專利名稱：棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因。
背景技術(shù)：
細(xì)胞壁是高等植物細(xì)胞的重要組成部分。細(xì)胞壁不僅為細(xì)胞提供了機(jī)械支持，而且還參與了一系列的代謝過(guò)程，例如細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、細(xì)胞識(shí)別與信號(hào)傳遞等。
植物細(xì)胞壁主要是由多糖和蛋白質(zhì)等分子組成。多糖主要包括纖維素、交聯(lián)葡聚糖(也稱為半纖維素)和果膠類物質(zhì)，蛋白質(zhì)包括各類結(jié)構(gòu)蛋白、酶類和凝集素等。構(gòu)成多糖的常見(jiàn)單糖包括葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、甘露糖、芹菜糖、半乳糖醛酸和葡糖醛酸等。
可以按照細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的特點(diǎn)，將高等植物的細(xì)胞壁分為初生壁和次生壁。初生壁是在細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)期所形成的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，而次生壁則是在細(xì)胞停止生長(zhǎng)以后沉積在初生壁里面的結(jié)構(gòu)物質(zhì)。
纖維素是植物細(xì)胞壁的主要骨架成分，而交聯(lián)葡聚糖可以交聯(lián)纖維素骨架。纖維素以微纖絲(microfibril)的形式存在，是由幾十個(gè)β-D-葡聚糖鏈沿其長(zhǎng)度方向相互以氫鍵結(jié)合的擬晶體。交聯(lián)葡聚糖(cross-linkingglucan)是一類能夠以氫鍵與纖維素微纖絲交聯(lián)的生物大分子，它們交聯(lián)在纖維素微纖絲的表面與纖維素微纖絲一起形成交聯(lián)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。顯花植物所有初生細(xì)胞壁的兩種主要交聯(lián)葡聚糖是木葡聚糖(xyloglucan，XyG)和葡糖醛阿拉伯木聚糖(glucuronoarabinoxylan，GAX)。XyG交聯(lián)所有的雙子葉植物和約一半的單子葉植物的細(xì)胞壁，但在鳳梨、棕櫚、莎草以及禾草的單子葉植物的細(xì)胞壁中，主要交聯(lián)葡聚糖為GAX。XyG由許多α-D-木糖單位有規(guī)律地連接在直鏈的β-D-葡聚糖中的葡萄糖單位的O-6位置上而構(gòu)成。因物種不同，側(cè)鏈的種類也有所變化。在雙子葉的被子植物中，木葡聚糖是次生壁交聯(lián)葡聚糖(半纖維素)的主要成份，在木材組織中占干重的20％-30％[Aspinall，1980，in The Biochemistry of Plants，(Preiss，J.，ed.)，Academic Press，New York，Vol3，pp.473-499]。木聚糖分子骨架是β-(1→4)連接的木糖殘基，約10％的木糖側(cè)鏈有α-(1→2)連接的4-O-甲基葡糖醛酸殘基(Timell，1964，Ada.Carbohydr.Chem.19，247-302)。這些側(cè)鏈明顯是沿著木聚糖主鏈隨機(jī)分布的(Northcote，1969，Essays Biochem.5，90-137)。此外，約有50％的木糖在C-3或C-2位置被乙酰化。偶然的阿拉伯側(cè)鏈也可能存在(Aspinall，1980，in The Biochemistry of Plants，(Preiss，J.，ed.)，Academic Press，New York，Vol.3，pp.473-499，)。因此，葡糖醛酸是葡糖醛木聚糖的重要組成部分。
在玉米中，Kauss(1967，Biochem.Biophys.Acta 184572-574)和Villemez等(1968，Nature，218878-880)發(fā)現(xiàn)應(yīng)用核苷二磷酸葡糖醛酸(UDP-Glucuronic acid)作為供體，能夠使葡糖醛酸整合于多糖或交聯(lián)葡聚糖(半纖維素)，發(fā)現(xiàn)了葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的活性。Waldron和Brett(1983，Biochem.J.213115-122)以雙子葉植物豌豆(Pisum sativum)幼苗的上胚軸為材料，以核苷二磷酸葡糖醛酸為供體，首次證明葡糖醛酸整合于葡糖醛木聚糖的生物合成，葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(Glucuronyltransferase，GlcAT)將葡糖醛酸轉(zhuǎn)移到木葡聚糖的側(cè)鏈上。Baydoun等(1989，Biochem.J.，257853-855)又以豌豆(Pisum sativum)幼苗的上胚軸為材料，研究木糖轉(zhuǎn)移酶(xylosyltransferase，XylT)和葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶對(duì)葡糖醛木聚糖生物合成的協(xié)同作用，結(jié)果表明葡糖醛酸側(cè)鏈的添加，伴隨著木聚糖主鏈的合成的同時(shí)發(fā)生，而不是在木聚糖主鏈全部合成后再添加。Waldron等(1989，Biochem.J.，264643-649)進(jìn)一步研究了葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶可以溶解在非離子變性劑Triton X-100中，在葡糖醛木聚糖生物合成中最適的Mn2+離子濃度相對(duì)于其它可溶性酶較低。
Hobbs等(1991，Biochem.J.，277653-658)以豌豆為材料，研究了在葡糖醛木聚糖生物合成中葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞分布，結(jié)果主要在高爾基體中檢測(cè)到葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶活性，表明葡糖醛木聚糖的生物合成發(fā)生在高爾基體特定的內(nèi)胞漿網(wǎng)槽(specific cisternae)內(nèi)。Waldron和Brett(1984，Biochem.Soc.Trans.121189-1190)再以豌豆(Pisum sativum)幼苗的上胚軸為材料，研究了葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶活性在組織發(fā)育過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶活性隨著上胚軸伸長(zhǎng)而逐漸上升，在上胚軸伸長(zhǎng)快速下降后立即達(dá)到最大，以后再逐漸下降，據(jù)此認(rèn)為在初生壁也存在一些葡糖醛木聚糖的合成，但葡糖醛木聚糖的生物合成主要發(fā)生在次生壁。
