專利名稱：一種稻瘟病抗性相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種稻瘟病抗性相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻是世界上最重要的糧食作物之一，在我國(guó)農(nóng)業(yè)和國(guó)民經(jīng)濟(jì)中也占據(jù)重要地位。因此提高水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。病害侵襲是造成水稻減產(chǎn)和品質(zhì)下降的主要原因之一，培育具有優(yōu)良抗病性的水稻品種將有助于減輕病害引起的損失。水稻病害主要包括細(xì)菌性，真菌性和病毒性三種，關(guān)于水稻-病原菌相互作用機(jī)理的研究在近年來取得顯著進(jìn)展，克隆了一批特異性的抗病基因以及防衛(wèi)基因，如抗水稻白葉枯病的Xa21和Xa26等。
稻瘟病(rice blast disease)是水稻主要的真菌性病害，由真菌Magnaporthegrisea引起，許多研究工作致力于克隆抗稻瘟病的相關(guān)基因。目前已經(jīng)從水稻中分離了一些稻瘟病抗性基因，如Pib和Pi-ta等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種稻瘟病抗性相關(guān)蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的稻瘟病抗性相關(guān)蛋白，名稱為OsBRR1(Oryza sativa blastresistance related protein1)，來源于水稻(Oryza sativa L.)，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №3；2)將序列表中SEQ ID №3的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與稻瘟病抗性相關(guān)的蛋白質(zhì)。
序列表中的序列3由1001個(gè)氨基酸殘基組成，自氨基端第316位至579位氨基酸殘基為富含亮氨酸重復(fù)(leucine-rich repeat，LRR)的結(jié)構(gòu)域，自氨基端第678位至957位氨基酸殘基為蛋白激酶(protein kinase)結(jié)構(gòu)域。因此推斷該蛋白為富含亮氨酸重復(fù)的類受體激酶(leucine-rich repeat containingreceptor-like kinase，LRR-RLK)。已發(fā)現(xiàn)植物中編碼該類蛋白的基因與個(gè)體發(fā)育及防御反應(yīng)等密切相關(guān)。
所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
OsBRR1的編碼基因(OsBRR1)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
OsBRR1的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №3蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中的序列1由3006個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5′端第1位至3006位堿基。
OsBRR1的基因組基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №3蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中的序列2由3420個(gè)堿基組成，其開放閱讀框架為自5′端起第1位-3420位堿基，該基因含有2個(gè)外顯子(自序列2的5′端起第1位-2565位堿基，自序列2的5′端起第2980位-3420位堿基)，1個(gè)內(nèi)含子(自序列2的5′端起第2566位-2979位堿基)。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下雜交并洗膜。
含有OsBRR1基因的表達(dá)載體，細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增OsBRR1基因中任一片段的引物也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種利用上述稻瘟病抗性相關(guān)蛋白編碼基因增強(qiáng)水稻稻瘟病抗性的方法。
本發(fā)明所提供的增強(qiáng)水稻稻瘟病抗性的方法，是將上述稻瘟病抗性相關(guān)蛋白編碼基因?qū)胨?，篩選得到過量表達(dá)所述稻瘟病抗性相關(guān)蛋白的水稻植株即為稻瘟病抗性增強(qiáng)的植株。
可利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明所提供的稻瘟病抗性相關(guān)蛋白編碼基因?qū)胨?。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種一般性啟動(dòng)子、增強(qiáng)啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所使用的載體進(jìn)行加工，如加入可選擇性標(biāo)記(GUS基因、GFP和熒光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標(biāo)記基因(慶大霉素，卡那霉素等)。為了轉(zhuǎn)基因植物釋放的安全性，在構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)也可不攜帶任何標(biāo)記基因，在苗期進(jìn)行特定PCR分子標(biāo)記篩選。含有本發(fā)明的OsBRR1基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)或基因槍等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。
RNAi和過量表達(dá)結(jié)果的分析表明，OsBRR1基因的表達(dá)量和水稻的稻瘟病抗性水平密切相關(guān)。本發(fā)明的稻瘟病抗性相關(guān)蛋白將其編碼基因在水稻抗稻瘟病育種工作中具有良好的應(yīng)用前景。


