專利名稱：紅小豆鐵結(jié)合蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物蛋白及其編碼基因與應用，特別是涉及一種紅小豆鐵結(jié)合蛋白及其編碼基因與其在培育富鐵植物中的應用。
背景技術(shù)：
鐵是人體進行生理代謝活動所必需的元素之一，缺鐵對兒童的智力、體力發(fā)育以及免疫、消化吸收等功能均有較大影響。世界范圍內(nèi)約有30％的人口缺鐵，其中，以婦女和兒童最為嚴重。雖然食用添加鐵元素的食物以及吃一些補鐵藥物可以預防和治療缺鐵，但是這種預防和治療缺鐵癥的成本過高，難以在發(fā)展中國家普及。
鐵結(jié)合蛋白是存在于植物細胞質(zhì)體中的一種專門儲存鐵的蛋白質(zhì)。Goto et al用農(nóng)桿菌介導法，將水稻種子儲藏蛋白特有啟動子GluB-1和大豆鐵結(jié)合蛋白基因?qū)胨?，得到的轉(zhuǎn)基因水稻T1代種子的鐵含量為非轉(zhuǎn)基因水稻種子的3倍以上(GotoF Yoshihara T，Shigemoto N，Takaiwa F，1999，Ironfortifiation of rice seedby the soybean ferritin gene.Nature Biotechology，17282-286)。將這種鐵蛋白轉(zhuǎn)基因水稻在缺鐵的老鼠中也進行了試驗，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因水稻提供的鐵源與以其它形式提供的生物有效鐵源可達到相同的治療效果(Murray-Kolb LE，Takaiwa F GotoF et al.2002，Transgenic rice is a source of iron for iron for iron-depletedrats.J Nutr，132(5)957-960)。
植物中有關(guān)鐵結(jié)合蛋白基因的分離和克隆已涉及到大豆、豌豆、豇豆、苜蓿、玉米、油菜、擬南芥、馬鈴薯和蘭花等植物，但這些基因我國不擁有自主知識產(chǎn)權(quán)。此外，有關(guān)紅小豆中鐵結(jié)合蛋白基因的克隆在國內(nèi)外尚無報導。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種紅小豆鐵結(jié)合蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的紅小豆鐵結(jié)合蛋白，名稱為A-Fer，來源于豇豆屬紅小豆(Vignaangularis)，它具有下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有富集鐵作用的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID №1由255個氨基酸殘基組成。
本發(fā)明所提供的紅小豆鐵結(jié)合蛋白的編碼基因(A-Fer)，也屬于本發(fā)明的保護范圍。它可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴謹條件為65℃條件下雜交和洗膜，洗膜液為0.1×SSC、0.1％SDS。
序列表中的SEQ ID №2由1030個堿基組成，其編碼序列為自5’端第81-848位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
含有本發(fā)明基因的表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。
擴增A-Fer中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
利用植物表達載體，將本發(fā)明的紅小豆鐵結(jié)合蛋白基因?qū)胫参锛毎?，可獲得含鐵量提高的轉(zhuǎn)基因細胞系及轉(zhuǎn)基因植株。
所述植物表達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它的參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(Ti)質(zhì)粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。
使用A-Fer構(gòu)建植物表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或誘導型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、根部特異表達啟動子等，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