以上研究都是用同位素標(biāo)記核苷二磷酸葡糖醛酸，研究葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶在葡糖醛木聚糖的生物合成的活性，但由于受到葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶制備、純度以及活性的限制，到目前還沒(méi)有用制備純化的葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶，測(cè)定出氨基酸序列的報(bào)道。因此，本發(fā)明克隆的棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因(以下簡(jiǎn)稱為GhGlcAT1)，對(duì)深入研究該酶在葡糖醛木聚糖的生物合成中的功能、與木糖轉(zhuǎn)移酶的協(xié)同作用以及在植物細(xì)胞壁組分改良的基因工程中的應(yīng)用將具有重要意義。
棉花是雙子葉植物。棉纖維是一種優(yōu)良的天然纖維，重要的紡織工業(yè)原料。棉纖維是由胚珠外珠被表皮細(xì)胞在受精前后經(jīng)分化突起、伸長(zhǎng)和次生壁增厚脫水而形成(Ryser，1999，Cotton fiber initiation andhistodifferentiation.In Cotton FibersDeveloping Biology，QualityImprovement，and Textile Processing.Basra Ed.，New York Food ProductsPress.1999，pp1-45)。棉纖維的外形呈柱狀，頂端變尖，細(xì)胞伸長(zhǎng)速度快，其生長(zhǎng)機(jī)制屬于擴(kuò)散生長(zhǎng)，不同于花粉管、根毛等細(xì)胞的頂端生長(zhǎng)(Tiwari和Wilkins，1995，Canadian Joumal of Botany 73746-757)。纖維細(xì)胞初生壁具有典型的雙子葉植物細(xì)胞壁的組成成分，但次生壁增厚期沉淀的物質(zhì)幾乎全是纖維素(Meinert和Delmer，1977，Plant Physiology 591088-1097)。目前棉纖維細(xì)胞纖維素的生物合成研究取得了顯著進(jìn)展(武耀廷等，2003，棉花學(xué)報(bào))，但與纖維素交聯(lián)的交聯(lián)葡聚糖(半纖維素多糖)的研究報(bào)道很少，棉花葡糖醛木聚糖的生物合成的研究則未見(jiàn)報(bào)道。因此，本發(fā)明的棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因不僅在理論上有助于闡明葡糖醛木聚糖的生物合成機(jī)制，而且在應(yīng)用上可直接用于棉花纖維品質(zhì)改良的分子工程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及表達(dá)方法。
本發(fā)明一方面提供了一種核酸分子，該核酸分子與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列具有80％以上的序列相似性并編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該核酸分子與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列具有90％以上的序列相似性。
本發(fā)明另一方面提供了一種表達(dá)載體，包含所述的核酸分子，以及必要的基因調(diào)控元件。
本發(fā)明還提供了經(jīng)所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)而獲得的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的細(xì)胞為畢赤酵母細(xì)胞。
本發(fā)明另一方面提供了一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列具有80％以上的序列相似性并具有基本相同的功能。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該蛋白質(zhì)與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列具有90％以上的序列相似性并具有基本相同的功能。
發(fā)明人通過(guò)試驗(yàn)證明，葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因在棉纖維的生長(zhǎng)過(guò)程中具有重要作用，在通過(guò)基因工程改善棉纖維質(zhì)量方面具有良好的應(yīng)用前景。
利用可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明所提供的編碼棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的基因GhGlcAT1導(dǎo)入植物細(xì)胞，可獲得植物細(xì)胞壁組分改變的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種組成性啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植株進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所使用的載體進(jìn)行加工，如加入植物可選擇性標(biāo)記或具有抗性的抗生素標(biāo)記物。攜帶有本發(fā)明棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因GhGlcAT1的表達(dá)載體可通過(guò)常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞或植物器官，被轉(zhuǎn)化的植物既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物。本發(fā)明基因可應(yīng)用于植物細(xì)胞壁基因工程，特別是木本植物細(xì)胞壁組分改良的基因工程育種，尤其是棉花纖維品質(zhì)改良的基因工程育種。本發(fā)明基因的發(fā)現(xiàn)不僅對(duì)木本植物木材成分改良、特別是棉花纖維品質(zhì)改良具有重要意義，而且為進(jìn)一步闡明葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶在交聯(lián)葡聚糖生物合成中的分子機(jī)制提供了新方法。


附圖不一定是成比例的，其目的僅僅在于更好地解釋本發(fā)明，以便于讀者理解。將附圖與具體實(shí)施方式
結(jié)合在一起考慮，可以更好地理解本發(fā)明。
圖1示出了GhGlcAT1蛋白的cDNA編碼序列和氨基酸序列。
圖2示出了GhGlcAT1蛋白與已報(bào)道的其他物種中的葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的多序列比對(duì)圖。
圖3示出了GhGlcAT1蛋白與人、小鼠、老鼠、中國(guó)倉(cāng)鼠、果蠅、線蟲(chóng)、擬南芥葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。
圖4A和圖4B示出了GhGlcAT1蛋白三維結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)同源建模(A，已知人的葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶分子的三維結(jié)構(gòu)；B，GhGlcAT1分子的三維結(jié)構(gòu)圖)。
