng)的自來(lái)水中漂洗2分鐘。脫水，透明，并封固在合成的封固介質(zhì)中。
免疫組化方法唾液酰Lewis X抗體小鼠抗唾液酰Lewis X克隆KM93供應(yīng)商Chemicon目錄號(hào).MAB2096Ig物種小鼠IHC方法石蠟預(yù)處理DAKO目標(biāo)修復(fù)劑(DAKO Target Retrieval)IHC操作自動(dòng)染色裝置同種型小鼠IgM方法物種人IgG濃度100μg/ml常規(guī)步驟脫石蠟并用蒸餾水重新水化。
用稀釋于dH2O中的1∶10稀釋液KPL封閉溶液(KPL Blocking Solution)室溫4分鐘消除內(nèi)源過(guò)氧化物酶活性。
在蒸餾水中漂洗5分鐘。
在沸水浴中，在預(yù)熱到99℃的DAKO Target Retrieval(S1700)中溫育20分鐘。從沸水浴中移出，使之冷卻20分鐘。
用Vector Avidin Biotin Blocking System封閉內(nèi)源生物素。
用10％正常馬血清(Normal Horse Serum)在室溫封閉30分鐘。
將切片與用10％正常馬血清稀釋到5μg/ml的小鼠單克隆唾液酰Lewis X抗體在室溫共溫育60分鐘。
將用10％正常馬血清稀釋到5μg/ml的小鼠同種型IgM作為陰性對(duì)照。
用TBS漂洗換液2次，每次5分鐘。
將切片與用10％正常馬血清1∶200稀釋的生物素化馬抗小鼠抗體在室溫共溫育30分鐘。
用TBS漂洗換液2次，每次5分鐘。
將切片與稀釋的Vector ABC Elite System在室溫共溫育30分鐘。
用TBS漂洗換液2次，每次5分鐘。
將切片與Pierce金屬增強(qiáng)DAB(PierceMetal Enhanced DAB)共溫育5分鐘在流動(dòng)的自來(lái)水中漂洗5分鐘。
用Mayers蘇木精復(fù)染1分鐘。
在流動(dòng)的自來(lái)水中漂洗5分鐘。
用Richard-Allan藍(lán)染試劑藍(lán)染蘇木精1分鐘。
在流動(dòng)的自來(lái)水中漂洗2分鐘。
脫水，透明，并封固在合成封固介質(zhì)中。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)用上述的方法和材料進(jìn)行。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如下面要討論的圖6-13所示。
圖6提供分析28個(gè)結(jié)腸或結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系對(duì)Apo2L(+0.5％胎牛血清“FBS”或10％FBS)或DR5單克隆抗體“mab”(交聯(lián)的“XL”或非交聯(lián)的，+0.5％胎牛血清“FBS”或10％FBS)的凋亡活性的敏感性或抗性，及其FUT 3，F(xiàn)UT 6，唾液酰Lewis A和唾液酰Lewis X的表達(dá)，所得數(shù)據(jù)的匯總表。
圖7提供不同的結(jié)腸或結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系對(duì)DR5抗體的敏感性及由定量PCR測(cè)量的FUT3的表達(dá)的比較。
圖8提供不同的結(jié)腸或結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系對(duì)DR5抗體(加上交聯(lián)物)的敏感性或抗性及由FACS確定的唾液酰Lewis X或A的表達(dá)的比較。
圖9A顯示分析不同的結(jié)腸或結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系的敏感性或抗性與FUT3表達(dá)之間的相關(guān)性的Spearman等級(jí)相關(guān)性檢驗(yàn)(Spearman RankCorrelation test)。
圖9B顯示分析不同的結(jié)腸或結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系的敏感性(“sens”)或抗性(“res”)的Fisher’s Exact檢驗(yàn)結(jié)果，和FUT3和唾液酰Lewis A/X的表達(dá)與各細(xì)胞系對(duì)DR5抗體凋亡活性的敏感性之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
圖10比較不同的結(jié)腸或結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系的DcR1或DcR2受體的表達(dá)(由定量PCR確定)及特定的細(xì)胞系對(duì)Apo2L或DR5抗體的狀態(tài)(敏感或抵抗)。
圖11比較不同的結(jié)腸或結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系的DcR1或DcR2受體的表達(dá)(由FACS確定)及特定的細(xì)胞系對(duì)Apo2L或DR5抗體的狀態(tài)(敏感或抵抗)。
圖12顯示4種結(jié)腸直腸細(xì)胞癌細(xì)胞系CaCo2(Colo2)，SW 1417，DLD-1，和Colo 205對(duì)唾液酰Lewis A和X的免疫組化染色，及其與唾液酰Lewis A和X的表達(dá)(如FACS測(cè)量的)的相互關(guān)系和與對(duì)Apo2L TRAIL的敏感性的相互關(guān)系。結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系Colo 2和SW1417在FACS中對(duì)于唾液酰Lewis抗原分別顯示無(wú)染色和弱的染色，分別是陰性和弱陽(yáng)性的并對(duì)Apo2L/TRAIL有抗性。而結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系DLD-1和Colo 205在FACS中對(duì)于唾液酰Lewis抗原分別顯示中等染色和強(qiáng)的染色，分別是中度和強(qiáng)陽(yáng)性的并對(duì)Apo2L/TRAIL敏感。
圖13是顯示正常結(jié)腸粘膜、正常肝組織、原發(fā)性結(jié)腸癌和結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的組織樣品中的唾液酰Lewis A和X的表達(dá)的IHC實(shí)驗(yàn)的總結(jié)。在IHC實(shí)驗(yàn)中檢驗(yàn)了排列在組織微陣列中的正常結(jié)腸和原發(fā)性結(jié)腸癌的組織樣品，而正常肝和轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌的組織樣品在單獨(dú)的玻片上。從正常結(jié)腸組織到原發(fā)性結(jié)腸癌再到轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌，唾液酰Lewis A和X的表達(dá)的廣泛度和免疫組化染色強(qiáng)度增加。正常的肝細(xì)胞對(duì)唾液酰Lewis A或X都沒(méi)有染色。