攜帶有本發(fā)明A-Fer的植物表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導、農(nóng)桿菌介導等常規(guī)生物學方法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物細胞或組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是水稻、小麥、玉米等單子葉植物，也可以是紅小豆、大豆、生菜、擬南芥等雙子葉植物。
本發(fā)明提供的紅小豆鐵結(jié)合蛋白的編碼基因?qū)⒃谂嘤昏F植物中具有重要的應用價值，為解決目前普遍存在的鐵缺乏問題提供了一條經(jīng)濟、有效的途徑。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。


圖1為3’RACE擴增產(chǎn)物的1％瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖2為第一次5’RACE擴增產(chǎn)物的1％瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖3為第二次5’RACE擴增產(chǎn)物的1％瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖4為第三次5’RACE擴增產(chǎn)物的1％瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖5為紅小豆鐵結(jié)合蛋白基因A-Fer的植物表達載體pCambia1301-UbiN-Fer的部分物理圖譜圖6為在潮霉素培養(yǎng)基中經(jīng)二輪篩選得到的旱稻297的成熟胚愈傷組織圖7為紅小豆鐵結(jié)合蛋白基因A-Fer轉(zhuǎn)基因水稻的PCR檢測結(jié)果具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
實施例1、紅小豆鐵結(jié)合蛋白基因A-Fer的克隆一、采用3’RACE擴增A-Fer的3’端序列從基因庫中搜索到其它植物的鐵結(jié)合蛋白的氨基酸序列，用DNAssist軟件進行序列比對，得到植物鐵結(jié)合蛋白保守的氨基酸殘基序列“AYFDRDN”，根據(jù)此氨基酸殘基序列設(shè)計簡并引物，再用DNAssist軟件對上述鐵結(jié)合蛋白基因的核苷酸序列進行序列比對，以降低簡并性，最終設(shè)計的3’RACE的引物序列為5’-TACTTNGACAGNGACAACG-3’。采用TaKaRa公司的3’RACE試劑盒并參照試劑盒說明書進行操作，擴增紅小豆鐵結(jié)合蛋白基因(命名為A-Fer)的3’端序列，反應結(jié)束后，對擴增產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖1所示(泳道M為Marker，泳道1-4為3’RACE擴增產(chǎn)物)，回收600-700bp之間的目的條帶(箭頭所指)進行測序，測序結(jié)果表明此3’RACE擴增產(chǎn)物具有序列表中SEQ ID №3的核苷酸序列，自5’端第1-19位堿基為3’RACE引物序列，自5’端第615-636位堿基為3’端接頭引物序列(TaKaRa公司)。NCBI Blastn分析結(jié)果表明該序列與植物鐵結(jié)合蛋白基因同源，其中，與菜豆和大豆的鐵蛋白基因部分序列的同源性可達90％以上，表明該擴增片段為紅小豆鐵結(jié)合蛋白基因的3’端序列。
二、采用5’RACE擴增A-Fer的5’端序列采用TaKaRa公司5’RACE試劑盒并參照試劑盒說明書進行操作，擴增A-Fer的5’端序列，由于用此5’RACE試劑盒每次擴增的片斷較短，因此本實施例共進行了三次5’RACE擴增，具體過程如下1、第一次5’RACE擴增根據(jù)步驟一擴增出的紅小豆鐵蛋白基因的3’端序列，設(shè)計反轉(zhuǎn)錄引物和兩對反向PCR引物，引物序列如下反轉(zhuǎn)錄引物5-P-15’-(P)CTGCCACACTGT-3’(5’端磷酸化)5-A1(1)5’-TGTGGAAAAGGGGGATGC-3’5-S1(1)5’-TCTTCCACCACGAGTGTTCTG-3’5-A2(1)5’-AGAAGTTGGTGAATGAG-3’5-S2(1)5’-TTGGAAAGCTACGTTGTC-3’采用巢式PCR法進行擴增，除擴增引物和退火溫度不同外，反應體系及反應條件均參照5’RACE試劑盒說明書，第一輪擴增引物為5-A1(1)和5-S1(1)，第二輪擴增引物為5-A2(1)和5-S2(1)，退火溫度均為58℃。反應結(jié)束后，對擴增產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖2所示(泳道M為Marker，泳道1為第一輪PCR產(chǎn)物原液，泳道2為第一輪PCR產(chǎn)物的10倍稀釋液，泳道3為第一輪PCR產(chǎn)物的100倍稀釋液)，回收約200bp的目的條帶(箭頭所指)，進行測序，測序結(jié)果表明此5’RACE擴增產(chǎn)物具有序列表中SEQ ID №4的核苷酸序列，自5’端第1-17位堿基為引物5-A2(1)序列，自5’端第33-45位堿基為反轉(zhuǎn)錄引物5-P-1引物序列，自5’端第175-193位堿基為引物5-S2(1)序列，自5’端第46-163位堿基為長度為118bp的新擴增區(qū)域。NCBI Blastn分析結(jié)果表明該序列為植物鐵結(jié)合蛋白基因的部分序列。