圖5示出了GhGlcAT1基因的Southern雜交圖，顯示GhGlcAT1基因在棉花基因組中的拷貝數(shù)。
圖6示出了GhGlcAT1基因的Northern雜交圖，顯示GhGlcAT1表達(dá)的組織分布與棉纖維發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)特征。
圖7示出了本發(fā)明的棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)策略。
圖8示出了本發(fā)明的棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)。圖中，M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為誘導(dǎo)之前，泳道2-6依次為甲醇誘導(dǎo)6，12，24，30，36小時(shí)。
具體實(shí)施例方式
為了更加詳細(xì)地解釋本發(fā)明，下面將結(jié)合附圖給出本發(fā)明的具體實(shí)施例。這些實(shí)施例僅僅是出于解釋和說(shuō)明的目的，不應(yīng)該被理解為是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。在對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行描述時(shí)，沒(méi)有對(duì)公知的實(shí)驗(yàn)方法、儀器、試劑和材料等進(jìn)行詳細(xì)的描述，以避免喧賓奪主、淡化了本發(fā)明的主要內(nèi)容。
實(shí)施例1 GhGlcAT1的克隆及編碼的氨基酸序列結(jié)構(gòu)特征以陸地棉(Gossypium hirsutum)棉花品種中棉所12開(kāi)花后10天的纖維與種子的總RNA為材料進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄熒光差異顯示?？俁NA的提取是按照文獻(xiàn)中報(bào)道的方法(Wan和Wilkins，1994，Analytical Biochemistry，2237-12)，并作適當(dāng)修改(Zhao，et al.，2001，Biosci Biotech Bioch652789-2793)。熒光差異顯示(FDD)分離克隆了幾個(gè)纖維細(xì)胞特異或優(yōu)勢(shì)表達(dá)的cDNA片段，并用Northern點(diǎn)雜交初步分析它們?cè)诿藁ú煌M織的分布規(guī)律和在纖維發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)特征。其中的一個(gè)cDNA片段所推斷編碼的氨基酸序列與SWISSPROT庫(kù)中的已知蛋白進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)該基因片段編碼的氨基酸序列與動(dòng)物葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因編碼的氨基酸序列同源性較高，初步認(rèn)為是植物的葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因。
為了克隆棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的全長(zhǎng)cDNA序列，本發(fā)明人采用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)克隆了棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的5’端和3’端的部分序列，進(jìn)而獲得了該基因的全長(zhǎng)cDNA序列。具體實(shí)施步驟如下先用Promega公司PolyATtract System 1000從發(fā)育10天纖維的總RNA中分離mRNA，再根據(jù)Clontech公司Marathon cDNA試劑盒的操作程序，以棉花纖維mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，然后以第一鏈cDNA為模板合成第二鏈，再將雙鏈cDNA兩端連上接頭，構(gòu)建成兩端帶有接頭的棉花纖維cDNA文庫(kù)。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室所發(fā)現(xiàn)的部分序列，設(shè)計(jì)5’RACE和3’RACE的基因特異引物(5’RACE和3’RACE的基因特異引物序列見(jiàn)圖1的斜體下劃線部分)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成功地克隆出該基因的5’端和3’端部分序列，拼接出一條棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因的全長(zhǎng)cDNA序列，即序列表中的SEQ ID NO1，并命名為GhGlcAT1。GhGlcAT1有1400bp，包括5’端非編碼區(qū)(5’UTR)16bp，開(kāi)放閱讀框架(ORF)1107bp和3’端非編碼區(qū)(3’UTR)277bp，最后以polyA結(jié)尾。開(kāi)放閱讀框架編碼368個(gè)氨基酸殘基(序列表中的SEQ ID NO2)，即棉花的葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶，預(yù)測(cè)的分子量42.27kD，等電點(diǎn)為8.2。
圖1示出了基因與所編碼氨基酸的對(duì)應(yīng)序列。推測(cè)的第17-34位氨基酸殘基為類型II跨膜基序，定位于高爾基體，用灰色背景標(biāo)注。潛在的核糖供體結(jié)合的保守基序DLD用方框表示。此外，也標(biāo)注了5’RACE和3’RACE的基因特異引物序列。
對(duì)棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列，用ClustalX進(jìn)行同源序列比較分析。推測(cè)的棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列分別與人(Human，094766)的相同性為33％，與老鼠(Mouse，P58158)的相同性33％，與擬南芥(Arabidopsis，NP181246)的相同性74％。圖2示出了部分同源序列比較分析的結(jié)果。動(dòng)物葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的活性已經(jīng)得到了實(shí)驗(yàn)證實(shí)，而植物中葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶還未純化成功，只是根據(jù)氨基酸序列推測(cè)具有葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)特征。
