專(zhuān)利名稱(chēng)：轉(zhuǎn)基因水稻的培育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻分子育種技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及利用水稻基因組上特定位點(diǎn)培育轉(zhuǎn)基因水稻的方法以及所得的轉(zhuǎn)基因水稻細(xì)胞。
背景技術(shù)：
改善水稻性狀的一個(gè)主要方面在于提高其抗蟲(chóng)性，水稻螟蟲(chóng)等鱗翅目害蟲(chóng)是水稻豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的主要限制因素之一。迄今為止，在中國(guó)乃至世界上沒(méi)有任何天然的稻種資源對(duì)水稻螟蟲(chóng)等鱗翅目害蟲(chóng)具有抗性。過(guò)去，對(duì)水稻螟蟲(chóng)的防治主要依賴(lài)于化學(xué)農(nóng)藥的使用，但大量地農(nóng)藥使用不僅對(duì)生物環(huán)境造成嚴(yán)重的殘毒污染，而且也使稻米的衛(wèi)生品質(zhì)下降，從而影響人們的身體健康。另外，由于在鉆入莖桿之前螟蟲(chóng)幼蟲(chóng)在稻株的外表面只停留極短的時(shí)間，使得化學(xué)農(nóng)藥對(duì)水稻螟蟲(chóng)等鱗翅目害蟲(chóng)的防治常常難以奏效。因此，培育抗蟲(chóng)水稻是水稻育種界長(zhǎng)期追求的目標(biāo)。
隨著植物基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們已逐漸嘗試通過(guò)引入外源基因的方式來(lái)提高水稻的抗蟲(chóng)性，其中應(yīng)用最廣泛的外源基因是來(lái)自蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis)即Bt的結(jié)晶性殺蟲(chóng)蛋白基因。
在毒理學(xué)上，Bt殺蟲(chóng)蛋白的毒性活性位點(diǎn)位于昆蟲(chóng)的中腸[EnglishLH and Cantley LC(1986)Delta endotoxin is a potent inhibitor of the(Na，K)-ATPase.J.Biol.Chem.2611170-1173.]，并在那里毀壞中腸內(nèi)膜上皮細(xì)胞[Hfte H and Whiteley HR(1989)Insecticidal crystalprotein of Bacillus thringiensis.Microbiol Rev.53242-255；Knowles BHand Ellar DJ(1987)Colloid-osmotic lysis is a general feature of themechanism of action of Bacillus thringiensis of δ-endotoxins withdifferent insect specificity.Biochem.Biophys.Acta 924509-518]。從而造成目標(biāo)昆蟲(chóng)中毒死亡。
Bt內(nèi)源殺蟲(chóng)蛋白優(yōu)于化學(xué)殺蟲(chóng)劑的主要優(yōu)點(diǎn)之一就在于它們對(duì)昆蟲(chóng)的高度專(zhuān)一性，也即除目標(biāo)害蟲(chóng)之外對(duì)其他非目標(biāo)害蟲(chóng)和害蟲(chóng)天敵以及哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)等都不具有任何毒活性，并易于在環(huán)境中降解[McGauhey wh and Whalon ME(1992)Managing insect resistance toBacillus thurienginsis toxins.Science 258(27)1451-1455]。
近年來(lái)，通過(guò)基因工程導(dǎo)入外源Bt基因成功獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻已經(jīng)有了大量報(bào)道[謝道昕，范云六，倪沛沖(1991)蘇云芽孢桿菌殺蟲(chóng)基因?qū)胫袊?guó)栽培水稻品種中花11號(hào)獲得轉(zhuǎn)基因植的研究.中國(guó)科學(xué)(B輯)，8830-834；Fujimoto H，Itoh K，Yamamoto m，kyozuka j，ShimamotoK(1993)Insect-resistant rice generated by introduction of a modified e-endotoxin gene of bacillus thuringiensis.Bio/Technology 111151-1155；李冬虎等(2004)轉(zhuǎn)sck/cry1Ac雙基因抗蟲(chóng)水稻對(duì)二化螟和稻縱卷葉螟的抗蟲(chóng)效果中國(guó)水稻科學(xué)18(1)43-47；馬柄田等(2004)轉(zhuǎn)抗蟲(chóng)基因三系優(yōu)良保持系的獲得30(1)60-65]。在以上這些報(bào)道中，研究者們大都采用基因槍或者農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將外源的Bt基因?qū)胨净蚪M中。但是，外源的Bt基因整合在水稻基因組上的哪一個(gè)位點(diǎn)是隨機(jī)的、不確定的。外源基因整合在水稻基因組上的不同位點(diǎn)，可能帶來(lái)不同的遺傳效應(yīng)。例如，同一個(gè)Ubiquitin啟動(dòng)子引導(dǎo)的Bt基因轉(zhuǎn)化到同一個(gè)水稻恢復(fù)系明恢86形成的兩個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因系MSA和MSB在生長(zhǎng)后期對(duì)二化螟的抗性就存在較大差異，前者的抗蟲(chóng)表現(xiàn)穩(wěn)定，后者的抗蟲(chóng)性則隨生育期進(jìn)展呈顯著下降(李冬虎等2004，出處同上)。另外不同的插入位點(diǎn)，還可能不同程度地影響或改變受體基因組的農(nóng)藝性狀，如粳稻秀水11在轉(zhuǎn)化了cryIAb基因后，其農(nóng)藝性狀發(fā)生了明顯改變，具體表現(xiàn)為株高降低，分蘗力增強(qiáng)、穗長(zhǎng)、穗粒數(shù)、千粒重明顯下降(崔海瑞等2001)。國(guó)外也有不少類(lèi)似報(bào)道。