2、第二次5’RACE擴增根據(jù)步驟一擴增出的紅小豆鐵結(jié)合蛋白基因的3’端序列和第一次5’RACE擴增片段序列，設(shè)計第二次5’RACE反轉(zhuǎn)錄引物和兩對反向PCR引物，引物序列如下反轉(zhuǎn)錄引物5-P-25’-(P)CAAATCCCTTG-3’PCR擴增引物5-A1(2)5’-ACCACTCCTTGTTTGCATAC-3’5-S1(2)5’-TCGCAATCATCAGCGTAATAC-3’5-A2(2)5’-TGACAGGGACAACGTAGCTTTC-3’5-S2(2)5’-ACGAAACCTGTGGAGCAG-3’采用巢式PCR法進行擴增，除擴增引物和退火溫度不同外，反應體系及反應條件均參照5’RACE試劑盒說明書，第一輪擴增引物為5-A1(2)和5-S1(2)，第二輪擴增引物為5-A2(2)和5-S2(2)，退火溫度均為56℃。反應結(jié)束后，對擴增產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖3所示(泳道M為Marker，泳道1為第一輪PCR產(chǎn)物原液，泳道2為第一輪PCR產(chǎn)物的10倍稀釋液，泳道3為第一輪PCR產(chǎn)物的100倍稀釋液)，回收200-300bp之間的目的條帶(箭頭所指)，進行測序，測序結(jié)果表明此5’RACE擴增產(chǎn)物具有序列表中SEQ ID №5的核苷酸序列，自5’端第1-21位堿基為引物5-A2(2)序列，自5’端第22-33位堿基為反轉(zhuǎn)錄引物5-P-2序列，自5’端第206-225位堿基為引物5-S2(2)序列，自5’端第34-203位堿基為長度為171bp的新擴增區(qū)域。NCBI Blastn分析結(jié)果表明該序列為植物鐵結(jié)合蛋白基因的部分序列。
3、第三次5’RACE擴增根據(jù)步驟一擴增出的紅小豆鐵蛋白基因的3’端序列和兩次5’RACE擴增片段的序列，設(shè)計第三次5’RACE反轉(zhuǎn)錄引物和兩對反向PCR引物，引物序列如下反轉(zhuǎn)錄引物5-P-(2)5’-(P)CAAATCCCTTG-3’PCR擴增引物5-A1(3)5’-ACCACTCCTTGTTTGCATAC-3’5-S1(3)5’-CAGTGAGAGGCGCAGTTGAGG-3’5-A2(3)5’-TGACAGGGACAACGTAGCTTTC-3’5-S2(3)5’-TCTGCTTTCCCCTTTCTTATTC-3’采用巢式PCR法進行擴增，除擴增引物和退火溫度不同外，反應體系及反應條件均參照5’RACE試劑盒說明書，第一輪擴增引物為5-A1(3)和5-S1(3)，第二輪擴增引物為5-A2(3)和5-S2(3)，退火溫度均為60℃。反應結(jié)束后，對擴增產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖4所示(泳道M為Marker，泳道1為第一輪PCR產(chǎn)物的100倍稀釋液，泳道2為第一輪PCR產(chǎn)物的10倍稀釋液，泳道3為第一輪PCR產(chǎn)物原液)，回收200-300bp之間的目的條帶(箭頭所指)，進行測序，測序結(jié)果表明此5’RACE擴增產(chǎn)物具有序列表中SEQ ID №6的核苷酸序列，自5’端第1-21位堿基為引物5-A2(3)序列，自5’端第22-32位堿基為反轉(zhuǎn)錄引物5-P-2序列，自5’端第33-159位堿基為長度為127bp的新擴增區(qū)域。NCBI Blastn分析結(jié)果表明該序列為植物鐵結(jié)合蛋白基因的部分序列。
將3’RACE和5’RACE擴增的序列拼接起來，得到紅小豆鐵蛋白基因A-Fer的cDNA序列，具有序列表中SEQ ID №2的核苷酸序列，由1030個堿基組成，其編碼序列為自5’端第81-848位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。進行序列的同源性比對，比對結(jié)果如表1所示，表明該紅小豆鐵結(jié)合蛋白基因所編碼的蛋白質(zhì)序列與其他植物鐵結(jié)合蛋白基因具有較高的同源性，其中，與菜豆和大豆的鐵結(jié)合蛋白基因的CDS編碼的蛋白質(zhì)序列的同源性可達90％以上。
表1紅小豆鐵結(jié)合蛋白基因CDS編碼的蛋白質(zhì)序列同源性比對結(jié)果