在用ClustalX進(jìn)行同源序列比較分析的基礎(chǔ)上，用PHYLIP軟件的PROML和PROTPARS程序計(jì)算系統(tǒng)進(jìn)化的關(guān)系，用TreeView軟件和PHYLIP軟件的DRAWGRAM程序構(gòu)建和繪制進(jìn)化樹(shù)，如圖3所示。從人(HuGlcAT-PQ9PZW7；HuGlcAT-SQ9NPZ5；HuGlcAT-I094766)，小鼠(RnGlcAT-P035789；RnGlcAT-SQ92137)，老鼠(MmGlcAT-PQ9CW73；MmGlcAT-SP59270；MmGlcAT-IP58158)，中國(guó)倉(cāng)鼠(CgGlcAT-IQ9WU47)，果蠅(DmGlcAT097422)，線蟲(chóng)(CeGlcATQ09363)，擬南芥(AtGlcAT-L1NP181246；AtGlcAT-L2NP564290；AtGlcAT-L3NP201524；AtGlcAT-L4NP195407)，和棉花(GhGlcAT1)的進(jìn)化樹(shù)上可以看出，哺乳動(dòng)物、果蠅、線蟲(chóng)分為一類，植物分為一類。哺乳動(dòng)物、果蠅和線蟲(chóng)葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶進(jìn)一步分為3個(gè)亞組，這一分類結(jié)果是與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合的，已經(jīng)證明它們雖然都是葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶，所用的供體底物也都是核苷二磷酸葡糖醛酸，但是HuGlcAT-P、HuGlcAT-S和HuGlcAT-I的受體和合成的物質(zhì)卻不相同。植物的葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶也分為3個(gè)亞組，也可能意味著這些葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的分布具有組織特異性，或者它們的受體不同或者在不同物質(zhì)的生物合成中進(jìn)行葡糖醛酸的轉(zhuǎn)移。
為了進(jìn)一步分析棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)特征，又進(jìn)行了計(jì)算機(jī)同源建模。同源建模在http//www.expasy.org/swissmode/SWISS-MODEL.html網(wǎng)站完成，結(jié)構(gòu)用SwissPDBviewer(htyp//www.expasy.ch/spdbv)程序和RasMol軟件觀察和保存。SWISS-MODEL依據(jù)已知的序列自動(dòng)建模。自動(dòng)建模中發(fā)現(xiàn)棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因編碼的氨基酸序列與已知結(jié)構(gòu)的人的β-1-3-葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶I的一致性(Identity)達(dá)到33.7％。因此，以人的β-1-3-葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶I的三維結(jié)構(gòu)作為同源建模的主要模板進(jìn)行計(jì)算機(jī)自動(dòng)建模，建成棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶單體的三維結(jié)構(gòu)。圖4A所示的是同源建模所用模板，即人的β-1-3-葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶I的三維結(jié)構(gòu)，已知人的β-1-3-葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶I是以同源二聚體的形式發(fā)揮生理活性的。圖4B所示的是棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶同源建模的三維結(jié)構(gòu)，顯示其主要肽鏈走向與已知人的葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基本一致，棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)上的相似性暗示出功能上的相似性。
實(shí)施例2 棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因在棉花基因組的拷貝數(shù)為了確定棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因在棉花基因組的拷貝數(shù)，本發(fā)明以克隆的棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因的cDNA為探針，對(duì)經(jīng)過(guò)不同內(nèi)切酶酶切的棉花基因組DNA進(jìn)行Southern雜交來(lái)確定拷貝數(shù)。中棉所12棉花基因組DNA提取方法按照文獻(xiàn)(Paterson等，1993，Plant Mol.Bio.Rep.，11122-127)CTAB方法進(jìn)行。將棉花基因組DNA分別用在GhGlcAT1 cDNA內(nèi)部沒(méi)有切割位點(diǎn)的四種限制性內(nèi)切酶HindIII，EcoRI、XbaI和EcoRV(這四種內(nèi)切酶依次簡(jiǎn)記為H、E、X、EV)消化，0.7％瓊脂糖凝膠電泳，堿性條件下轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(HybondTM-N+，Amersham Pharmacia Biotech)，cDNA探針的α-32P的標(biāo)記應(yīng)用隨機(jī)引物標(biāo)記盒(TaKaRa，Dalian，China)進(jìn)行標(biāo)記，雜交按照黃培堂等(2002)譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》介紹的方法進(jìn)行。
雜交結(jié)果如圖5所示，HindIII，EcoRI和XbaI內(nèi)切酶的酶解產(chǎn)物雜交后均顯示一條帶，說(shuō)明GhGlcAT1在異源四倍體AD基因組(Wendel，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 864132-4136)中是以單一拷貝形式存在。而在EcoRV酶切產(chǎn)物中出現(xiàn)了2條帶表明可能含有內(nèi)含子或異源四倍體AD基因組間的該酶切位點(diǎn)存在變異。
實(shí)施例3 GhGlcAT1 mRNA的組織分布和纖維細(xì)胞不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄特征本發(fā)明以中棉所12棉花品種為實(shí)驗(yàn)材料，分別取不同的材料提取總RNA，然后進(jìn)行Northern雜交來(lái)測(cè)定不同樣品中GhGlcAT1 mRNA的水平。纖維樣品取樣是在棉花開(kāi)花當(dāng)天對(duì)正常發(fā)育的花進(jìn)行掛牌標(biāo)記，分別選取開(kāi)花后5天、10天、15天、20天、25天、30天、35天和40天發(fā)育正常的幼鈴，將幼鈴殼剝?nèi)ズ?，立即放入液氮中速凍，?80℃保存?zhèn)溆?；花和胚珠的選取是將當(dāng)天開(kāi)花的胚珠和當(dāng)天開(kāi)的花(包括苞片、花瓣和雄蕊)取下后，放入液氮中速凍，于-80℃保存?zhèn)溆?；營(yíng)養(yǎng)組織樣品是從出苗生長(zhǎng)一周棉花幼苗，選取根、莖和子葉，放入液氮中速凍，然后于-80℃保存?zhèn)溆?。此外發(fā)育35天的種子作為種子樣品于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｉ鲜鰳悠房俁NA的提取按文獻(xiàn)中報(bào)道(Wan和Wilkins，1994，Analytical Biochemistry，2237-12)的方法進(jìn)行。