圖1A為pCADS1341的T-DNA區(qū)結(jié)構(gòu)示意1B為pCUbi1390的T-DNA區(qū)結(jié)構(gòu)示意2A為T0代OsBRR1-RNAi水稻植株的Southern檢測(cè)圖2B為T0代OsBRR1-RNAi水稻植株的Northern檢測(cè)圖3為T1代OsBRR1-RNAi水稻植株的RT-PCR和研54-04抗性檢測(cè)圖4為T0代OsBRR1過量表達(dá)水稻植株的RT-PCR和97-27-2抗性檢測(cè)具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
T0表示由水稻的愈傷組織得到的轉(zhuǎn)基因植株，T1表示T0代自交產(chǎn)生的種子及由它所長(zhǎng)成的植株。
實(shí)施例1、獲得OsBRR1編碼基因根據(jù)水稻基因組和cDNA測(cè)序結(jié)果預(yù)測(cè)OsBRR1基因及其開放閱讀框，利用引物5’-CGGGGTACCGCCTCATCCATGGCACTGG-3’和5’-CGCGGATCCAGGACACCAGCACAGTCCA-3’從水稻cDNA中擴(kuò)增獲得OSBRR1的cDNA基因。其中，使用TRIZOL一步法提取粳稻品種日本晴的葉片總RNA，取2μg總RNA采用SuperScriptTMfirst-strand synthesis system來制備cDNA。整個(gè)操作均按照試劑盒推薦的條件進(jìn)行。將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連入pGEM-T Easy(購(gòu)自promega公司)載體，得到含有該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物的重組載體，進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為3006個(gè)堿基，具有序列表中序列1的DNA序列，編碼具有序列表中SEQ ID №3氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)OsBRR1。
利用引物5’-CGGGGTACCGAAACTCGGACACCCACTC-3’和5’-CGCGGATCCAGGACACCAGCACAGTCCA從日本晴基因組DNA中擴(kuò)增獲得OsBRR1的基因組基因。將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連入pGEM-T Easy載體，得到含有該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物的重組載體，進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為由3420個(gè)堿基，具有序列表中序列2的DNA序列，編碼具有序列表中SEQ ID №3氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)OsBRR1。OsBRR1的基因組基因的開放閱讀框架為自5′端起第1位-3420位堿基，該基因含有2個(gè)外顯子(自序列2的5′端起第1位-2565位堿基，自序列2的5′端起第2980位-3420位堿基)，1個(gè)內(nèi)含子(自序列2的5′端起第2566位-2979位堿基)。
上述PCR擴(kuò)增OSBRR1的cDNA基因及其基因組基因的條件為先94℃ 5min；接著94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 3min 8個(gè)循環(huán)；94℃ 1min，62℃ 1min，72℃ 3min 22個(gè)循環(huán)；最后72℃ 7min。
實(shí)施例2、OsBRR1的功能驗(yàn)證1、構(gòu)建RNAi和過量表達(dá)載體及其轉(zhuǎn)化植株使用TRIZOL一步法提取水稻日本晴葉片總RNA，取2μg總RNA采用SuperScriptTMfirst-strand synthesis system來制備cDNA。整個(gè)操作均按照試劑盒推薦的條件進(jìn)行。
以日本晴的cDNA為模板，用引物5’-CGCTCTAGAGCTCGGTGTCACCATCAATAGGAG-3’和5’-CGCGGATCCATGGCGTTGAAGTAGGCGAAC-3’按照常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為先94℃ 5min；接著94℃ 1min，52℃ 1min，72℃ 2min 8個(gè)循環(huán)；94℃ 1min，62℃ 1min，72℃ 2min 22個(gè)循環(huán)；最后72℃ 7min。得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為452bp。將該452bp的DNA片段以反向重復(fù)的方式插入RNAi載體pCADS1341。pCADS1341的T-DNA區(qū)結(jié)構(gòu)如圖1A所示，植物選擇標(biāo)記為潮霉素(HYG)抗性(R)，RNAi系統(tǒng)由CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。pCADS1341按如下方法構(gòu)建使用EcoRI/PstI酶切pFGC5941(GenBank注冊(cè)號(hào)AY310901，構(gòu)建方法見參考文獻(xiàn)McGinnis K etal.Transgene-induced RNA interference as a tool for plant functionalgenomics.Methods Enzymol，2005，3921-24)，電泳分離大小約為3.5kb的RNA干涉載體功能片段，插入pCAMBIA1300((CAMBIA購(gòu)買))的EcoRI/PstI位點(diǎn)，即得到載體pCADS1341。
將PCR擴(kuò)增得到的長(zhǎng)度為452bp的DNA片段以反向重復(fù)的方式插入pCADS1341的具體方法為先將該片段用SacI/NcoI酶切，插入到pCADS1341的SacI/NcoI克隆位點(diǎn)，得到中間載體后，再將經(jīng)BamHI/XbaI酶切的該長(zhǎng)度為452bp的片段插入到該中間載體的BamHI/XbaI克隆位點(diǎn)，即得到該片段反向重復(fù)插入pCADS1341的RNAi表達(dá)載體。每一步連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞中，利用卡那霉素抗性篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，挑選有插入片段的克隆測(cè)序鑒定，得到含有反向重復(fù)插入上述452bp DNA片段的RNAi表達(dá)載體pCADS1341-OsBRR1。