另一方面，Tu Jumin等[(2000)Fieldperformance of transgenic elite commercial hybrid rice expressingBacillus thuringiensis δ-endotoxin.Nature/Biotechnology 181101-1104和馬柄田等(2004，出處同上)]將Bt基因分別導(dǎo)入優(yōu)良三系雜交稻恢復(fù)系明恢63和蜀恢527的基因組中，獲得高效表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系，它們?cè)谔镩g不但表現(xiàn)出抗蟲(chóng)性的明顯提高，而且農(nóng)藝性狀都沒(méi)有發(fā)生明顯的變化。因而，在轉(zhuǎn)基因育種實(shí)踐上，往往需要?jiǎng)?chuàng)造大量的獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件，然后篩選其中對(duì)農(nóng)藝性狀沒(méi)有影響或者影響輕微的獨(dú)立轉(zhuǎn)化體，進(jìn)而將其培育成為有商品價(jià)值的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻。在這樣的有商品價(jià)值的轉(zhuǎn)基因水稻中，其目的基因的DNA序列與插入位點(diǎn)上下游旁側(cè)的水稻基因組DNA序列連接在一起共同組成遺傳上穩(wěn)定的復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)，并在水稻的有性繁殖過(guò)程中世代地遺傳下去。利用該復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)可以改良其它水稻品種抵御蟲(chóng)害的能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，在水稻基因組的特定位點(diǎn)整合外源基因，可實(shí)現(xiàn)在將新的有益性狀引入水稻品系的同時(shí)對(duì)受體植株的農(nóng)藝性狀沒(méi)有明顯的不良影響，由此完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的目的在于提供一個(gè)在水稻基因組上可以有效地插入外源基因并使插入的外源基因可以穩(wěn)定地表達(dá)、而又對(duì)受體植株的農(nóng)藝性狀沒(méi)有明顯的不良影響的特定位點(diǎn)，應(yīng)用該位點(diǎn)改良水稻性狀。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供下述技術(shù)方案。
本發(fā)明的第一方面在水稻基因組上找到一個(gè)可以有效地整合了外源基因并使整合的外源基因可以穩(wěn)定地表達(dá)、而又對(duì)受體植株的農(nóng)藝性狀沒(méi)有明顯的不良影響的特定位點(diǎn)，該位點(diǎn)是位于水稻基因組第10染色體的第5354619至5354720位堿基之間的區(qū)域，其間的DNA序列可以因具體的受體品種的不同出現(xiàn)或多或少的差異。
本發(fā)明的第二方面在于提供一種復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)，所述復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)可以是由特定位點(diǎn)上下游旁側(cè)的水稻基因組DNA序列，與該位點(diǎn)的外源基因DNA序列相整合，構(gòu)成的遺傳上穩(wěn)定的復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)，并可以通過(guò)有性雜交和體細(xì)胞雜交技術(shù)重組到新的水稻種質(zhì)中去，培育成為抗蟲(chóng)水稻新品種(系)。
作為一個(gè)具體的例子，所述復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2以及在上述兩序列之間整合的外源基因雙拷貝的復(fù)合體。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解，通過(guò)天然或人工的方式，在所述復(fù)合結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上(包括其本身)通過(guò)插入、缺失、取代、替換、添加一個(gè)或多個(gè)堿基所得的功能等同的亞結(jié)構(gòu)，只要在遺傳上是穩(wěn)定的，都可以通過(guò)有性雜交和體細(xì)胞雜交技術(shù)重組到新的水稻種質(zhì)中去，培育成為水稻新品種，則這種經(jīng)修飾的復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)也屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的抗蟲(chóng)復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)或其功能等同的亞結(jié)構(gòu)，可通過(guò)有性雜交方式或體細(xì)胞原生質(zhì)融合技術(shù)轉(zhuǎn)育到感蟲(chóng)的水稻品種中，并培育成抗蟲(chóng)的新品系。
本發(fā)明的第三方面在于提供一種本發(fā)明第一方面所述的特定位點(diǎn)中整合了外源基因序列的水稻細(xì)胞以及包含所述的水稻細(xì)胞的植物組織。具體說(shuō)來(lái)，所述的水稻細(xì)胞可以是光溫敏不育系水稻細(xì)胞，質(zhì)核互作雄性不育系或者其保持系水稻細(xì)胞，雄性不育恢復(fù)系水稻細(xì)胞等各種在農(nóng)業(yè)上可應(yīng)用的水稻細(xì)胞。另一方面，在該位點(diǎn)整合的外源基因是抗蟲(chóng)基因，更進(jìn)一步地，所述外源基因可以是如本發(fā)明第二方面所述的復(fù)合基因結(jié)構(gòu)，Bt基因，包含Bt基因的融合基因，以及其它抗蟲(chóng)，抗除草劑基因等。特別地，所述外源基因可以是編碼SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的基因。
本發(fā)明的第四方面在于提供改善水稻抗性的方法，該方法包括應(yīng)用上述任意一方面所述的水稻細(xì)胞或復(fù)合基因結(jié)構(gòu)的步驟。