實施例2、轉(zhuǎn)紅小豆鐵結(jié)合蛋白基因A-Fer水稻的獲得、分子檢測及鐵含量測定一、A-Fer轉(zhuǎn)基因水稻的獲得及其PCR檢測1、紅小豆鐵蛋白基因植物表達載體的構(gòu)建根據(jù)紅小豆鐵蛋白基因的CDS序列設(shè)計引物，引物兩端引入酶切位點CDS-P-ATG5’-TCCCCCGGGATGGCCCTTGCTCCATCTAAAG-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶SmaI識別位點及保護堿基)CDS-P-TGA5’-GACTAGTTCAAGCAGCATGTCCATC-3’(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶SpeI識別位點及保護堿基)以紅小豆的基因組DNA為模板，在引物CDS-P-ATG和引物CDS-P-TGA的引導下，PCR擴增紅小豆鐵蛋白基因的CDS序列，再將該序列克隆入植物表達載體pCambia1301-UbiN(GenBank號AF234296)多克隆位點的SmaI和SpeI酶切位點之間，得到紅小豆鐵蛋白基因A-Fer的植物表達載體，命名為pCambia1301-UbiN-A-Fer，該載體部分物理圖譜如圖5所示。
2、紅小豆鐵蛋白基因植物表達載體轉(zhuǎn)化水稻將步驟1構(gòu)建的紅小豆鐵蛋白基因A-Fer的植物表達載體pCambia1301-UbiN-A-Fer用基因槍法轉(zhuǎn)化旱稻297成熟胚愈傷組織，用含50mg/L潮霉素的NB培養(yǎng)基進行2輪篩選，每輪篩選20-30天，獲得的抗性愈傷組織如圖6所示，再經(jīng)預分化、分化得到抗性植株。
3、抗性植株的PCR檢測提取步驟2抗性植株的基因組DNA，以此為模板，在引物15’-TCAACTGCGCCTCTCACTG-3’和引物25’-TTGCGATCTGCCACACTG-3’抗性植株的PCR檢測，PCR反應條件為先94℃ 3min；再94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 90sec，共30個循環(huán)；最后72℃ 10min。反應結(jié)束后，對擴增產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖7所示(泳道M為Marker，泳道1-12為不同轉(zhuǎn)基因株系的PCR擴增產(chǎn)物)，轉(zhuǎn)基因陽性植株可擴增出約500bp的條帶，表明獲得了紅小豆鐵結(jié)合蛋白基因A-Fer的轉(zhuǎn)基因水稻。
二、A-Fer轉(zhuǎn)基因植株的鐵含量測定取步驟一獲得的不同株系的紅小豆鐵結(jié)合蛋白基因A-Fer的轉(zhuǎn)基因水稻的葉片進行鐵含量測定(以野生型植株為對照)，測定結(jié)果如表2所示，轉(zhuǎn)基因植株的鐵含量明顯高于對照，與野生型植株相比，轉(zhuǎn)基因植株的鐵含量最高可增加2倍。
表2轉(zhuǎn)鐵蛋白基因水稻葉片中鐵含量的測定結(jié)果

序列表<160>6<210>1<211>255<212>PRT<213>豇豆屬紅小豆(Vigna angularis)<400>1Met Ala Leu Ala Pro Ser Lys Val Ser Pro Phe Ser Gly Phe Ser Leu1 5 10 15Ser Asp Cys Val Gly Gly Ala Ala Arg Asn Pro Thr Cys Ser Val Ser20 25 30Leu Ser Phe Leu Asn Lys Lys Gly Glu Ser Arg Asn Leu Gly Val Ser35 40 45Ala Ser Thr Ala Pro Leu Thr Gly Val Ile Phe Glu Pro Phe Glu Glu50 55 60Val Lys Lys Glu Glu Leu Ala Val Pro Thr Ala Pro Gln Val Ser Leu65 70 75 80Ala Arg Gln Tyr Tyr Ala Asp Asp Cys Glu Pro Ala Ile Asn Glu Gln85 90 95Ile Asn Val Glu Tyr Asn Ala Ser Tyr Val Tyr His Ser Leu Phe Ala100 105 110Tyr Phe Asp Arg Asp Asn Val Ala Leu Lys Gly Phe Ala Lys Phe Phe115 120 125Lys Glu Ser Ser Glu Glu Glu Arg Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys130 135 140Tyr Gln Asn Thr Arg Gly Gly Arg Val Val Leu His Ser Ile Lys Asn145 150 155 160Val Pro Ser Glu Phe Glu His Val Glu Lys Gly Asp Ala Leu His Ala165 170 175