總RNA在65℃變性后，用1.2％甲醛變性瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，隨后轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(HybondTM-N+，Amersham Pharmacia Biotech)，以克隆的棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因的cDNA為探針，cDNA探針的α-32P的標(biāo)記應(yīng)用隨機(jī)引物標(biāo)記法(TaKaRa，Dalian)進(jìn)行標(biāo)記，雜交按照黃培堂等(2002)譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》介紹的方法進(jìn)行。
如圖6A所示，棉花胚珠(Ov)、花(Fl)、種子(Sd)、根(Rt)、莖(St)、子葉(Lf)、開(kāi)花后發(fā)育10天的纖維(F10)和開(kāi)花后發(fā)育25天的纖維(F25)的Northern雜交結(jié)果，表明棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)錄具有組織特異性，主要在莖和棉花纖維中表達(dá)。本發(fā)明在莖中檢測(cè)到棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)與Waldron和Brett(1983，Biochem.J.213115-122)所報(bào)道的研究結(jié)果是一致的。本發(fā)明首次在棉花纖維中發(fā)現(xiàn)了葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)。棉花生長(zhǎng)一周幼苗的莖伸長(zhǎng)很快，細(xì)胞壁需要合成大量的交聯(lián)葡聚糖，以滿足初生細(xì)胞壁形成和次生壁沉積的物質(zhì)需要。葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因在莖組織中特異性表達(dá)的發(fā)現(xiàn)，說(shuō)明葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因在植物細(xì)胞壁的形態(tài)建成中具有重要作用，該基因可以作為改良植物細(xì)胞壁組分基因工程的理想基因元件。
如圖6B所示，棉花開(kāi)花后發(fā)育5天、10天、15天、20天、25天、30天、35天和40天纖維的Northern雜交結(jié)果表明，棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)錄在纖維細(xì)胞的不同發(fā)育階段具有時(shí)間特異效應(yīng)。開(kāi)花后5天就可以檢測(cè)到棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)錄，到開(kāi)花后15天基因轉(zhuǎn)錄的水平達(dá)到最大值，隨后轉(zhuǎn)錄水平開(kāi)始下降，但在纖維發(fā)育20天和25天檢測(cè)到的轉(zhuǎn)錄水平基本不變，基本保持一個(gè)穩(wěn)定水平，到纖維發(fā)育30天檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄水平急劇下降，在纖維發(fā)育35天和40天未檢測(cè)到葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)錄特征是與棉纖維細(xì)胞發(fā)育中形態(tài)建成的特點(diǎn)是吻合的。棉纖維原始細(xì)胞的分化早在開(kāi)花前2至3天就已經(jīng)完成(Graves和Stewart，1988 Planta，175254-258)，而開(kāi)花后3天內(nèi)突起的纖維細(xì)胞才有可能發(fā)育成有紡織價(jià)值的長(zhǎng)絨。棉纖維發(fā)育過(guò)程可以分為細(xì)胞分化與伸長(zhǎng)啟動(dòng)期、細(xì)胞伸長(zhǎng)期、次生壁增厚期和脫水成熟期。一般整個(gè)初生壁形成期持續(xù)時(shí)間約20～25天，纖維細(xì)胞伸長(zhǎng)呈S型曲線，即表現(xiàn)為慢—快—慢的伸長(zhǎng)規(guī)律。在開(kāi)花后15天伸長(zhǎng)速度最快，25天左右就達(dá)到了應(yīng)有的長(zhǎng)度。開(kāi)花后約18天就開(kāi)始了次生壁的形成，直到棉鈴成熟，初生壁與次生壁形成期重疊約10天(Wilkins和Jernstedt，1999，Molecular genetics of developing cotton fibers.In Cotton FibersDeveloping Biology，Quality Improvement，and Textile Processing.BasraEd.，New York Food Products Press.1999，pp231-269)。棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)錄水平也是在細(xì)胞伸長(zhǎng)的最快時(shí)期開(kāi)花后15天達(dá)到了最大值，隨后棉纖維次生壁發(fā)生沉積，纖維素的合成占主導(dǎo)地位，交聯(lián)葡聚糖的合成相對(duì)下降而保持一定的水平，而此時(shí)棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)錄相對(duì)下降后也保持一定的水平。在棉纖維細(xì)胞伸長(zhǎng)階段，核苷糖通過(guò)不同的酶促反應(yīng)相互轉(zhuǎn)換，在糖基轉(zhuǎn)移酶的催化下，合成大量的木葡聚糖、木聚糖和果膠多糖等交聯(lián)葡聚糖，直接參與棉花纖維形態(tài)的建成。交聯(lián)葡聚糖的合成酶主要包括合成不同核苷糖的轉(zhuǎn)換酶和合成交聯(lián)葡聚糖的糖基轉(zhuǎn)移酶。棉花纖維的品質(zhì)，特別是棉纖維強(qiáng)度除了與纖維素的結(jié)晶度和排列方式相關(guān)外，還與棉花纖維中交聯(lián)葡聚糖的交聯(lián)相關(guān)(武耀廷劉進(jìn)元，2004，棉花學(xué)報(bào)16189-193)。本申請(qǐng)所發(fā)現(xiàn)的棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因，在棉花纖維發(fā)育的初生壁和次生壁沉積時(shí)期參與交聯(lián)葡聚糖的生物合成。棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因的高效表達(dá)，會(huì)加強(qiáng)棉纖維中交聯(lián)葡聚糖的交聯(lián)，會(huì)對(duì)棉花纖維品質(zhì)特別是棉纖維強(qiáng)度的提高做貢獻(xiàn)。因此該基因在棉花纖維品質(zhì)改良、特別是提高棉纖維強(qiáng)度的的基因工程上有重要應(yīng)用價(jià)值?？蔀樘岣呙蘩w維品質(zhì)(強(qiáng)度)的分子育種工程提供有用的基因元件。