下面對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一個(gè)整合在水稻基因組上的可穩(wěn)定表達(dá)Bt抗蟲(chóng)蛋白的復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)。該復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)能夠賦于水稻對(duì)稻縱卷葉螟、二化螟和三化螟等鱗翅目害蟲(chóng)的抗性。這一發(fā)明適用于所有對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)敏感的稻種。這些稻種包括亞洲栽培稻種、非洲栽培稻種和它們的近緣野生種。所述的復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)包括含有Bt基因雙拷貝復(fù)合體，且復(fù)合體5′端連接著基因組DNA序列SEQID NO.1，3′端連接著基因組DNA序列SEQ ID NO.2，或者與該復(fù)合基因結(jié)構(gòu)功能等同的至少包含一份完整的Bt基因拷貝，且其5′端連接著水稻基因組DNA序列SEQ ID NO.1，或其3′端連接著水稻基因組DNA序列SEQ ID NO.2的功能等同的類(lèi)似結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明中，基因轉(zhuǎn)化所使用的受體品種為明恢63及其所配雜種汕優(yōu)63。明恢63是由福建三明市農(nóng)科所選育的優(yōu)良秈型細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系，用該系與優(yōu)良的秈型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系珍汕97A配組，所生產(chǎn)的雜種即為汕優(yōu)63。本發(fā)明中使用的明恢63種子由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院品種資源所提供。
在該具體實(shí)施方案中，本發(fā)明使用的Bt抗蟲(chóng)基因?yàn)閏ry1Ab/cry1Ac融合基因，并由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心范云六院士等人人工合成并提供使用(Jumin TU，等Expression and Function of aHybrid Bt Toxin Gene in Transgenic Rice Conferring Resistance toInsect Pest，Plant Botechnology，15(4)，195-203，1998)，基因全長(zhǎng)1830bp，所編碼的蛋白質(zhì)由610個(gè)氨基酸殘基組成，其分子量大小為60kDa。在氨基酸組成上該基因結(jié)合了cry1Ab高效的昆蟲(chóng)毒性活性位點(diǎn)和cry1Ac專(zhuān)一性極強(qiáng)的昆蟲(chóng)識(shí)別位點(diǎn)，并被置于能在禾本科作物組織中有效表達(dá)的ActinI啟動(dòng)子和nos終止子的調(diào)控之下。轉(zhuǎn)化所獲得的Bt明恢63株系及其雜交組合Bt汕優(yōu)63也因此兼?zhèn)湟陨线@些特點(diǎn)。
本發(fā)明中目的Bt抗蟲(chóng)基因和用于轉(zhuǎn)化子篩選的抗生素標(biāo)記基因是分別構(gòu)建在不同的質(zhì)粒載體上，然后，應(yīng)用共轉(zhuǎn)化的策略由基因槍介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入到受體基因組中。事實(shí)上正是由于這種共轉(zhuǎn)化策略的應(yīng)用，使得本發(fā)明中的目的基因和標(biāo)記基因分別插入在受體基因組的不同染色體上，并通過(guò)T1代的自交分離培育出不含標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因株系。本發(fā)明所述的復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)即存在于這樣的轉(zhuǎn)基因株系中。
本發(fā)明中的目的基因轉(zhuǎn)基因拷貝有兩個(gè)，他們是以尾對(duì)頭連接方式整合在受體基因組上。具體的整合順序從5′端至3′端依次為獨(dú)立整合的185bp actin I啟動(dòng)子短序列，從actin I啟動(dòng)子的第98堿基開(kāi)始至終止子結(jié)束的第一個(gè)非完整的Bt基因拷貝序列，由不同載體片段和中間包含一段51bp-actin I啟動(dòng)子短序列組成的總長(zhǎng)度為796bp的拷貝間連接序列，從actin I啟動(dòng)子的第1堿基開(kāi)始至終止子結(jié)束的第二個(gè)完整的Bt基因拷貝序列，之后是連同該拷貝一起整合的1692bp載體序列，再接著是另一段128bp載體序列。由于5′端的Bt基因拷貝的actinI啟動(dòng)子序列在其5′端被截短98bp，故推測(cè)其表達(dá)活性可能會(huì)有所下降或僅維持部分表達(dá)活性；而3′端的Bt基因拷貝是完整的，因而其表達(dá)活性是完全的。另外，在殘留的1692bp載體序列上發(fā)現(xiàn)攜帶有一段653bp長(zhǎng)的抗氨芐霉素標(biāo)記基因編碼序列，但由于它缺少了從起始密碼子至中間的長(zhǎng)度為208bp的短片段，且沒(méi)有啟動(dòng)子序列，因此不能轉(zhuǎn)錄和翻譯。因此，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因復(fù)合結(jié)構(gòu)中，人們所擔(dān)心的抗生素標(biāo)記基因?qū)Νh(huán)境生物的安全性威脅并不存在。
在該實(shí)施方式中的目的基因的整合位點(diǎn)位于水稻第10染色體短臂靠近著絲點(diǎn)的位置上，其具體的插入位置在該染色體的第5354669至5354670兩個(gè)堿基之間。這兩個(gè)堿基在正鏈上是AC，而在副鏈上是GT，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)以正鏈上的這兩個(gè)堿基為起點(diǎn)分別向5′端和3′端延伸的50個(gè)堿基序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示構(gòu)成了本發(fā)明的特定插入位點(diǎn)。遠(yuǎn)離該插入位點(diǎn)上游(5′端)5.668kb和下游0.900kb處各有一個(gè)長(zhǎng)度均為500bp的富AT序列，即所謂MAR序列。這兩個(gè)MAR序列具有所有MAR序列應(yīng)有的典型特征如A盒(AATAAAAA/CAA)或T盒(TATAAA)；拓?fù)洚悩?gòu)酶II識(shí)別序列(TATACGCATGCT)；復(fù)制起始點(diǎn)序列(ATTA，ATTTA和ATTTTA)；富TG區(qū)；卷曲DNA花式(AAAAn7AAAn7AAAA，TTTAAA)；彎曲DNA花式[TG(CA or TA)n2-4 or 9-12TG(CA or TA)]和ATC規(guī)律等。在這兩個(gè)MAR序列之間包含1個(gè)內(nèi)源的水稻基因，這個(gè)內(nèi)源的水稻基因與外源的兩拷貝Bt轉(zhuǎn)基因一起組成一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單位。因而，能夠穩(wěn)定地遺傳與表達(dá)。在該具體的實(shí)施方式中外源的兩拷貝Bt基因由如SEQ ID NO.4所示的連接序列相連。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明