用引物5’-CGGGGTACCGAAACTCGGACACCCACTC-3’和5’-CGCGGATCCAGGACACCAGCACAGTCCA-3’從日本晴基因組DNA中按照常規(guī)方法PCR擴(kuò)增OsBRR1全長(zhǎng)基因，載體pCUbi1390和OsBRR1全長(zhǎng)基因均經(jīng)限制性內(nèi)切酶KpnI和BaHI酶切后，用T4 DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)入E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞中，利用卡那霉素抗性篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，挑選有插入片段的克隆測(cè)序鑒定，得到含有OsBRR1全長(zhǎng)基因的過量表達(dá)載體pCUbi1390-OsBRR1。其中，pCUbi1390的T-DNA區(qū)結(jié)構(gòu)如圖1B所示，植物選擇標(biāo)記為潮霉素(HYG)抗性(R)，過量表達(dá)系統(tǒng)由玉米u(yù)biquitin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。載體pCUbi1390按照如下方法構(gòu)建利用引物5’-GCCCAAGCTTCTAGTGCAGTGCAGCGTGAC-3’和5’-GCAACTGCAGGTACCTAGTGCAGAAGTAACACCA-3’從pMCG161(GenBank注冊(cè)號(hào)AY572837，構(gòu)建方法見參考文獻(xiàn)McGinnis K et al.Transgene-induced RNAinterference as a tool for plant functional genomics.Methods Enzymol，2005，3921-24)擴(kuò)增獲得玉米u(yù)biquitin啟動(dòng)子，并將其插入到pCAMBIA1390(從CAMBIA購(gòu)買)的HindIII/PstI克隆位點(diǎn)，即得到過量表達(dá)載體pCUbi1390。
將pCADS1341-OsBRR1和pCUbi1390-OsBRR1分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，質(zhì)粒PCR及酶切鑒定后，將陽(yáng)性菌株轉(zhuǎn)化按常規(guī)植物組織培養(yǎng)方法制備的日本晴的生長(zhǎng)狀態(tài)良好、顆粒狀愈傷組織，按照常規(guī)方法培養(yǎng)，得到再生植株。提取再生植株的基因組DNA，以5’-AAGTTCGACAGCGTCTCCGAC-3’和5’-TCTACACAGCCATCGGTCCAG-3’為正向和反向引物PCR擴(kuò)增潮霉素抗性基因進(jìn)行PCR鑒定，得到20株轉(zhuǎn)pCADS1341-OsBRR1植株，為T0代OsBRR1-RNAi水稻植株；102株轉(zhuǎn)pCUbi1390-OsBRR1植株，為T0代OsBRR1過量表達(dá)水稻植株。按照上述方法得到轉(zhuǎn)空載體pCADS1341或pCUbi1390的對(duì)照植株。
2、在OsBRR1-RNAi水稻植株中驗(yàn)證OsBRR1的功能取8株(1-8號(hào)植株)T0代OsBRR1-RNAi水稻植株按照常規(guī)方法進(jìn)行Southern和Northern檢測(cè)。其中，Southern檢測(cè)中，水稻葉片樣品的基因組DNA用EcoRI酶切后進(jìn)行Southern雜交，探針為以pCADS1341-OsBRR1為模板，用引物5’-AAGTTCGACAGCGTCTCCGAC-3’和5’-TCTACACAGCCATCGGTCCAG-3’PCR擴(kuò)增得到的潮霉素抗性基因片段；Northern檢測(cè)中，Northern雜交的探針為以T0代OsBRR1-RNAi日本晴水稻植株的葉片cDNA為模板，用引物5，-TCGCACCTCCAGTCACTCAAC-3’和5’-CGATTCCGGAAGAGGTTCAGC-3’PCR擴(kuò)增得到的OsBRR1的cDNA片段。Southern檢測(cè)的結(jié)果表明1號(hào)樣品中T-DNA為單拷貝插入，RNAi的效率也是最高的，因此選擇該樣品進(jìn)行T1代分析(圖2A，1-8為植株編號(hào)，箭頭示電泳方向)。Northern檢測(cè)結(jié)果表明1，3，8號(hào)植株中的OsBRR1基因表達(dá)量與未轉(zhuǎn)基因的日本晴相比明顯降低(圖2B)。圖2B中，1，3，4，5，8為植株編號(hào)，CK1為野生型日本晴植株，CK2為按照常規(guī)方法獲得的轉(zhuǎn)pCADS1341空載體的日本晴植株，箭頭示電泳方向。
使用日本晴具有一定抗性的稻瘟菌菌株研54-04對(duì)OsBRR1-RNAi水稻植株中的1號(hào)T1代苗期植株進(jìn)行了噴霧接種，結(jié)果表明1號(hào)的T1代OsBRR1-RNAi水稻植株對(duì)研54-04的抗性與轉(zhuǎn)pCADS1341空載體的對(duì)照植株相比明顯下降(表1)。
其中，葉瘟分級(jí)參照國(guó)際水稻研究所(international rice research institute，IRRI)制定的標(biāo)準(zhǔn)。R1-R4視為抗病，S5-S6視為感病，從R1到S6抗性依次減弱。
表1 T1代OsBRR1-RNAi植株對(duì)稻瘟菌研54-04的抗性分析


對(duì)OsBRR1-RNAi水稻植株中，8株1號(hào)的T1代水稻植株進(jìn)行了RT-PCR和研54-04抗性分析，結(jié)果表明OsBRR1基因表達(dá)量的下降和水稻對(duì)研54-04抗性的下降呈正相關(guān)性(圖3)。其中，水稻actin基因的表達(dá)量作為內(nèi)對(duì)照。PCR擴(kuò)增actin基因cDNA片段所用引物為5’-GACCTTGCTGGGCGTGATCTC-3’和5’-GATGGGCCAGACTCGTCGTAC-3’。擴(kuò)增OsBRR1基因cDNA片段所用引物為5’-TCTCGGCGGAGATACAGACGC-3’和5’-GTGGGTCGGCGATCTTCGTGA-3’。