權(quán)利要求
1.預(yù)測(cè)哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞樣品對(duì)Apo2L/TRAIL的敏感性的方法，包括下列步驟得到哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞樣品；檢查所述組織或細(xì)胞樣品以檢測(cè)選自巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶3、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶6、唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)，其中，所述一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)預(yù)示所述組織或細(xì)胞樣品對(duì)Apo2L/TRAIL的凋亡誘導(dǎo)活性敏感。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)是通過(guò)檢測(cè)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶3或巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶6的mRNA表達(dá)來(lái)檢查的。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)是通過(guò)免疫組化檢測(cè)唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的表達(dá)來(lái)檢查的。
4.權(quán)利要求1的方法，還包括檢查所述組織或細(xì)胞樣品中DR4、DR5、DcR1或DcR2受體的表達(dá)的步驟。
5.權(quán)利要求1的方法，其中組織或細(xì)胞樣品包括癌組織或細(xì)胞。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述癌細(xì)胞是結(jié)腸、結(jié)腸直腸、胃腸或胰腺的癌細(xì)胞或組織。
7.在哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞樣品中誘導(dǎo)凋亡的方法，包括下列步驟得到哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞樣品；檢查所述組織或細(xì)胞樣品以檢測(cè)選自巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶3、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶6、唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)，及檢測(cè)所述一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)后，使所述組織或細(xì)胞樣品暴露于有效量的Apo2L/TRAIL。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)是通過(guò)檢測(cè)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶3或巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶6的mRNA表達(dá)來(lái)檢查的。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)是通過(guò)免疫組化檢測(cè)唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的表達(dá)來(lái)檢查的。
10.權(quán)利要求7的方法，還包括檢查所述組織或細(xì)胞樣品中DR4、DR5、DcR1或DcR2受體的表達(dá)的步驟。
11.權(quán)利要求7的方法，其中組織或細(xì)胞樣品包括癌組織或細(xì)胞。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述癌細(xì)胞是結(jié)腸、結(jié)腸直腸、胃腸或胰腺的癌細(xì)胞或組織。
13.權(quán)利要求7的方法，其中所述細(xì)胞被暴露于有效量的Apo2L/TRAIL多肽，該Apo2L/TRAIL多肽包括圖1(SEQ ID NO1)的氨基酸114-281。
14.治療哺乳動(dòng)物中的疾病，例如免疫相關(guān)疾病或癌癥的方法，包括下列步驟得到所述哺乳動(dòng)物的組織或細(xì)胞樣品；檢查所述組織或細(xì)胞樣品以檢測(cè)選自巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶3、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶6、唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)，及檢測(cè)所述一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)后，對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用有效量的Apo2L/TRAIL。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)是通過(guò)檢測(cè)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶3或巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶6的mRNA表達(dá)來(lái)檢查的。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)是通過(guò)免疫組化檢測(cè)唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的表達(dá)來(lái)檢查的。
17.權(quán)利要求14的方法，還包括檢查所述組織或細(xì)胞樣品中DR4、DR5、DcR1或DcR2受體的表達(dá)的步驟。
18.權(quán)利要求14的方法，其中組織或細(xì)胞樣品包括癌組織或細(xì)胞。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述癌細(xì)胞或組織包含結(jié)腸、結(jié)腸直腸、胃腸或胰腺的癌細(xì)胞或組織。
20.權(quán)利要求14的方法，其中對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用有效量的Apo2L/TRAIL多肽，該Apo2L/TRAIL多肽包括圖1(SEQ ID NO1)的氨基酸114-281。