圖1、用于本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案的目的基因和標(biāo)記基因的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。A質(zhì)粒pfhbt1攜帶cry1Ab/cry1Ac融合而成的Bt抗蟲(chóng)基因編碼序列，并由能在禾本科作物基因組中有效表達(dá)的Actin I啟動(dòng)子和nos終止子驅(qū)動(dòng)表達(dá)。該質(zhì)粒系由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心范云六院士等人構(gòu)建并提供使用(Jumin TU，等Expression andFunction of a Hybrid Bt Toxin Gene in Transgenic Rice ConferringResistance to Insect Pest，Plant Botechnology，15(4)，195-203，1998)。B質(zhì)粒pGL2RC7攜帶抗潮霉素基因hph和抗真菌的幾丁質(zhì)酶基因RC7編碼序列，兩者都由煙草花葉病毒啟動(dòng)子CaMV35S和終止子nos驅(qū)動(dòng)表達(dá)。在本發(fā)明中，該質(zhì)粒用于與pFHBT1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化后所獲得的轉(zhuǎn)化子的篩選。單個(gè)大寫(xiě)英文字母表示各種核苷酸內(nèi)切酶，BBamH1；CClaI；HHindIII；KKpnl；PPacI；SSstI。
圖2、基于cry1Ab/cry1Ac整合基因編碼序列推定的氨基酸序列。(Jumin TU，等，1998，出處同上)
圖3、轉(zhuǎn)基因當(dāng)代植株TT2、TT35和TT51的Southern雜交分析。圖中，上為Bt基因特異探針雜交結(jié)果，下為hph基因特異探針雜交結(jié)果。箭頭所指為符合期望值的特異帶。
圖4、Bt轉(zhuǎn)基因整合位點(diǎn)在TT51的T1中自交分離時(shí)的Southern雜交檢測(cè)結(jié)果。NT陰性對(duì)照；P陽(yáng)性對(duì)照；ITT51-T0；2-16TT51-T1單株。箭頭所示的數(shù)字為各檢測(cè)片段的分子量大小。
圖5、TT51-1第二代(T2)純系Bt抗蟲(chóng)蛋白的Western雜交分析。每孔上樣量為50μg可溶性蛋白質(zhì)。CryIAb Toxin純化的CryIAb殺蟲(chóng)蛋白；NT非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏鞍讟悠?；TT51-1(T2)；TT51-1的第二代純系；1-7TT51-1第二代純系7株蛋白樣品。箭頭所指為期望分子量大小的陽(yáng)性雜交帶。
圖6、外源轉(zhuǎn)基因拷貝在轉(zhuǎn)基因當(dāng)代植株TT51、后代純系TT51-1及其所配雜種基因組中的整合模式的Southern雜交分析。A以Bt基因編碼序列為特異探針的雜交結(jié)果；b以hph基因編碼序列為特異探針的雜交結(jié)果。箭頭所示為各雜交片段的分子量大小。
圖7、Bt轉(zhuǎn)基因純系TT51-1在大田種植和不打藥條件下對(duì)人工接蟲(chóng)的三化螟的抗性反應(yīng)。中間原品種對(duì)照明恢63；兩邊相鄰株行Bt雜種。
圖8、Bt轉(zhuǎn)基因純系TT51-1在大田種植和不打藥條件下對(duì)自然發(fā)蟲(chóng)的稻縱卷葉螟的抗性反應(yīng)；圖中，上TT51-1；下對(duì)照明恢63。
圖9、TT51-1轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)上游側(cè)翼片段TAIL-PCR擴(kuò)增結(jié)果。II、III分別為第二和第三輪的擴(kuò)增產(chǎn)物，M為bp分子量標(biāo)記。箭頭所示為期望擴(kuò)增帶Bt1747AD5。
圖10、TT51-1轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)上游側(cè)翼片段TAIL-PCR擴(kuò)增結(jié)果。II、III分別為第二和第三輪的擴(kuò)增產(chǎn)物，M為200bp分子量標(biāo)記。箭頭所示為特異擴(kuò)增帶Bt1747AD2。
圖11、TT51-1轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)上游克隆的側(cè)翼序列Bt1747AD5，序列全長(zhǎng)2303bp。下劃線(xiàn)標(biāo)出的是引物序列。
圖12、TT51-1轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)上游克隆的側(cè)翼序列Bt1747AD2，序列全長(zhǎng)1420bp。下劃線(xiàn)標(biāo)出的是引物序列。
圖13、TT51-1轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)下游側(cè)翼片段TAIL-PCR擴(kuò)增結(jié)果。II、III分別為第二和第三輪的擴(kuò)增產(chǎn)物；M1200bp DNA分子量標(biāo)記；M2λ-HindIII酶解的分子量標(biāo)記；箭頭所示為特異擴(kuò)增產(chǎn)物Bt1747AD7。
圖14、TT51-1轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)下游克隆的側(cè)翼序列Bt1747AD7，序列全長(zhǎng)2297bp。下劃線(xiàn)標(biāo)出的是引物序列。
圖15、PCR擴(kuò)增的轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)上游的緊領(lǐng)邊界序列MHL2714Act266(圖A泳道1)和下游的緊鄰邊界序列MHR1883Vec1993(圖B泳道3)。M1200bpDNA分子量標(biāo)記；M2λ-HindIII酶解的分子量標(biāo)記。
圖16、TT51-1轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)上下游克隆的緊鄰邊界序列Bt1747AD2(1479bp)和Vec1993MHR1883(2005bp)。下劃線(xiàn)標(biāo)出的是各引物序列。
圖17、兩個(gè)Bt轉(zhuǎn)基因拷貝之間的連接序列的PCR擴(kuò)增結(jié)果。1引物對(duì)Bt1747和Act29；2引物對(duì)Bt1747和Act266；M200bpDNA分子量標(biāo)記。箭頭所示為期望的擴(kuò)增帶。