3、在OsBRR1過量表達(dá)水稻植株中驗(yàn)證OsBRR1的功能使用日本晴敏感的稻瘟菌菌株97-27-2對(duì)苗期的T0代OsBRR1過量表達(dá)水稻植株進(jìn)行了噴霧接種，結(jié)果表明T0代OsBRR1過量表達(dá)水稻植株對(duì)97-27-2的抗性與轉(zhuǎn)pCADS1341空載體的對(duì)照植株相比，有不同程度的提高(表2)。其中，葉瘟分級(jí)參照國(guó)際水稻研究所(international rice research institute，IRRI)制定的標(biāo)準(zhǔn)。R1-R4視為抗病，S5-S6視為感病，從R1到S6抗性依次減弱。
選取12株T0代過量表達(dá)植株進(jìn)行了RT-PCR分析，其中8株OsBRR1的表達(dá)量有不同程度的提高，對(duì)這8株水稻的97-27-2抗性分析結(jié)果表明OsBRR1基因表達(dá)量的提高和水稻對(duì)97-27-2抗性的增強(qiáng)呈正相關(guān)性(圖4)。其中，RT-PCR所用引物與1號(hào)OsBRR1-RNAi水稻的T1代植株的RT-PCR檢測(cè)相同。圖4中，CK為轉(zhuǎn)pCUbi1390空載體的對(duì)照植株，1-8為T0代OsBRR1過量表達(dá)植株。
表2 T0代OsBRR1過量表達(dá)植株對(duì)稻瘟菌97-27-2的抗性分析

上述RNAi和過量表達(dá)結(jié)果的分析表明，OsBRR1基因的表達(dá)量和水稻的稻瘟病抗性水平密切相關(guān)。
序列表<160>3<210>1<211>3006<212>DNA<213>稻屬水稻(Oryza sativa L.)<400>1atggccgccg ccgccgccac ctccaccctt ctcctcctcc tcctcctcct cctcctcgcc 60accgccaccc atggcgccgc ggccgacaca gtctcgtccc ccgcctcccc tgaagcggcc 120gcactcctca acctctccgc cgcgctcggt gatccctcgg gctacctctc cacgcactgg 180acgcacgaca ccgcgttctg ctcgtggccg cgcctctcct gcgacgccga cggctcccgc 240gtcctctcgc tcgacctctc cggcctcaac ctctccggcc cgatccccgc cgcggcgctc 300tcctccctct cgcacctcca gtcactcaac ctctccaaca acatcctcaa ctccaccttc 360ccggagggcc tcatcgccag cctcaagaac cttcgcgttc tcgatttcta caacaacaac 420ctcaccggcg ctctcccggc cgcgctcccc aacctcacca accttgttca cctccacctc 480ggcggcaatt tcttcttcgg cagcatcccc aggtcgtacg ggcagtggag ccggatcaag 540tacctggctc tctccggcaa tgagctcacc ggggagatac cgccggagct cggcaacctg 600acgacgctca gggaactgta cctcggctac ttcaacagct tcaccggcgg gataccgccg 660gagctcggga ggctgaagga gctcgtgcgg ctcgacatgg cgaactgcgg gatctccggt 720gtggtcccgc cggaggtggc gaacctgacg tcgctcgaca ctctgtttct tcagatcaac 780gctctctccg ggcggctgcc gccggagatt ggcgcaatgg gggcgctgaa atcgctcgac 840ctgtcgaaca acctgttcgt cggggagatc cccgcgagct tcgcgtcgct caagaacctg 900acgctgctga acctcttccg gaatcgcctc gccggcgaga ttcccgagtt tgtcggcgac 960ctgccgaacc tcgaggtgct gcagctgtgg gagaacaact tcaccggtgg agtgccggct1020cagctcggcg tggcagccac caggctgagg atcgtcgatg tgagcacgaa caggctaacc1080ggcgttctac caacagagct ctgcgccggc aagcggctgg agacgttcat tgcgctgggg1140aactcactgt tcggcagcat tcccgacggg ctcgccgggt gcccgtcgtt gacgaggctt1200cgtcttggag agaattatct gaacgggacg ataccggcga agatgtttac attgcagaac1260
ctgacgcaga tcgagctgca cgataatttg ctctccggcg agctccggct ggacgccggc1320gtggtgtcac catcaatagg agagctgagc ttgtataaca atcggttgtc cggtccggtg1380ccggtgggga tcggtggtct cgtcgggctg cagaagttgc tggtcgccgg gaaccggttg1440tccggcgaac tccctcgtga gattgggaag ctgcaacagc tttcaaaggc ggacttatct1500gggaacctga tctccgggga gatacctccg gcgatcgccg gatgccggct gctcaccttc1560ctcgacctct ctggcaacag gctctccggc agaatcccgc cggcgctcgc cgggctacga1620atcctcaact atctcaatct gtcccacaac gcgctcgacg gggagattcc acctgctatc1680gccggaatgc agagcctaac agccgtcgac ttctccgaca acaatctctc cggcgaggtc1740ccggcgaccg gccagttcgc ctacttcaac gccacgtcgt tcgccggtaa cccaggcctc1800tgcggcgcct tcctctcccc gtgccgctcc cacggcgtcg ccacgacgtc gaccttcggc1860tccctctcgt