實(shí)施例4棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因在畢赤酵母(Pichia pastoris)菌株 GS115中的表達(dá)1、酵母菌株及培養(yǎng)基畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC3.5K、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)菌株GS115購(gòu)自Invitrogen公司。此菌株GS115是組氨酸缺陷型，即利用表達(dá)質(zhì)粒上的HIS4基因進(jìn)行互補(bǔ)篩選轉(zhuǎn)化重組子。本研究所使用的培養(yǎng)基的組成如下。
貯藏液10X YNB(13.4％酵母氮源，含有硫酸銨，不含氨基酸)500X B(0.02％生物素)100X H(0.4％組氨酸)10X D(20％葡萄糖(Dextrose))
10X M(5％甲醇)10X GY(10％甘油)1M磷酸鉀緩沖液，pH6.0培養(yǎng)基YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)1％酵母提取物2％蛋白胨2％葡萄糖固體培養(yǎng)基含2％瓊脂。
MD(Minimal Dextrose Medium)1.34％YNB4×10-5％生物素2％葡萄糖固體培養(yǎng)基含1.5％瓊脂。
BMGY(Buffered Glycerol-complex Medium)1％酵母提取物2％蛋白胨100mM磷酸鉀，pH6.01.34％YNB4×10-5％生物素1％甘油BMMY(Buffered Methanol-complex Medium)1％酵母提取物2％蛋白胨100mM磷酸鉀，pH6.0
1.34％YNB4×10-5％生物素0.5％甲醇2、酵母表達(dá)載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母作為甲醇酵母的一種，迄今為止，已有多種外源蛋白在此體系中成功表達(dá)。作為單細(xì)胞真核生物，它既具備了原核生物生長(zhǎng)快速、培養(yǎng)基廉價(jià)和實(shí)驗(yàn)手段簡(jiǎn)單可行的特點(diǎn)，又具備典型的真核生物分子生物學(xué)特性，可對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行加工折疊和翻譯后修飾等。此外，它還克服了原核表達(dá)系統(tǒng)的一系列缺陷，如缺乏真核生物的蛋白翻譯后修飾和加工、表達(dá)產(chǎn)物多以包涵體形式存在，復(fù)性困難且效率很低、背景雜蛋白多，不易于純化等；其次，較釀酒酵母而言，其具有更強(qiáng)有力的啟動(dòng)子、分泌效率有所提高，表達(dá)質(zhì)粒更穩(wěn)定等特性，可以通過(guò)高密度發(fā)酵獲得大量產(chǎn)物，且分泌產(chǎn)物無(wú)過(guò)度糖基化，臨床應(yīng)用較安全。由于巴斯德畢赤酵母沒(méi)有穩(wěn)定的附加質(zhì)粒，所以一般用整合型質(zhì)粒作為外源基因的表達(dá)載體。典型的表達(dá)載體含有乙醇氧化酶基因5’AOX1啟動(dòng)子和3’終止子，其中含有供外源基因插入的多克隆位點(diǎn)，以組氨醇脫氫酶基因HIS4作為互補(bǔ)篩選標(biāo)志。把擴(kuò)增編碼區(qū)后將其連接到酵母表達(dá)載體pPIC3.5K(Invitrogen)上，用說(shuō)明書(shū)上的氯化鋰轉(zhuǎn)化方法先用SacI內(nèi)切酶(TaKaRa)把表達(dá)載體線性化后轉(zhuǎn)化到組氨酸缺陷型GS115菌株，這時(shí)GS115菌株的表型為His+、Mut+(Methanol utilization Plus)，用MD平板篩選和用PCR方法找到陽(yáng)性克隆，用于誘導(dǎo)表達(dá)分析。具體方法如下A.酵母表達(dá)載體的構(gòu)建用PCR從GhGlcAT-L1 cDNA上擴(kuò)增出5’端加了一個(gè)BamHI位點(diǎn)、3’端加了一個(gè)EcoRI位點(diǎn)的(GhGlcAT-L1)cDNA編碼區(qū)片段，上游引物序列為5’-CGGGATCCATGGGGTCTGCTGAGAGAACAAAGAAGG-3’，其中GGATCC為外加的BamHI識(shí)別位點(diǎn)；下游引物序列為5’-GCCTTAAGAATGTTAACTCATTAATGTAGTTTG-3’，其中CTTAAG為外加的EcoRI識(shí)別位點(diǎn)。用BamHI和EcoRI同時(shí)消化PCR產(chǎn)物和畢赤酵母表達(dá)載體pPIC3.5K(Invitrogen)，得到帶粘末端的GhGlcAT-L1片段和線性載體片段。苯酚氯仿抽提、乙醇沉淀以純化酶解后的PCR片段和載體片段。然后，利用T4 DNA連接酶進(jìn)行目的基因和載體片段的體外連接得到表達(dá)載體(pPIC3.5K/GhGlcAT-L1)如圖1所示。并通過(guò)DNA序列分析，證明插入載體的DNA序列。
B.酵母的培養(yǎng)(1).找到的陽(yáng)性克隆接種到50ml YPD培養(yǎng)液上.在30℃搖床上以200rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)到18小時(shí)，這時(shí)OD600達(dá)到＝0.83。
(2).在3000xg，離心5分鐘收集菌體，棄上清。用蒸餾水把菌體清洗后，在3000xg，離心5分鐘收集菌體。
(3).棄上清。用1ml 1mM LiCl清洗菌體。
(4).把懸浮液移到1.5ml試管中。
(5).12000xg，離心15秒，棄LiCl。
(6).用400μl，100mM LiCl重懸細(xì)胞。
(7).取50μl用于下面的轉(zhuǎn)化。
C.轉(zhuǎn)化(1).1ml，2mg/ml鮭魚(yú)精DNA(Salmon sperm DNA)在水中煮5分鐘，然后迅速在冰中冷卻。
(2).上面酵母的培養(yǎng)7中，加下列溶液到試管240μl 50％PEG(PEG-3350)36μl 1M LiCl25μl 2mg/ml鮭魚(yú)精DNA50μl質(zhì)粒DNA(5-10μg)(3).劇烈地振蕩試管1分鐘。
(4).在水浴中30℃，30分恒溫。
(5).在42℃水浴中熱激25分鐘。
(6).8000rpm離心1分鐘，把上清移掉。
(7).用1ml蒸餾水輕輕地?fù)u菌體。
(8).取100μl涂到MD平板。在30℃培養(yǎng)4天。
(9).取單克隆接種到5ml YPD培養(yǎng)液中，在30℃200rpm，培養(yǎng)16小時(shí)，取1.0μl用于PCR反應(yīng)并發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性克隆。
10×PCR緩沖液 2.0μlMgCl2(25mM) 1.2μldNTPs(2.5mM) 1.6μl5’Primer(10μM) 0.4μl3’Primer(10μM) 0.4μlTaq(5U/μl)(TaKaRa)0.1μl培養(yǎng)液 1.0μlddH2O 13.3μl總體積 20.0μl擴(kuò)增條件94℃5分鐘，1個(gè)循環(huán)；94℃30秒，60℃30秒，72℃2分鐘，30個(gè)循環(huán)；72℃7分鐘。4℃維持。