圖18、TT51-1上兩個(gè)Bt拷貝之間的連接序列。粗體打印的英文字母表示前一個(gè)Bt基因拷貝的終止子及其緊鄰的載體序列；斜體標(biāo)出的粗體英文字母表示的是反向插入的ActI內(nèi)含子序列；下劃虛線(xiàn)標(biāo)出的正常字體表示的是前一個(gè)Bt基因拷貝上被反向插入的ActI內(nèi)含子序列打斷以后的載體序列；正常字體表示的是下一個(gè)Bt基因拷貝的載體及其緊鄰的ActI啟動(dòng)子序列部分；下劃線(xiàn)表示的是引物序列。
圖19、TT51-1轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)的染色體位置(I)、轉(zhuǎn)基因復(fù)合結(jié)構(gòu)(II)和酶切片段長(zhǎng)度(III)。染色體的長(zhǎng)短臂分別用長(zhǎng)短豎線(xiàn)條橢圓形表示，著絲點(diǎn)用空白小圓圈表示。1-10分別表示的是引物AD2、AD5、MHL2714、Act266、Bt1747、Act29、Bt1747、Vec1993、AD7、MHR1883。
圖20、9311和綿恢725轉(zhuǎn)育系的插入位點(diǎn)的旁側(cè)序列及Bt基因拷貝間的中間序列的PCR擴(kuò)增結(jié)果。M1λ-HindIII酶的分子量標(biāo)記；M2200bp DNA分子量標(biāo)記；I引物對(duì)Vec1993和MHR1883；2引物對(duì)Bt1747和Act29；3引物對(duì)MHL2714和Act266。箭頭所示為擴(kuò)增片段大小。
圖21、9311和綿恢725轉(zhuǎn)育系的目標(biāo)基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果。M200bpDNA分子量標(biāo)記；1引物對(duì)Bt1和Bt2；2引物對(duì)Bt1533和Bt2。箭頭所示為擴(kuò)增片段大小。
具體實(shí)施例方式
需要特別說(shuō)明的是，除特別說(shuō)明之外，本發(fā)明中所使用的實(shí)驗(yàn)方法和試劑、材料均是本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)采用的基因工程操作方法和普通可商購(gòu)的試劑和材料。
實(shí)施例1特定位點(diǎn)的鑒定
本發(fā)明的特定位點(diǎn)是通過(guò)下述試驗(yàn)材料及試驗(yàn)過(guò)程得以分析鑒定出的。
(1)包含有外源基因的質(zhì)粒載體
本發(fā)明中有兩個(gè)質(zhì)粒DNA用于水稻轉(zhuǎn)化(見(jiàn)圖1)。其中，質(zhì)粒pFHBT1攜帶由cry1Ab/cry1Ac融合而成的Bt抗蟲(chóng)基因編碼序列，并由能在禾本科作物基因組中有效表達(dá)的ActinI啟動(dòng)子和nos終止子驅(qū)動(dòng)表達(dá)。該質(zhì)粒系由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心范云六院士等人構(gòu)建并提供使用。質(zhì)粒pGL2RC7攜帶抗潮霉素基因和抗真菌的幾丁質(zhì)酶基因編碼序列，兩者都由煙草花葉病毒啟動(dòng)子CaMV35S和終止子nos驅(qū)動(dòng)表達(dá)。在本發(fā)明中，該質(zhì)粒用于與pFHBT1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化后所獲得的轉(zhuǎn)化子的篩選。
cry1Ab/cry1Ac融合基因編碼序列的人工修飾
基于cry1Ab/cry1Ac融合基因編碼序列推定的氨基酸序列見(jiàn)圖2。該融合基因的首447個(gè)氨基酸殘基與cry1Ab的對(duì)應(yīng)區(qū)段一致，除了C4-R5、A303和Y384分別取代P5-N6-I7-N8-E9-C10-I11、D309和D390以外，余下的氨基酸序列從448至609則是沒(méi)有任何變化地由cry1Ac截取。因此，從已知功能域上分析，該基因在氨基酸組成上結(jié)合了cry1Ab高效的昆蟲(chóng)毒性活性位點(diǎn)和cry1Ac專(zhuān)一性極強(qiáng)的昆蟲(chóng)識(shí)別位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化所獲得的轉(zhuǎn)基因株系也因此會(huì)兼?zhèn)湟陨线@些特點(diǎn)。另外，在融合前，該基因的密碼子使用經(jīng)過(guò)了三位A、T堿基被G或C堿基取代的優(yōu)化過(guò)程，以便適應(yīng)水稻基因組的高GC含量。作為這種取代的結(jié)果，該融合基因的總G+C含量達(dá)到48.0％，而來(lái)自cry1Ab和cry1Ac抗蟲(chóng)基因?qū)?yīng)部分的原始DNA序列中的G+C含量?jī)H為37.2％(JuminTU等1998，出處同上)。
(2)水稻轉(zhuǎn)化
從網(wǎng)室栽培的稻株上采集授粉12天后的未成熟籽粒，并去掉內(nèi)外穎。然后將去穎的籽粒浸入70％酒精1分鐘，用50％(v/v)次氯酸鈉(商品名Clorox)表面消毒15-20分鐘。在超凈工作臺(tái)上于體視鏡下分離幼胚(即外植體)，并盾片面向上地置于10ml加有3％(w/v)M麥芽糖，2mgL-12，4-D，0.8％(w/v)I型瓊脂糖(Sigma)或0.3％Gelrite(MERCK&CO.INC.，KELCO.DIV)的固體MS培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱(chēng)為MS2)上，于28℃黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)，所用的培養(yǎng)皿直徑為60mm。預(yù)培養(yǎng)16-18小時(shí)后的幼胚(80-100粒/皿)用伯樂(lè)公司(BIO-RAD，Hercules，CA)生產(chǎn)的PDC-1000/He系統(tǒng)進(jìn)行轟擊轉(zhuǎn)化。所用的程序遵照廠(chǎng)家提供的操作步驟進(jìn)行，即用Promega公司(Promega，Madison，WI)生產(chǎn)的魔幻大樣(Magic Maxipreps)DNA純化系統(tǒng)抽提的質(zhì)粒DNA(hph∶Bt＝1∶4)包裹直徑1μm金微粒，并于1100帕大氣壓下轟擊目標(biāo)外植體。轟擊后的目標(biāo)外植體幼胚直接轉(zhuǎn)移到加有50mgL-1潮霉素B的篩選培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱(chēng)MS2H)上進(jìn)行篩選，所用的培養(yǎng)皿直徑為90mm。產(chǎn)生的愈傷在相同的篩選培養(yǎng)基上每?jī)芍芾^代一次，5-7輪后得到的純一抗性愈傷轉(zhuǎn)移到20ml加有2mgL-1激動(dòng)素(Kinetin)、1mgL-1α-萘乙酸(NAA)、2mgL-1甘氨酸、1gL-1水解酪蛋白(casein hydrolysate)，30gL-1麥芽糖，3gL-1Gelrite和50mgL-1潮霉素B的培養(yǎng)皿(直徑90mm)裝N 6再生培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱(chēng)3N6)上，于28℃黑暗條件下預(yù)再生7-10天。之后，再轉(zhuǎn)移到20ml去掉了潮霉素B的三角瓶(50ml)裝3N6再生培養(yǎng)基上進(jìn)行植株再生。再生出的兩至三周大小的幼苗或移入Yoshida氏培養(yǎng)液過(guò)渡培養(yǎng)或直接移入盛土的盆栽缽中，并置于日溫29℃，夜溫23℃溫室中栽培至成熟。