cggcgtcgaa gctgctcctc gtgctcggcc tcctcgcgct gtccatcgtg1920ttcgccggcg cggcggtgct gaaggcgcgg tcgctgaagc ggtccgccga ggcgcgcgcg1980tggcggctca cggcgttcca gcgcctcgac ttcgccgtgg acgacgtgct ggactgcctc2040aaggaggaga acgtgatcgg caagggcggg tcagggatcg tgtacaaggg cgcgatgccc2100ggcggcgcgg tggtggccgt gaagcggctc ccggccatgg ggcgctccgg cgcggcgcac2160gacgactacg gcttctcggc ggagatacag acgctggggc gcatccggca ccgacacatc2220gtgcgcctgc tcgggttcgc cgccaaccgg gagacgaacc tgctggtgta cgagtacatg2280ccgaacggca gcctcggcga ggtgctccac ggcaagaagg gcggccacct gcagtgggcg2340acgcggtaca agatcgccgt ggaggccgcc aagggcctct gctacctgca ccacgactgc2400tcgccgccga tcctgcaccg cgacgtcaag tccaacaaca tcctcctcga cgccgagttc2460gaggcgcacg tcgccgactt cggcctcgcc aagttcctcc gcggcaatgc cggtggctcc2520gagtgcatgt ccgcgatcgc cggctcctac ggctacattg ctcccgagta cgcctacacg2580ctcaaggtgg acgagaagag cgacgtgtac agcttcgggg tagtgctact ggagctcatc2640gctgggcgga agccggtggg agagttcggc gacggcgtgg acatcgtgca ctgggtgcgg2700atggtgaccg ggtcgagcaa ggagggcgtc acgaagatcg ccgacccacg gctctcgacg2760gtgcccctcc acgagctgac gcacgtcttc tacgtcgcca tgctgtgcgt cgccgagcag2820agcgtcgagc ggccgacgat gcgggaggtc gtgcagatct tgaccgacct gcccggtacg2880gcggcggcga cggccatgga cgcgccgtcg cacgggtcgg ggaaagagca agaccggagc2940gcggagatgc agcagcagga cgggtcacgc gagtccccgc cacagcagga tctccttagc3000atctag 3006
<210>2<211>3420<212>DNA<213>稻屬水稻(Oryza sativa L.)<400>2atggccgccg ccgccgccac ctccaccctt ctcctcctcc tcctcctcct cctcctcgcc 60accgccaccc atggcgccgc ggccgacaca gtctcgtccc ccgcctcccc tgaagcggcc 120gcactcctca acctctccgc cgcgctcggt gatccctcgg gctacctctc cacgcactgg 180acgcacgaca ccgcgttctg ctcgtggccg cgcctctcct gcgacgccga cggctcccgc 240gtcctctcgc tcgacctctc cggcctcaac ctctccggcc cgatccccgc cgcggcgctc 300tcctccctct cgcacctcca gtcactcaac ctctccaaca acatcctcaa ctccaccttc 360ccggagggcc tcatcgccag cctcaagaac cttcgcgttc tcgatttcta caacaacaac 420ctcaccggcg ctctcccggc cgcgctcccc aacctcacca accttgttca cctccacctc 480ggcggcaatt tcttcttcgg cagcatcccc aggtcgtacg ggcagtggag ccggatcaag 540tacctggctc tctccggcaa tgagctcacc ggggagatac cgccggagct cggcaacctg 600acgacgctca gggaactgta cctcggctac ttcaacagct tcaccggcgg gataccgccg 660gagctcggga ggctgaagga gctcgtgcgg ctcgacatgg cgaactgcgg gatctccggt 720gtggtcccgc cggaggtggc gaacctgacg tcgctcgaca ctctgtttct tcagatcaac 780gctctctccg ggcggctgcc gccggagatt ggcgcaatgg gggcgctgaa atcgctcgac 840ctgtcgaaca acctgttcgt cggggagatc cccgcgagct tcgcgtcgct caagaacctg 900acgctgctga acctcttccg gaatcgcctc gccggcgaga ttcccgagtt tgtcggcgac 960ctgccgaacc tcgaggtgct gcagctgtgg gagaacaact tcaccggtgg agtgccggct1020cagctcggcg tggcagccac caggctgagg atcgtcgatg tgagcacgaa caggctaacc1080ggcgttctac caacagagct ctgcgccggc aagcggctgg agacgttcat tgcgctgggg1140aactcactgt tcggcagcat tcccgacggg ctcgccgggt gcccgtcgtt gacgaggctt1200cgtcttggag agaattatct gaacgggacg ataccggcga agatgtttac attgcagaac1260ctgacgcaga tcgagctgca cgataatttg ctctccggcg agctccggct ggacgccggc1320gtggtgtcac catcaatagg agagctgagc ttgtataaca atcggttgtc cggtccggtg1380ccggtgggga tcggtggtct cgtcgggctg cagaagttgc tggtcgccgg gaaccggttg1440tccggcgaac tccctcgtga gattgggaag ctgcaacagc tttcaaaggc ggacttatct1500
