專利名稱：一種提高發(fā)酵法生產(chǎn)l－絲氨酸產(chǎn)率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物材料導(dǎo)入已知微生物宿主菌中獲得高產(chǎn)菌株的方法，具體涉及到一種將已知基因?qū)隠-絲氨酸產(chǎn)生菌中并有效提高L-絲氨酸產(chǎn)率的方法。
背景技術(shù)：
谷氨酸脫氫酶(Glutamate Dehydrogenase，GDH)是廣泛存在于生物體內(nèi)，參與谷氨酸生物合成的關(guān)鍵酶，也是一種催化α-酮戊二酸生成L-谷氨酸的還原氨基化反應(yīng)的酶。有關(guān)這一酶的活性與L-絲氨酸產(chǎn)生能力的關(guān)系目前尚未見報(bào)道。
L-絲氨酸是一種重要的非必需氨基酸，其磷酸酯可解除疲勞，恢復(fù)體力，是一種重要的腫瘤抑制因子。L-絲氨酸是一種重要的生化試劑和藥劑，也可作為食品及飼料添加劑并可用于高級(jí)化妝品的生產(chǎn)。有關(guān)通過培養(yǎng)特定的微生物獲得L-絲氨酸的方法已有報(bào)道。而有關(guān)通過提高谷氨酸脫氫酶活性以增加L-絲氨酸產(chǎn)率的研究尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
由于目前國(guó)內(nèi)外通過提高谷氨酸脫氫酶活性以增加L-絲氨酸產(chǎn)率的研究沒有報(bào)道。本發(fā)明通過谷氨酸脫氫酶基因在L-絲氨酸產(chǎn)生菌中的超量表達(dá)來研究該酶活性的提高對(duì)L-絲氨酸產(chǎn)生能力的影響。
本發(fā)明研究并掌握一種通過在L-絲氨酸生產(chǎn)菌中超量表達(dá)谷氨酸脫氫酶基因而使L-絲氨酸的產(chǎn)率得到有效提高的方法。
本發(fā)明提供一種通過表達(dá)載體將谷氨酸脫氫酶基因在L-絲氨酸生產(chǎn)菌中表達(dá)使其產(chǎn)率提高的方法，具體方法步驟如下1、通過PCR擴(kuò)增谷氨酸脫氫酶基因，采用引物序列來自X59404；2、將PCR擴(kuò)增獲得的谷氨酸脫氫酶基因連接在穿梭表達(dá)載體pAE1的Sma I位點(diǎn)，pAE1含有來源于乳糖發(fā)酵短桿菌ATCC13869質(zhì)粒pAM330復(fù)制子片段和大腸桿菌質(zhì)粒pUC18片段；3、篩選獲得連有谷氨酸脫氫酶基因的重組表達(dá)載體pAEgdh10，通過電擊轉(zhuǎn)化法將其轉(zhuǎn)入L-絲氨酸產(chǎn)生菌。
本發(fā)明具體提供一種通過PCR擴(kuò)增谷氨酸脫氫酶基因的方法。
本發(fā)明還提供一種通過表達(dá)載體將谷氨酸脫氫酶基因在L-絲氨酸生產(chǎn)菌中表達(dá)的方法。
本發(fā)明提供用于PCR擴(kuò)增谷氨酸脫氫酶基因的引物序列引物15′-TCGTGCGCGCGCATGCAGCCGAGAT-3′，引物25′-GGTCTTAGATGACGCCCTGTGCCAGC-3′，該引物序列來源于GenBank，編號(hào)X59404。引物1對(duì)應(yīng)的核苷酸序列是第534-556個(gè)堿基對(duì)，引物2對(duì)應(yīng)的核苷酸序列是第1894-1919個(gè)堿基對(duì)。以L-谷氨酸產(chǎn)生菌-乳糖發(fā)酵菌B的染色體DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增出一個(gè)1.4kb的片斷。PCR反應(yīng)采用大連寶生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的PyrobestTMDNA聚合酶進(jìn)行，具體的反應(yīng)條件95℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性1分鐘，53℃復(fù)性1分鐘，72℃延伸2分鐘，循環(huán)30次；再72℃延伸10分鐘。