(3)轉(zhuǎn)基因植株的分子分析和純系培育
應(yīng)用上述步驟轉(zhuǎn)化后，總共獲得32株可育和3株不育轉(zhuǎn)基因苗。用HindIII-SstI內(nèi)切酶組合酶切基因組DNA，以cry1Ab/cry1Ac編碼序列為探針對(duì)其中30株可育株基因組DNA進(jìn)行Southern雜交分析，結(jié)果顯示16株呈陽(yáng)性。其中，有3株包括TT2、TT35和TT51的整合模式相同(圖3)，并且都呈現(xiàn)與cry1Ab/cry1Ac完整編碼序列一致的1.8kb期望片段和一個(gè)比1.8kb小的缺失型重組片段。進(jìn)一步以hph基因編碼序列為特異探針，對(duì)這三株進(jìn)行Southern雜交分析，檢測(cè)到與該hph基因編碼序列一致的1.1-kb期望帶。這些結(jié)果證實(shí)目的基因和標(biāo)記基因均完整地整合到這3株的受體基因組中，且來(lái)自同一轉(zhuǎn)化體(圖3)。
于孕穗期從上述三株陽(yáng)性植株上截取8cm帶葉鞘的莖桿3-5段，置于墊有濕潤(rùn)濾紙的直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，每段莖桿接種6頭一齡三化螟幼蟲(chóng)，結(jié)果表明接種在這三株上的三化螟蟲(chóng)幼蟲(chóng)全部死亡，抗蟲(chóng)效率達(dá)到100％。
進(jìn)一步以目的Bt基因編碼序列單一切點(diǎn)酶HindIII對(duì)轉(zhuǎn)基因株TT51的32株T1代植株進(jìn)行酶切和分子遺傳分析，結(jié)果表明Bt轉(zhuǎn)基因符合多拷貝雙位點(diǎn)整合模式，每位點(diǎn)整合兩拷貝，部分植株的遺傳分析結(jié)果見(jiàn)圖4。在所檢測(cè)的32株中，有17株攜帶雙位點(diǎn)4拷貝，6株攜帶一位點(diǎn)的兩拷貝(兩高位雜交帶)，7株攜帶另一位點(diǎn)的兩拷貝(兩低位雜交帶)，以及2株未攜帶任何位點(diǎn)的任何拷貝(即無(wú)雜交信號(hào))。經(jīng)X2測(cè)驗(yàn)表明該兩位點(diǎn)的分離比率符合獨(dú)立遺傳9∶3∶3∶1的分離比率，其符合概率P值大于0.95。
從上述經(jīng)分子分析的T1代植株選20株自交獲得T2株系，并將其栽培于人工封閉溫室，里面的溫度和濕度在白天分別設(shè)在29℃和85％，在夜間分別設(shè)在25℃和90％。每系取10株抽提葉片可溶性總蛋白用于Western分析。每株一致地呈現(xiàn)60kDa期望蛋白帶和和一個(gè)截短的多肽分子便可初步地確定為純系(圖5)。然后，這些系中每一系的全部20個(gè)單株于最高分蘗期進(jìn)行培養(yǎng)皿抗蟲(chóng)性試驗(yàn)，如一致地表現(xiàn)抗蟲(chóng)的即可進(jìn)一步肯定為純系。經(jīng)如此鑒定的一個(gè)純系，設(shè)計(jì)編號(hào)為T(mén)T51-1，其每一株的抗蟲(chóng)效率均達(dá)到100％，于是被選擇進(jìn)行自交留種，同時(shí)將其與珍汕97A等細(xì)胞質(zhì)雄性不育系配組生產(chǎn)雜種，以便用于進(jìn)一步的分子分析和大田抗蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)。
TT51-1系細(xì)胞已于2005年3月16日提交中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(湖北省武漢市武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)進(jìn)行保藏，培養(yǎng)物名稱(chēng)稻屬秈亞種TT51-1(明恢63/Bt)保藏編號(hào)CCTCC-P200501。
(4)獨(dú)立遺傳位點(diǎn)的驗(yàn)證及標(biāo)記基因的去除
獨(dú)立遺傳位點(diǎn)的驗(yàn)證是通過(guò)一組包括完整Bt基因編碼序列分離酶HindIII/SstI、質(zhì)粒單切點(diǎn)酶KpnI和ClaI和質(zhì)粒無(wú)切點(diǎn)酶PacI酶切分析來(lái)實(shí)現(xiàn)的。除PacI外，每一種內(nèi)切酶在質(zhì)粒上的酶切位點(diǎn)見(jiàn)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖(圖1)。所用的植株DNA樣品包括轉(zhuǎn)基因T0代單株TT51及其后代純系TT51-1和由該純系配組的轉(zhuǎn)基因雜種汕優(yōu)63/Bt，并以質(zhì)粒DNA作正對(duì)照。酶切后的DNA片段經(jīng)1％凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜，用Bt基因完整編碼序列作特異探針進(jìn)行分子雜交。結(jié)果顯示，在HindIII/SstI酶切樣品中，質(zhì)粒正對(duì)照、TT51、TT51-1和汕優(yōu)63/Bt樣本均檢測(cè)到一致的1.8kb期望雜交帶。這些結(jié)果表明Bt基因完整拷貝在上下代間能正常遺傳傳遞。在KpnI和KpnI/ClaI兩酶切樣品中，TT51均呈現(xiàn)4條帶，而它的后代純系TT51-1及其所配雜種則只呈現(xiàn)上下兩端的兩條帶，中間的兩條帶被自交分離出去。類(lèi)似的結(jié)果也可從PacI和PacI/ClaI兩酶切樣品中觀(guān)察到，如TT51-PacI釋放兩條帶，TT51-PacI/ClaI釋放三條帶，而后代純系TT51-1及其所配雜種兩酶切樣品中各有一條帶被分離出去。因此，這些結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了前述獨(dú)立分離的試驗(yàn)結(jié)果。另外，從TT51-KpnI和TT51-KpnI/ClaI兩酶切樣品中釋放數(shù)目相同的4條帶且其中的兩條小帶大小差異也相同可知，各位點(diǎn)的兩個(gè)Bt轉(zhuǎn)基因拷貝是頭尾相接的方式插入到受體基因組中，因?yàn)镈NA內(nèi)切酶KpnI和ClaI同位于Bt基因編碼序列下游一側(cè)，兩者相距283bp，否則不會(huì)產(chǎn)生這樣的結(jié)果。