3、棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因在GS115菌株中的表達(dá)(1).得到的陽(yáng)性克隆接種到25ml BMGY培養(yǎng)液上。在30℃搖床上以200rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)到24小時(shí)，這時(shí)OD600達(dá)到＝2.3。
(2).在3000xg，離心5分鐘收集菌體。棄上清。用BMMY培養(yǎng)液100ml懸浮到OD600達(dá)到0.92。在30℃搖床上，以200rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)以誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。
(3).每24小時(shí)加100％甲醇使最終濃度達(dá)到0.5％。
(4).以下時(shí)間點(diǎn)取1ml菌體在12000xg，2分鐘離心。以確定最佳表達(dá)時(shí)間。
時(shí)間點(diǎn)0，6，12，24，30，36，48，60，72小時(shí)。
(5).棄上清后用液氮快速冷凍菌體。收集的菌體于-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 4、SDS-PAGESDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的濃縮膠濃度用4％，分離膠濃度取12.5％。蛋白樣品上樣前先加入等體積的2×SDS-PAGE樣品處理液(6％β-巰基乙醇；6％SDS；0.6％溴酚藍(lán)；20％甘油)，在沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心3分鐘后取上清液上樣15μl。用BIO-RAD(USA)的快速電泳裝置進(jìn)行電泳。采用恒壓200V，電泳45分鐘左右結(jié)束。用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。如圖8所示，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記的表達(dá)蛋白分子量約等于43kD，這與預(yù)測(cè)的分子量42.27kD相近，說(shuō)明棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因(GhGlcAT-L1)在含有0.5％甲醇的BMMY培養(yǎng)液中誘導(dǎo)30小時(shí)時(shí)開(kāi)始表達(dá)。
本文中所涉及的參考文獻(xiàn)，包括專利文件、學(xué)術(shù)論文、出版物等，均以引用的方式將其全部?jī)?nèi)容包括在本文中。
應(yīng)當(dāng)注意，本發(fā)明中所涉及的各種實(shí)驗(yàn)操作，均為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，如果在文中沒(méi)有特別說(shuō)明，則本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以參照本發(fā)明申請(qǐng)日之前的各種常用工具書(shū)、科技文獻(xiàn)或相關(guān)的說(shuō)明書(shū)、手冊(cè)等加以實(shí)施。
本文中所涉及的各種實(shí)驗(yàn)用品(包括但不限于化學(xué)試劑、生物制品、細(xì)胞、生物體、儀器等)之中，對(duì)于那些特殊的或不易獲得的，文中均已注明了制造商、參考文獻(xiàn)或詳細(xì)的制備方法；未經(jīng)特別說(shuō)明的，均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)用品，在本發(fā)明申請(qǐng)日之前，可以通過(guò)各種方式(例如購(gòu)買(mǎi)、自行制備等)很方便地獲得。
應(yīng)當(dāng)理解，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以在形式和細(xì)節(jié)上對(duì)其做出各種改變和改進(jìn)，而這些均被認(rèn)為落入了本發(fā)明的保護(hù)范圍。例如，根據(jù)密碼子簡(jiǎn)并原則或堿基互補(bǔ)原則所獲得的功能基本相同的核酸分子，以及在對(duì)蛋白質(zhì)功能不起主要作用的位點(diǎn)上進(jìn)行氨基酸替換所得到的功能基本相同的蛋白質(zhì)或多肽，均被認(rèn)為落入了本發(fā)明的保護(hù)范圍。
序列表<110>清華大學(xué)<120>棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因<160>2<210>1<211>1400<212>DNA<213>棉屬陸地棉(Gossypium hirsutum L.)<400>1CCATTTTACT CATAAGATGG GGTCTGCTGA GAGAACAAAG AAGGAAGTAC AGCTATGGAA60GAAAGCTATT GTTCACTTCT CTTTATGTTT TGTCATGGGG TTTTTCACAG GCTTTGCTCC120AACTGGTAAG GATTCCATTT TTTCTAGCCC TGCTGTTGCT ACACACAATA AATCACATAT180TTCACAACCG CCTGTGAACC AATCAGTAAC ACCAGCGGTA CATAGCAGTA ATGTTAACCA240GAGTTTGAGA GCCGAAACTC CGGTTCCAGT TCCAGTTCCG GCAAAGTCTA ATGAGCTAGA300AAGTCCGAAA CAAGTGGATG GTACTGTTGT TCATGAAGTC AAGCTGCCAT CCAGGAGACT360TGTGATTGTT GTTACACCAA CCAGCACAAA AGATCAGTTT CAAGGTGTGT TCTTGAGGAG420GCTAGCGAAT ACTATTCGGC TGGTTCCTCA ACCATTGTTG TGGATCGTCG TGGAAGGGCA480ATCGGATTCG AACGAGCTAT CCGAAATACT TAGGAAAACA GGCATTATGT ATAGGCATTT540GGTGTTCAAG GAGAATTTCA CAGATCCTGA AGCAGAGCTA AATCATCAAC GAAATGTTGC600ATTGAAGCAC GTTGAGCAAC ACAAGCTGAG TGGGATAGTT CATTTCGCTG GACTTACCAA660TGTTTACGAT CTTGATTTCT TCAAAGAACT TAGACAAATT GAGGTGTTTG GCACTTGGCC720AATGGCCCTG CTATCAGCAA ACGAGAGACG GGTTGTGATT GAAGGACCTG TTTGTGATTC780ATCACAAGTT ATAGGATGGC ACCTAAGGAA GATGAATAAC CAGACAGATG CAGAAACAGA840TGCTGATACG AAACCTCCTA TTCATATATC AAGTTTTGCA TTTAACAGCT CAATCCTTTG900GGACCCTGAG AGATGGGGAC GTCTCACATC GGTCCAAGGC ACTTCACAGA ACTCACTGAA960ATTTGTGAAA CAAATTGTAA TGGAAGATGA GGGCAAGTTA AAGGGTATCC CACCGGAAGA1020GTGCTCCAAA ATAATGCTAT GGCGTCTTCA CTTCCCGATT GGAGTTGTGC CTAGAAATCT1080TGTCAAAACA TCCTCATTGT TTGATGTAAT TACTCAATTG TAAAAAAAAA AAGAAAAAAG1140AAAAAGAGAG GAAATATATG CATCTGTTAG AGGACAAAAT CTATGTGATA CTATGAGCAT1200AATCTCAAAA TTTTCCCATT TTTCATGTAA AACAATTTTC AAGTTTATTT TGTTCTCTTT1260AATTGATGTC AACAACTTTT GGAGTGGTGA ACTATTATAA TCCCCCAACC TGTTGGAAGT1320GGTTACACCA AATTACTTGA TTAGAAAGCA ATCAAACAAT CATTGTTTTA GGAAAAAAAA1380AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA1400