gggaacctga tctccgggga gatacctccg gcgatcgccg gatgccggct gctcaccttc1560ctcgacctct ctggcaacag gctctccggc agaatcccgc cggcgctcgc cgggctacga1620atcctcaact atctcaatct gtcccacaac gcgctcgacg gggagattcc acctgctatc1680gccggaatgc agagcctaac agccgtcgac ttctccgaca acaatctctc cggcgaggtc1740ccggcgaccg gccagttcgc ctacttcaac gccacgtcgt tcgccggtaa cccaggcctc1800tgcggcgcct tcctctcccc gtgccgctcc cacggcgtcg ccacgacgtc gaccttcggc1860tccctctcgt cggcgtcgaa gctgctcctc gtgctcggcc tcctcgcgct gtccatcgtg1920ttcgccggcg cggcggtgct gaaggcgcgg tcgctgaagc ggtccgccga ggcgcgcgcg1980tggcggctca cggcgttcca gcgcctcgac ttcgccgtgg acgacgtgct ggactgcctc2040aaggaggaga acgtgatcgg caagggcggg tcagggatcg tgtacaaggg cgcgatgccc2100ggcggcgcgg tggtggccgt gaagcggctc ccggccatgg ggcgctccgg cgcggcgcac2160gacgactacg gcttctcggc ggagatacag acgctggggc gcatccggca ccgacacatc2220gtgcgcctgc tcgggttcgc cgccaaccgg gagacgaacc tgctggtgta cgagtacatg2280ccgaacggca gcctcggcga ggtgctccac ggcaagaagg gcggccacct gcagtgggcg2340acgcggtaca agatcgccgt ggaggccgcc aagggcctct gctacctgca ccacgactgc2400tcgccgccga tcctgcaccg cgacgtcaag tccaacaaca tcctcctcga cgccgagttc2460gaggcgcacg tcgccgactt cggcctcgcc aagttcctcc gcggcaatgc cggtggctcc2520gagtgcatgt ccgcgatcgc cggctcctac ggctacattg ctcccggtat gtatgagtgt2580accccctctg ccccctacaa attttcagct cattctgttg actgtacccg gttgctacta2640gtactactat ccaccatcat ttccagtgtt gaaaaaatca tgcatcacaa agtgcagaaa2700aggcccaaaa ttgctagtac tagtcctgtc ctgctcatgg caaatgttac aatggggcct2760tcatattttt caaactcact atcacattga aatttggaag aaaatggttg gttttggtat2820gctctgattt gttttttact gtgcccccac actatcgagt tgtacatatg ctggatgttg2880tgcctctcgt cactttgtcg ttttaatgaa tcatcattgg gaattgatgg cctgcgatct2940tatgtggtct gagctgtgtg tttgccctgt gcatccgcag agtacgccta cacgctcaag3000gtggacgaga agagcgacgt gtacagcttc ggggtagtgc tactggagct catcgctggg3060cggaagccgg tgggagagtt cggcgacggc gtggacatcg tgcactgggt gcggatggtg3120accgggtcga gcaaggaggg cgtcacgaag atcgccgacc cacggctctc gacggtgccc3180ctccacgagc tgacgcacgt cttctacgtc gccatgctgt gcgtcgccga gcagagcgtc3240gagcggccga cgatgcggga ggtcgtgcag atcttgaccg acctgcccgg tacggcggcg3300gcgacggcca tggacgcgcc gtcgcacggg tcggggaaag agcaagaccg gagcgcggag3360
atgcagcagc aggacgggtc acgcgagtcc ccgccacagc aggatctcct tagcatctag3420<210>3<211>1001<212>PRT<213>稻屬水稻(Oryza sativa L.)<400>3Met Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ser Thr Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Ala Thr Ala Thr His Gly Ala Ala Ala Asp Thr Val Ser20 25 30Ser Pro Ala Ser Pro Glu Ala Ala Ala Leu Leu Asn Leu Ser Ala Ala35 40 45Leu Gly Asp Pro Ser Gly Tyr Leu Ser Thr His Trp Thr His Asp Thr50 55 60Ala Phe Cys Ser Trp Pro Arg Leu Ser Cys Asp Ala Asp Gly Ser Arg65 70 75 80Val Leu Ser Leu Asp Leu Ser Gly Leu Asn Leu Ser Gly Pro Ile Pro85 90 95Ala Ala Ala Leu Ser Ser Leu Ser His Leu Gln Ser Leu Asn Leu Ser100 105 110Asn Asn Ile Leu Asn Ser Thr Phe Pro Glu Gly Leu Ile Ala Ser Leu115 120 125Lys Asn Leu Arg Val Leu Asp Phe Tyr Asn Asn Asn Leu Thr Gly Ala130 135 140Leu Pro Ala Ala Leu Pro Asn Leu Thr Asn Leu Val His Leu His Leu145 150 155 160Gly Gly Asn Phe Phe Phe Gly Ser Ile Pro Arg Ser Tyr Gly Gln Trp165 170 175Ser Arg Ile Lys Tyr Leu Ala Leu Ser Gly Asn Glu Leu Thr Gly Glu