用hph標(biāo)記基因編碼序列作特異探針對(duì)同一張DNA膜進(jìn)行Southern雜交，發(fā)現(xiàn)HindIII(hph單切點(diǎn)酶)和SstI(hph無(wú)切點(diǎn)酶)內(nèi)切酶組合的TT51酶切樣品種釋放兩條雜交帶(圖6)，證實(shí)hph標(biāo)記基因在受體基因組中的整合也是復(fù)拷貝，但陽(yáng)性雜交信號(hào)只出現(xiàn)在TT51的各種酶切DNA樣本上，而不出現(xiàn)在TT51-1及其所配雜種的酶切DNA樣本上，表明hph轉(zhuǎn)基因復(fù)拷貝的整合位點(diǎn)是單一的，且與Bt轉(zhuǎn)基因的一個(gè)整合位點(diǎn)完全連鎖，并一起從T1代分離子TT51-1的基因組中分離出去。因此，上述這些試驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)反復(fù)篩選鑒定的TT51-1是一個(gè)不帶標(biāo)記基因的僅保留一個(gè)Bt基因插入位點(diǎn)但有兩個(gè)完整拷貝的轉(zhuǎn)基因純系。
(5)BT轉(zhuǎn)基因的抗螟蟲(chóng)特性
為了檢測(cè)Bt轉(zhuǎn)基因在受體基因組中介導(dǎo)的抗螟蟲(chóng)特性，我們自1999年開(kāi)始先后對(duì)TT51-1轉(zhuǎn)基因純系及其與珍汕97A等不育系所配的雜種進(jìn)行了多年的大田中試、環(huán)境釋放和生產(chǎn)示范等試驗(yàn)。受測(cè)試的目標(biāo)害蟲(chóng)有三化螟和稻縱卷葉螟，抗蟲(chóng)鑒定方法有人工接蟲(chóng)法和自然發(fā)蟲(chóng)法。人工接蟲(chóng)所用的蟲(chóng)卵卵塊一般于接蟲(chóng)前1-3天采集于當(dāng)?shù)氐咎铮疵抗芤粔K卵放進(jìn)盛有1ml蒸餾水的9cm長(zhǎng)指型管中。然后，將其置于28℃黑暗條件下孵化24小時(shí)。幼蟲(chóng)孵化后于6小時(shí)內(nèi)接種到稻株的基部。人工接蟲(chóng)的時(shí)期選在水稻生長(zhǎng)的中后期即從秧苗最高分蘗期至抽穗期為止。人工接蟲(chóng)的蟲(chóng)量約為每株150條1齡幼蟲(chóng)(兩塊卵量/株)。接蟲(chóng)后7-10天觀(guān)察記載稻株的受害情況。測(cè)試指標(biāo)有枯心率、白穗率和受害株率。
自然發(fā)蟲(chóng)法的植株受害癥狀是在自然發(fā)蟲(chóng)達(dá)到高峰后5-7天進(jìn)行調(diào)查。調(diào)查的指標(biāo)有單株受害葉片數(shù)或分蘗數(shù)和受害株率。人工接蟲(chóng)田塊的試驗(yàn)材料的田間設(shè)計(jì)采用雙行區(qū)，每行插31株或150株，株行距為19.8cm×26.4cm，單本植。小區(qū)按順序排列，重復(fù)3次。受試材料自移栽后不打農(nóng)藥。
試驗(yàn)結(jié)果表明TT51-1及其雜交雜種在人工接蟲(chóng)和自然發(fā)蟲(chóng)后受三化螟為害的枯心率和白穗率均不到4％，極顯著地低于明恢63和汕優(yōu)63對(duì)照20-90％的水平(表1-4，圖7)；受
表1、TT51-1在大田栽培條件下對(duì)人工接蟲(chóng)的三化螟的抗性反應(yīng)(武漢，1999)
**表示與對(duì)照的差異達(dá)1％顯著水平
表2、汕優(yōu)63/Bt在大田栽培條件下對(duì)自然發(fā)生的稻縱卷葉螟和三化螟的抗性反應(yīng)a(武漢，1999)
a數(shù)據(jù)來(lái)自每重復(fù)每材料30個(gè)樣本；b在T測(cè)驗(yàn)前三化螟危害數(shù)據(jù)先轉(zhuǎn)換成平方根再計(jì)算；
*與對(duì)照的差異達(dá)5％顯著水平；**與對(duì)照的差異達(dá)1％顯著水平.
表3、TT51-1和汕優(yōu)63/Bt在大田栽培條件下對(duì)人工接種的三化螟的抗性反應(yīng)(武漢，2000)
每重復(fù)每系測(cè)定70株和每株接種150頭一齡幼蟲(chóng)；**表示與對(duì)照的差異達(dá)1％顯著水平
表4、TT51-1和汕優(yōu)63/Bt在大田栽培條件下對(duì)自然發(fā)生的三化螟的抗性反應(yīng)(武漢，2000)*
每重復(fù)每系測(cè)定70株；**表示與對(duì)照的差異達(dá)1％顯著水平。
稻縱卷葉螟為害的葉片數(shù)每株少于0.5張，也極顯著地低于對(duì)照的每株10-34張(表5和6)。
表5、TT51-1在大田栽培條件下對(duì)自然發(fā)生的稻縱卷葉螟的抗性反應(yīng)(武漢，1999)
**表示與對(duì)照的差異達(dá)1％顯著水平
表6、TT51-1和汕優(yōu)63/Bt在大田栽培條件下對(duì)自然發(fā)生的稻縱卷葉螟的抗性反應(yīng)*(武漢，2000)
就受害普遍程度而言，TT51-1及其雜交組合受三化螟為害的枯心株率和白穗株率平均為0-13.3％，而對(duì)照的枯心和白穗株率在人工接種條件下為70-100％(表1-4)，在自然發(fā)蟲(chóng)條件下為5-100％，兩者的差異達(dá)極顯著水平。受稻縱卷葉螟為害的受害株率在轉(zhuǎn)Bt抗蟲(chóng)基因材料上為0-20％，在對(duì)照材料上為100％(表5和6，圖8)。上述結(jié)果證實(shí)在大田種植和不打農(nóng)藥條件下，TT51-1及其雜交雜種基因組中所攜帶的Bt轉(zhuǎn)基因?qū)ι鲜鲼[翅目害蟲(chóng)的抗蟲(chóng)效果十分顯著。
(6)Bt轉(zhuǎn)基因的保產(chǎn)能力
Bt轉(zhuǎn)基因的保產(chǎn)能力由雜種大田比產(chǎn)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。參加產(chǎn)量比較試驗(yàn)的材料有TT51-1、汕優(yōu)63/Bt(珍汕97AX TT51-1)、II優(yōu)63/Bt(II-32AXTT51-1)、協(xié)優(yōu)63/Bt(協(xié)青早AX TT51-1)、馬優(yōu)63/Bt(馬協(xié)AXTT51-1)和原恢復(fù)系及原雜種對(duì)照明恢63和汕優(yōu)63。各實(shí)驗(yàn)材料的田間排列方式采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，小區(qū)面積60尺2，單本植，并設(shè)打藥和不打藥兩個(gè)處理。處理內(nèi)每小區(qū)重復(fù)3次。