本發(fā)明還提供一種能在L-絲氨酸產(chǎn)生菌一黃色短桿菌中穩(wěn)定復(fù)制，并使其上連接的基因得到超量表達(dá)的穿梭表達(dá)載體。該載體含有來源于乳糖發(fā)酵短桿菌ATCC13869含有的野生型質(zhì)粒pAM330的復(fù)制子片斷，以及大腸桿菌質(zhì)粒pUC18的片斷可攜帶有卡那霉素抗性基因，該載體由發(fā)明人命名為pAE1。通過將PCR擴(kuò)增獲得的谷氨酸脫氫酶基因連接在載體pAE1的SmaI位點(diǎn)，篩選獲得連有谷氨酸脫氫酶基因的重組表達(dá)載體pAEgdh10，通過電擊轉(zhuǎn)化法將重組載體pAEgdh10轉(zhuǎn)入L-絲氨酸產(chǎn)生菌—黃色短桿菌C-11中。篩選獲得含有重組載體pAEgdh10的菌株并命名為黃色短桿菌C-14。
本發(fā)明通過PCR方法克隆來源于L-谷氨酸生產(chǎn)菌的谷氨酸脫氫酶基因，將其連接在一種穿梭表達(dá)載體上，該載體可在L-絲氨酸產(chǎn)生菌—黃色短桿菌中穩(wěn)定復(fù)制，并使其上連接的基因得到超量表達(dá)。通過培養(yǎng)含有該重組表達(dá)載體的L-絲氨酸生產(chǎn)菌，發(fā)現(xiàn)L-絲氨酸的產(chǎn)率有了明顯提高。
本發(fā)明L-絲氨酸產(chǎn)生菌—黃色短桿菌可通過市場(chǎng)購買獲得，購買L-絲氨酸產(chǎn)生菌，通過本發(fā)明表達(dá)載體將谷氨酸脫氫酶基因在L-絲氨酸生產(chǎn)菌中表達(dá)，利用發(fā)酵工藝，表明通過培養(yǎng)含有該重組表達(dá)載體的L-絲氨酸生產(chǎn)菌，L-絲氨酸的產(chǎn)率有明顯提高。
本發(fā)明篩選獲得含有重組載體pAEgdh10的菌株通過搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵培養(yǎng)基采用(本發(fā)明材料中％為重量百分比)蔗糖8-11％、酵母膏0.7-0.9％、(NH4)2SO41.0-2.0％、K2HPO40.01-0.02％、NaH2PO40.01-0.03％、MgSO4·7H2O0.02-0.05％、ZnSO4·7H2O0.001-0.002％。
利用500ml三角瓶裝25ml上述培養(yǎng)基，接種量5％，采用空氣恒溫?fù)u床，轉(zhuǎn)速250轉(zhuǎn)/分鐘，溫度30℃，發(fā)酵72小時(shí)。使用HITACHI的L-8500A型氨基酸分析儀進(jìn)行L-絲氨酸的測(cè)定。
通過以上技術(shù)發(fā)明，可達(dá)到如下效果通過采用本發(fā)明獲得的L-絲氨酸產(chǎn)生菌—黃色短桿菌C-14，其谷氨酸脫氫酶基因得到超量表達(dá)，通過發(fā)酵試驗(yàn)，L-絲氨酸產(chǎn)率較原始菌株黃色短桿菌C-11有較大提高，由C-11的20克/升提高至25克/升。


略
具體實(shí)施例方式
為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)效果，本發(fā)明的
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一谷氨酸脫氫酶基因在L-絲氨酸生產(chǎn)菌中的超量表達(dá)1、本發(fā)明通過PCR擴(kuò)增來源于L-谷氨酸產(chǎn)生菌-乳糖發(fā)酵菌B的谷氨酸脫氫酶基因。引物序列引物15′-TCGTGCGCGCGCATGCAGCCGAGAT-3′，引物25′-GGTCTTAGATGACGCCCTGTGCCAGC-3′。PCR反應(yīng)采用大連寶生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的PyrobestTMDNA聚合酶進(jìn)行，具體的反應(yīng)條件95℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性1分鐘，53℃復(fù)性1分鐘，72℃延伸2分鐘，循環(huán)30次；再72℃延伸10分鐘。通過PCR擴(kuò)增出1.4kb的谷氨酸脫氫酶基因片斷。
2、將PCR擴(kuò)增獲得的谷氨酸脫氫酶基因連接在穿梭表達(dá)載體pAE1的Sma I位點(diǎn)，篩選獲得正向連接有谷氨酸脫氫酶基因的重組表達(dá)載體pAEgdh10。