180 185 190Ile Pro Pro Glu Leu Gly Asn Leu Thr Thr Leu Arg Glu Leu Tyr Leu195 200 205Gly Tyr Phe Asn Ser Phe Thr Gly Gly Ile Pro Pro Glu Leu Gly Arg210 215 220Leu Lys Glu Leu Val Arg Leu Asp Met Ala Asn Cys Gly Ile Ser Gly225 230 235 240Val Val Pro Pro Glu Val Ala Asn Leu Thr Ser Leu Asp Thr Leu Phe245 250 255Leu Gln Ile Asn Ala Leu Ser Gly Arg Leu Pro Pro Glu Ile Gly Ala260 265 270Met Gly Ala Leu Lys Ser Leu Asp Leu Ser Asn Asn Leu Phe Val Gly275 280 285Glu Ile Pro Ala Ser Phe Ala Ser Leu Lys Asn Leu Thr Leu Leu Asn290 295 300Leu Phe Arg Asn Arg Leu Ala Gly Glu Ile Pro Glu Phe Val Gly Asp305 310 315 320Leu Pro Asn Leu Glu Val Leu Gln Leu Trp Glu Asn Asn Phe Thr Gly325 330 335Gly Val Pro Ala Gln Leu Gly Val Ala Ala Thr Arg Leu Arg Ile Val340 345 350Asp Val Ser Thr Asn Arg Leu Thr Gly Val Leu Pro Thr Glu Leu Cys355 360 365Ala Gly Lys Arg Leu Glu Thr Phe Ile Ala Leu Gly Asn Ser Leu Phe370 375 380Gly Ser Ile Pro Asp Gly Leu Ala Gly Cys Pro Ser Leu Thr Arg Leu385 390 395 400Arg Leu Gly Glu Asn Tyr Leu Asn Gly Thr Ile Pro Ala Lys Met Phe405 410 415Thr Leu Gln Asn Leu Thr Gln Ile Glu Leu His Asp Asn Leu Leu Ser420 425430
Gly Glu Leu Arg Leu Asp Ala Gly Val Val Ser Pro Ser Ile Gly Glu435 440 445Leu Ser Leu Tyr Asn Asn Arg Leu Ser Gly Pro Val Pro Val Gly Ile450 455 460Gly Gly Leu Val Gly Leu Gln Lys Leu Leu Val Ala Gly Asn Arg Leu465 470 475 480Ser Gly Glu Leu Pro Arg Glu Ile Gly Lys Leu Gln Gln Leu Ser Lys485 490 495Ala Asp Leu Ser Gly Asn Leu Ile Ser Gly Glu Ile Pro Pro Ala Ile500 505 510Ala Gly Cys Arg Leu Leu Thr Phe Leu Asp Leu Ser Gly Asn Arg Leu515 520 525Ser Gly Arg Ile Pro Pro Ala Leu Ala Gly Leu Arg Ile Leu Asn Tyr530 535 540Leu Asn Leu Ser His Asn Ala Leu Asp Gly Glu Ile Pro Pro Ala Ile545 550 555 560Ala Gly Met Gln Ser Leu Thr Ala Val Asp Phe Ser Asp Asn Asn Leu565 570 575Ser Gly Glu Val Pro Ala Thr Gly Gln Phe Ala Tyr Phe Asn Ala Thr580 585 590Ser Phe Ala Gly Asn Pro Gly Leu Cys Gly Ala Phe Leu Ser Pro Cys595 600 605Arg Ser His Gly Val Ala Thr Thr Ser Thr Phe Gly Ser Leu Ser Ser610 615 620Ala Ser Lys Leu Leu Leu Val Leu Gly Leu Leu Ala Leu Ser Ile Val625 630 635 640Phe Ala Gly Ala Ala Val Leu Lys Ala Arg Ser Leu Lys Arg Ser Ala645 650 655Glu Ala Arg Ala Trp Arg Leu Thr Ala Phe Gln Arg Leu Asp Phe Ala660 665 670Val Asp Asp Val Leu Asp Cys Leu Lys Glu Glu Asn Val Ile Gly Lys