<210>2<211>368<212>PRT<213>棉屬陸地棉(Gossypium hirsutum L.)<400>2Met Gly Ser Ala Glu Arg Thr Lys Lys Glu Val Gln Leu Trp Lys1 5 10 15Lys Ala Ile Val His Phe Ser Leu Cys Phe Val Met Gly Phe Phe20 25 30Thr Gly Phe Ala Pro Thr Gly Lys Asp Ser Ile Phe Ser Ser Pro35 40 45Ala Val Ala Thr His Asn Lys Ser His Ile Ser Gln Pro Pro Val50 55 60Asn Gln Ser Val Thr Pro Ala Val His Ser Ser Asn Val Asn Gln65 70 75Ser Leu Arg Ala Glu Thr Pro Val Pro Val Pro Val Pro Ala Lys80 85 90Ser Asn Glu Leu Glu Ser Pro Lys Gln Val Asp Gly Thr Val Val95 100 105His Glu Val Lys Leu Pro Ser Arg Arg Leu Val Ile Val Val Thr110 115 120Pro Thr Ser Thr Lys Asp Gln Phe Gln Gly Val Phe Leu Arg Arg125 130 135Leu Ala Asn Thr Ile Arg Leu Val Pro Gln Pro Leu Leu Trp Ile140 145 150Val Val Glu Gly Gln Ser Asp Ser Asn Glu Leu Ser Glu Ile Leu155 160 165Arg Lys Thr Gly Ile Met Tyr Arg His Leu Val Phe Lys Glu Asn170 175 180Phe Thr Asp Pro Glu Ala Glu Leu Asn His Gln Arg Asn Val Ala185 190 195Leu Lys His Val Glu Gln His Lys Leu Ser Gly Ile Val His Phe200 205 210Ala Gly Leu Thr Asn Val Tyr Asp Leu Asp Phe Phe Lys Glu Leu215 220 225Arg Gln Ile Glu Val Phe Gly Thr Trp Pro Met Ala Leu Leu Ser
230 235 240Ala Asn Glu Arg Arg Val Val Ile Glu Gly Pro Val Cys Asp Ser245 250 255Ser Gln Val Ile Gly Trp His Leu Arg Lys Met Asn Asn Gln Thr260 265 270Asp Ala Glu Thr Asp Ala Asp Thr Lys Pro Pro Ile His Ile Ser275 280 285Ser Phe Ala Phe Asn Ser Ser Ile Leu Trp Asp Pro Glu Arg Trp290 295 300Gly Arg Leu Thr Ser Val Gln Gly Thr Ser Gln Asn Ser Leu Lys305 310 315Phe Val Lys Gln Ile Val Met Glu Asp Glu Gly Lys Leu Lys Gly320 325 330Ile Pro Pro Glu Glu Cys Ser Lys Ile Met Leu Trp Arg Leu His335 340 345Phe Pro Ile Gly Val Val Pro Arg Asn Leu Val Lys Thr Ser Ser350 355 360Leu Phe Asp Val Ile Thr Gln Leu36權(quán)利要求
1.一種核酸分子，該核酸分子與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列具有80％以上的序列相似性并編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的核酸分子，該核酸分子與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列具有90％以上的序列相似性。
3.如權(quán)利要求1所述的核酸分子，該核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO1所示。
4.一種表達(dá)載體，包含權(quán)利要求1-3之一所述的核酸分子，以及必要的基因調(diào)控元件。
5.經(jīng)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)而獲得的細(xì)胞。
6.一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列具有80％以上的序列相似性并具有基本相同的功能。
7.如權(quán)利要求6所述的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列具有90％以上的序列相似性并具有基本相同的功能。
8.如權(quán)利要求6所述的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
全文摘要
本發(fā)明提供了棉花葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因、包含該基因的表達(dá)載體以及經(jīng)所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)而獲得的細(xì)胞。本發(fā)明在通過(guò)基因工程改善棉纖維質(zhì)量方面具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N9/10GK1673374SQ200510063089
公開(kāi)日2005年9月28日 申請(qǐng)日期2005年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月26日
發(fā)明者劉進(jìn)元, 武耀廷, 金龍國(guó) 申請(qǐng)人:清華大學(xué)