3、采用Bio-Rad MicroPulserTM型電擊儀，將重組載體pAEgdh10電擊轉(zhuǎn)化L-絲氨酸產(chǎn)生菌—黃色短桿菌C-11，篩選獲得含有重組載體pAEgdh10的菌株并命名為黃色短桿菌C-14。
4、黃色短桿菌C-14的搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵培養(yǎng)基蔗糖10％，酵母膏0.8％，(NH4)2SO41.5％，K2HPO40.02％，NaH2PO40.03％，MgSO4·7H2O0.05％，ZnSO4·7H2O0.001％。500ml三角瓶裝25ml培養(yǎng)基，接種，空氣恒溫?fù)u床，250轉(zhuǎn)/分鐘，30℃，發(fā)酵72小時(shí)。
5、使用HITACHI的L-8500A型氨基酸分析儀進(jìn)行L-絲氨酸的測(cè)定，其中黃色短桿菌C-14的L-絲氨酸產(chǎn)率為25克/升。
實(shí)施例二PCR擴(kuò)增獲得谷氨酸脫氫酶基因的方法引物序列引物15′-TCGTGCGCGCGCATGCAGCCGAGAT-3′，引物25′-GGTCTTAGATGACGCCCTGTGCCAGC-3′。
PCR反應(yīng)采用大連寶生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的PyrobestTMDNA聚合酶進(jìn)行，以乳糖發(fā)酵菌B的染色體DNA為模板，具體的反應(yīng)條件95℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性1分鐘，53℃復(fù)性1分鐘，72℃延伸2分鐘，循環(huán)30次；再72℃延伸10分鐘。
實(shí)施例三黃色短桿菌C-14的搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)方法發(fā)酵培養(yǎng)基蔗糖 10％酵母膏0.8％
(NH4)2SO41.5％K2HPO40.02％NaH2PO40.03％MgSO4·7H2O0.05％ZnSO4·7H2O0.001％500ml三角瓶裝25ml培養(yǎng)基，接種量5％，采用空氣恒溫?fù)u床，轉(zhuǎn)速250轉(zhuǎn)/分鐘，溫度30℃，發(fā)酵72小時(shí)。使用HITACHI的L-8500A型氨基酸分析儀進(jìn)行L-絲氨酸的測(cè)定。
權(quán)利要求
1.一種通過表達(dá)載體將谷氨酸脫氫酶基因在L-絲氨酸生產(chǎn)菌中表達(dá)使其產(chǎn)率提高的方法，其特征在于，(1)、通過PCR擴(kuò)增谷氨酸脫氫酶基因，采用引物序列來自X59404；(2)、將PCR擴(kuò)增獲得的谷氨酸脫氫酶基因連接在穿梭表達(dá)載體pAE1的Sma I位點(diǎn)，pAE1含有來源于乳糖發(fā)酵短桿菌ATCC13869質(zhì)粒pAM330復(fù)制子片段和大腸桿菌質(zhì)粒pUC18片段；(3)、篩選獲得連有谷氨酸脫氫酶基因的重組表達(dá)載體pAEgdh10，通過電擊轉(zhuǎn)化法將其轉(zhuǎn)入L-絲氨酸產(chǎn)生菌。
全文摘要
本發(fā)明公開一種通過谷氨酸脫氫酶基因在L－絲氨酸產(chǎn)生菌中的表達(dá)有效地提高L－絲氨酸產(chǎn)率的方法。通過PCR擴(kuò)增來源于谷氨酸棒桿菌的谷氨酸脫氫酶基因，并將該基因連接在適當(dāng)?shù)妮d體上獲得重組載體；通過電擊轉(zhuǎn)化法將該重組載體轉(zhuǎn)化用于發(fā)酵生產(chǎn)L－絲氨酸的黃色短桿菌中；通過谷氨酸脫氫酶基因的超量表達(dá)可明顯的提高L－絲氨酸的發(fā)酵產(chǎn)率。
文檔編號(hào)C12N15/53GK1982448SQ20051013095
公開日2007年6月20日 申請(qǐng)日期2005年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月13日
發(fā)明者魏東, 崔春生, 王煒, 謝玉清, 閆論 申請(qǐng)人:新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所