675 680 685Gly Gly Ser Gly Ile Val Tyr Lys Gly Ala Met Pro Gly Gly Ala Val690 695 700Val Ala Val Lys Arg Leu Pro Ala Met Gly Arg Ser Gly Ala Ala His705 710 715 720Asp Asp Tyr Gly Phe Ser Ala Glu Ile Gln Thr Leu Gly Arg Ile Arg725 730 735His Arg His Ile Val Arg Leu Leu Gly Phe Ala Ala Asn Arg Glu Thr740 745 750Asn Leu Leu Val Tyr Glu Tyr Met Pro Asn Gly Ser Leu Gly Glu Val755 760 765Leu His Gly Lys Lys Gly Gly His Leu Gln Trp Ala Thr Arg Tyr Lys770 775 780Ile Ala Val Glu Ala Ala Lys Gly Leu Cys Tyr Leu His His Asp Cys785 790 795 800Ser Pro Pro Ile Leu His Arg Asp Val Lys Ser Asn Asn Ile Leu Leu805 810 815Asp Ala Glu Phe Glu Ala His Val Ala Asp Phe Gly Leu Ala Lys Phe820 825 830Leu Arg Gly Asn Ala Gly Gly Ser Glu Cys Met Ser Ala Ile Ala Gly835 840 845Ser Tyr Gly Tyr Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Thr Leu Lys Val Asp850 855 860Glu Lys Ser Asp Val Tyr Ser Phe Gly Val Val Leu Leu Glu Leu Ile865 870 875 880Ala Gly Arg Lys Pro Val Gly Glu Phe Gly Asp Gly Val Asp Ile Val885 890 895His Trp Val Arg Met Val Thr Gly Ser Ser Lys Glu Gly Val Thr Lys900 905 910Ile Ala Asp Pro Arg Leu Ser Thr Val Pro Leu His Glu Leu Thr His915 920 925
Val Phe Tyr Val Ala Met Leu Cys Val Ala Glu Gln Ser Val Glu Arg930 935 940Pro Thr Met Arg Glu Val Val Gln Ile Leu Thr Asp Leu Pro Gly Thr945 950 955 960Ala Ala Ala Thr Ala Met Asp Ala Pro Ser His Gly Ser Gly Lys Glu965 970 975Gln Asp Arg Ser Ala Glu Met Gln Gln Gln Asp Gly Ser Arg Glu Ser980 985 990Pro Pro Gln Gln Asp Leu Leu Ser Ile995 1000
權(quán)利要求
1.稻瘟病抗性相關(guān)蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №3；2)將序列表中SEQ ID №3的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與稻瘟病抗性相關(guān)的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述稻瘟病抗性相關(guān)蛋白具有序列表中序列3的氨基酸殘基序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述序列表中的序列3中，自氨基端第316位至579位氨基酸殘基為富含亮氨酸重復(fù)的結(jié)構(gòu)域，自氨基端第678位至957位氨基酸殘基為蛋白激酶結(jié)構(gòu)域。
4.權(quán)利要求1、2或3所述稻瘟病抗性相關(guān)蛋白的編碼基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于所述稻瘟病抗性相關(guān)蛋白的cDNA基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №3蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于所述稻瘟病抗性相關(guān)蛋白的基因組基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №3蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
7.含有權(quán)利要求4、5或6所述稻瘟病抗性相關(guān)蛋白編碼基因的表達(dá)載體，細(xì)胞系和宿主菌。
8.擴(kuò)增權(quán)利要求4、5或6所述稻瘟病抗性相關(guān)蛋白編碼基因中任一片段的引物。
9.一種增強(qiáng)水稻稻瘟病抗性的方法，是將權(quán)利要求4、5或6所述稻瘟病抗性相關(guān)蛋白編碼基因?qū)胨?，篩選得到過量表達(dá)所述稻瘟病抗性相關(guān)蛋白的水稻植株即為稻瘟病抗性增強(qiáng)的植株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種稻瘟病抗性相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的稻瘟病抗性相關(guān)蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №3；2)將序列表中SEQ ID №3的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與稻瘟病抗性相關(guān)的蛋白質(zhì)。將該稻瘟病抗性相關(guān)蛋白編碼基因?qū)胨?，篩選得到過量表達(dá)所述稻瘟病抗性相關(guān)蛋白的水稻植株，即可得到稻瘟病抗性增強(qiáng)的植株。本發(fā)明的稻瘟病抗性相關(guān)蛋白將其編碼基因在水稻抗稻瘟病育種工作中具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/29GK1854154SQ20051006811
公開日2006年11月1日 申請(qǐng)日期2005年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月26日
發(fā)明者路鐵剛, 彭昊, 翟英, 張芊, 孫學(xué)輝, 吳金霞 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所