Met Glu Leu Ala Leu Ser Leu Glu Lys Leu Val Asn Glu Lys Leu Arg180 185 190Ser Val His Ser Val Ala Asp Arg Asn Asn Asp Pro Gln Leu Ala Asp195 200 205Phe Ile Glu Ser Glu Phe Leu Ser Glu Gln Val Glu Ala Ile Lys Lys210 215 220Ile Ser Glu Tyr Val Ala Gln Leu Arg Arg Val Gly Lys Gly His Gly225 230 235 240Val Trp His Phe Asp Gln Ser Leu Leu His Asp Gly His Ala Ala245 250 255<210>2<211>1030<212>DNA<213>豇豆屬紅小豆(Vigna angularis)<400>2ttgtctcttc tacttccctc tccatttcct ttccctgttt ctcagccttt ttcgattacc 60cttttggaga ttttgatctc atggcccttg ctccatctaa agtttctccc ttttctgggt120tctccctctc agactgtgtt gggggtgccg cgagaaaccc aacttgttct gtttctttga180gttttctgaa taagaaaggg gaaagcagaa accttggggt ttctgcctca actgcgcctc240tcactggggt gatctttgaa ccctttgagg aggttaagaa ggaagagctc gctgttccca300ctgctccaca ggtttcgttg gctcgtcagt attacgctga tgattgcgaa cctgcgatta360acgagcagat taatgtggaa tacaatgctt cctatgtgta ccactccttg tttgcatact420ttgacaggga caacgtagct ctcaagggat ttgccaagtt cttcaaggaa tctagtgaag480aagaaagaga gcatgctgaa aagcttatga aatatcagaa cactcgtggt ggaagagttg540ttcttcactc catcaagaat gtaccctcag aatttgagca tgtggaaaag ggggatgcat600tacatgcaat ggaattagct ttgtctttgg agaagttggt gaatgagaaa cttcggagtg660tgcacagtgt ggcagatcgc aacaatgacc ctcaattggc tgacttcata gaaagcgagt720ttctgtctga acaggttgaa gcaattaaga agatatcaga gtatgtggct caactgagga780gggtcggaaa gggtcacggt gtgtggcact ttgatcaaag tcttcttcat gatggacatg840ctgcttgaat agtctttata gttctcgttt ccatttgttc ttccatcgcc ttctgagctg900
ttttctaatt tagaagtaga atttaaatgt ttttcctctg tattgaggtg taagaacttg 960tagtgttgtc gcagcaagta tgtaaaagac tacatgttat gcaatatcat ttgatgaaaa1020aaaaaaaaaa 1030<210>3<211>636<212>DNA<213>豇豆屬紅小豆(Vigna angularis)<400>3tactttgaca gggacaacgt agctctcaag ggatttgcca agttcttcaa ggaatctagt 60gaagaagaaa gagagcatgc tgaaaagctt atgaaatatc agaacactcg tggtggaaga120gttgttcttc actccatcaa gaatgtaccc tcagaatttg agcatgtgga aaagggggat180gcattacatg caatggaatt agctttgtct ttggagaagt tggtgaatga gaaacttcgg240agtgtgcaca gtgtggcaga tcgcaacaat gaccctcaat tggctgactt catagaaagc300gagtttctgt ctgaacaggt tgaagcaatt aagaagatat cagagtatgt ggctcaactg360aggagggtcg gaaagggtca cggtgtgtgg cactttgatc aaagtcttct tcatgatgga420catgctgctt gaatagtctt tatagttctc gtttccattt gttcttccat