21.權(quán)利要求14的方法，其中還對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用化學(xué)治療劑或放射療法。
22.權(quán)利要求14的方法，其中還對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用細(xì)胞因子、細(xì)胞毒劑或生長(zhǎng)抑制劑。
23.權(quán)利要求7的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽連接于聚乙二醇分子。
24.權(quán)利要求14的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽連接于聚乙二醇分子。
25.權(quán)利要求6的方法，其中所述癌細(xì)胞是結(jié)腸或結(jié)腸直腸癌細(xì)胞。
26.權(quán)利要求1的方法，其中所述Apo2L/TRAIL是包括圖1(SEQ IDNO1)的氨基酸41-281的多肽，或其生物活性片段。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述Apo2L/TRAIL是包括圖1(SEQ IDNO1)的氨基酸114-281的多肽。
28.權(quán)利要求12的方法，其中所述癌細(xì)胞是結(jié)腸或結(jié)腸直腸癌細(xì)胞。
29.權(quán)利要求20的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽由圖1(SEQ IDNO1)的氨基酸114-281組成。
30.預(yù)測(cè)哺乳動(dòng)物的結(jié)腸或結(jié)腸直腸癌細(xì)胞對(duì)Apo2L/TRAIL的敏感性的方法，包括下列步驟得到哺乳動(dòng)物結(jié)腸或結(jié)腸直腸癌細(xì)胞；檢查所述癌細(xì)胞以檢測(cè)選自巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶3、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶6、唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)，其中所述一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)預(yù)示所述癌細(xì)胞對(duì)Apo2L/TRAIL的凋亡誘導(dǎo)活性敏感。
31.在哺乳動(dòng)物結(jié)腸或結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的方法，包括下列步驟得到哺乳動(dòng)物結(jié)腸或結(jié)腸直腸癌細(xì)胞；檢查所述癌細(xì)胞以檢測(cè)選自巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶3、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶6、唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)，及在檢測(cè)所述一種或多種生物標(biāo)志表達(dá)后，將所述癌細(xì)胞暴露于有效量的Apo2L/TRAIL多肽。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽包括圖1(SEQ IDNO1)的氨基酸41-281，或其具有凋亡活性的片段。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽連接于聚乙二醇分子。
34.權(quán)利要求32的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽包括圖1(SEQ IDNO1)的氨基酸114-281。
35.治療哺乳動(dòng)物中結(jié)腸或結(jié)腸直腸的癌癥的方法，包括下列步驟得到所述哺乳動(dòng)物結(jié)腸或結(jié)腸直腸癌細(xì)胞樣品；檢查所述癌細(xì)胞樣品以檢測(cè)選自巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶3、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶6、唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原的一種或多種生物標(biāo)志的表達(dá)，及在檢測(cè)所述一種或多種生物標(biāo)志表達(dá)后，對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用有效量的Apo2L/TRAIL。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽包括圖1(SEQ IDNO1)的氨基酸41-281，或其具有凋亡活性的片段。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽連接于聚乙二醇分子。
38.權(quán)利要求36的方法，其中所述Apo2L/TRAIL多肽包括圖1(SEQ IDNO1)的氨基酸114-281。
全文摘要
提供了檢查哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞樣品中一種或多種生物標(biāo)志的方法和測(cè)定法。根據(jù)所公開(kāi)的方法和測(cè)定法，檢測(cè)到一種或多種這樣的生物標(biāo)志的表達(dá)預(yù)示或表明所述組織或細(xì)胞樣品將對(duì)凋亡誘導(dǎo)劑例如Apo2L/TRAIL和抗DR5激動(dòng)劑抗體敏感。可被檢查的特定生物標(biāo)志包括巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，特別是巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶3(FUT3)和/或巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶6(FUT6)，例如唾液酰Lewis A和/或唾液酰Lewis X抗原。還提供了試劑盒和制品。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101035912SQ200580034126
公開(kāi)日2007年9月12日 申請(qǐng)日期2005年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月6日
發(fā)明者克勞斯·W·瓦格納 申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司