cgccttctga480gctgttttct aatttagaag tagaatttaa atgtttttcc tctgtattga ggtgtaagaa540cttgtagtgt tgtcgcagca agtatgtaaa agactacatg ttatgcaata tcatttgatg600aaaaaaaaaa aaaaggatcc ggtacct cta gatcag 636<210>4<211>192<212>DNA<213>豇豆屬紅小豆(Vigna angularis)<400>4gaagttggtg aatgagaaac ttcggagtgt gcacagtgtg gcagcactgc tccacaggtt 60tcgttggctc gtcagtatta cgctgatgat tgcgaatctg cgattaacga gcagattaat120gtggaataca atgcttccta tgtgtaccac tccttgtttg catactttga cagggacaac180gtagctttcc aa192
<210>5<211>223<212>DNA<213>豇豆屬紅小豆(Vigna angularis)<400>5tgacagggac aacgtagctt tcaagggatt tgctcagact gtgttggggg tgccgcgaga 60aacccaactt gttctgtttc tttgagtttt ctgaataaga aaggggaaag cagaaacctt120ggggtttctg cctcaactgc gcctctcact ggggtgatct ttgaaccctt tgaggaggtt180aagaaggaag agctcgctgt tcccactgct ccacaggttt cgt 223<210>6<211>241<212>DNA<213>豇豆屬紅小豆(Vigna angularis)<400>6tgacagggac aacgtagctt tcaagggatt tgttgtctct tctacttccc tctccatttc 60ctttccctgt ttctcagcct ttttcgatta cccttttgga gattttgatc tcatggccct120cgctccttct aaagtttctc ccttttctgg gttctccctc tcagactgtg ttgggggtgc180cgcgagaaac ccaacttgtt ctgtttcttt gagttttctg aataagaaag gggaaagcag240a24權(quán)利要求
1.紅小豆鐵結(jié)合蛋白，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有富集鐵作用的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述紅小豆鐵結(jié)合蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的編碼基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID№2的DNA序列。
5.含有權(quán)利要求2或3或4所述基因的表達載體。
6.含有權(quán)利要求2或3或4所述基因的轉(zhuǎn)基因細胞系。
7.含有權(quán)利要求2或3或4所述基因的宿主菌。
8.一種培育富鐵植物的方法，是利用植物表達載體將權(quán)利要求2或3或4所述的紅小豆鐵結(jié)合蛋白基因?qū)胫参锛毎?，獲得含鐵量提高的轉(zhuǎn)基因細胞系及轉(zhuǎn)基因植株。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述被轉(zhuǎn)化的植物宿主為紅小豆、水稻、玉米、小麥、大豆或生菜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種紅小豆鐵結(jié)合蛋白及其編碼基因與應用。其目的是提供一種紅小豆鐵結(jié)合蛋白及其編碼基因與其在培育富鐵植物中的應用。該蛋白具有下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有富集鐵作用的蛋白質(zhì)。其編碼基因可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明的基因?qū)⒃谂嘤昏F植物中具有重要的應用價值，為解決目前普遍存在的鐵缺乏問題提供了一條經(jīng)濟、有效的途徑。
文檔編號C12N15/29GK1687418SQ20051006834
公開日2005年10月26日 申請日期2005年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月8日
發(fā)明者付永彩, 劉燕, 孫傳清, 朱作峰, 徐杰 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學