試驗(yàn)結(jié)果表明在不打藥條件下，對(duì)照明恢63和汕優(yōu)63因螟蟲(chóng)危害嚴(yán)重而大幅減產(chǎn)，平均畝產(chǎn)分別為218和322公斤；汕優(yōu)63/Bt、II優(yōu)63/Bt、協(xié)優(yōu)63/Bt、馬優(yōu)63/Bt等四個(gè)雜交組合則因高度抗蟲(chóng)而充分顯示其產(chǎn)量潛力，各組合實(shí)際產(chǎn)量折合畝產(chǎn)分別達(dá)620、773、758、751和854公斤，比對(duì)照增產(chǎn)1.4-2.5倍(表7)。在打藥條件下，盡管蟲(chóng)害減輕，但TT51-1及其所配雜種較對(duì)照明恢63和汕優(yōu)63的增產(chǎn)幅度仍然達(dá)到極顯著水平(表8)。因此，這些結(jié)果證實(shí)外源Bt轉(zhuǎn)基因的保產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)性能十分優(yōu)異。
表7、TT51-1及其雜交組合在不打藥條件下產(chǎn)量比較試驗(yàn)結(jié)果(武漢，2000)
表8、TT51-1及其雜交組合在打藥條件下產(chǎn)量比較試驗(yàn)結(jié)果(武漢，2000)
就經(jīng)濟(jì)性狀而言，轉(zhuǎn)基因材料與對(duì)照的差異主要反映在親本的生育期和親本及雜種的有效穗兩個(gè)方面。在生育期方面，TT51-1的生育期為130.5天，而原品種對(duì)照明恢63的生育期為128.2天，前者比后者長(zhǎng)2.3天(表9和10)。就有效穗而言，無(wú)論是轉(zhuǎn)基因親本TT51-1，還是轉(zhuǎn)基因雜種汕優(yōu)63/Bt，在打藥和不打藥條件下均比原親本和原雜種對(duì)照有顯著增加，增幅達(dá)5％以上。其它經(jīng)濟(jì)性狀則未見(jiàn)顯著差異。
表9、TT51-1及其雜交組合與對(duì)照品系在大田栽培及不打藥條件下的農(nóng)藝形狀比較(武漢，2000)
表10、汕優(yōu)63/Bt和馬優(yōu)63/Bt及對(duì)照汕優(yōu)63各農(nóng)藝形狀在湖北省環(huán)境釋放點(diǎn)的平均表現(xiàn)(2001)
*表示與對(duì)照的差異達(dá)5％顯著水平。其LSD0.5＝75.2公斤/畝；LSD0.1＝110.2公斤/畝
綜上所述，TT51-1受體基因組中的Bt轉(zhuǎn)基因不僅插入位點(diǎn)單一、整合的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)相對(duì)較少和抗抗生素標(biāo)記基因已經(jīng)通過(guò)自交分離去除，而且其遺傳與表達(dá)穩(wěn)定、抗螟蟲(chóng)等鱗翅目害蟲(chóng)的能力強(qiáng)。因此，可以認(rèn)為，Bt基因在TT51-1基因組中的插入和整合的位點(diǎn)，就是符合本發(fā)明目的的特定位點(diǎn)。
實(shí)施例2復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)的分離、測(cè)序分析和染色體定位
復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)即包含了外源插入序列和整合位點(diǎn)旁側(cè)序列的全部DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)。要弄清復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)首先必須分離鄰近插入位點(diǎn)的旁側(cè)序列，然后再分離出該插入位點(diǎn)上的外源DNA序列，測(cè)序后即可確定其全部DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)。插入位點(diǎn)的染色體定位可通過(guò)網(wǎng)上生物信息學(xué)比對(duì)分析，利用水稻已知基因組序列進(jìn)行確定。
鄰近插入位點(diǎn)的旁側(cè)序列的分離應(yīng)用劉耀光等人發(fā)明的TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced-PCR)即熱不對(duì)稱(chēng)巢式PCR技術(shù)進(jìn)行。TAIL-PCR利用一套巢式特異引物和短的隨機(jī)簡(jiǎn)并引物(Shortarbitary degenerate primers)，在交錯(cuò)應(yīng)用不同退火溫度條件下，使靶標(biāo)DNA得到優(yōu)先擴(kuò)增，并抑制非靶標(biāo)DNA的擴(kuò)增。所用的巢式特異引物和簡(jiǎn)并引物見(jiàn)表11和12。TAIL-PCR共分三輪完成，各輪反應(yīng)體系略有不同，其中第一輪的反應(yīng)體系如表13。
表11、TAIL-PCR反應(yīng)中應(yīng)用的隨機(jī)簡(jiǎn)并引物(ADn)及其特點(diǎn)
注退火溫度根據(jù)Tm＝69.3+0.41(GC％)-650/L(L為引物長(zhǎng)度)公式計(jì)算，平均退火溫度為GC含量最高和GC含量最低時(shí)引物退火溫度的平均值。
表12、TAIL-PCR或PCR反應(yīng)中應(yīng)用的特異引物(SP1-3)及其特點(diǎn)
表13、TAIL-PCR第一輪反應(yīng)體系
a用于第一輪反應(yīng)的特異引物；b用于第一輪反應(yīng)的簡(jiǎn)并引物
第一輪PCR擴(kuò)增后，將其產(chǎn)物稀釋40倍，并取1μl作為第二輪擴(kuò)增的模板，第二輪的反應(yīng)體系如表14。第二輪PCR擴(kuò)增后，其產(chǎn)物稀釋10倍，并取1μl作為第三輪擴(kuò)增的模板，第三輪的反應(yīng)體系如表15。
表14、TAIL-PCR第二輪反應(yīng)體系
a用于第二輪反應(yīng)的特異引物；b用于第二輪反應(yīng)的簡(jiǎn)并引物
表15TAIL-PCR第三輪反應(yīng)體系
各輪TAIL-PCR的反應(yīng)條件見(jiàn)表16。TAIL-PCR產(chǎn)物用1％凝膠電泳檢測(cè)，電泳結(jié)果由凝膠成像系統(tǒng)拍攝保存。對(duì)經(jīng)凝膠電泳鑒定為特異帶的第二輪或第三輪TAIL-PCR產(chǎn)物，切膠后，用大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)生產(chǎn)的瓊脂糖膠DNA純化試劑盒(TakaRaAgarose Gel DNA Purification Kit)純化回收，然后用T4DNA連接酶將其連接到TA載體pMD 18-T上。連接反應(yīng)系統(tǒng)遵照廠(chǎng)家提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。連接反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行，其反應(yīng)條件如下16℃10分鐘，20℃5分鐘，4℃2分鐘；40個(gè)循環(huán)，然后65℃10分鐘，反應(yīng)完畢后于4℃保存。
表16、TAIL-PCR各輪反應(yīng)的反應(yīng)條件
注延伸時(shí)間和退火溫度可分別根據(jù)產(chǎn)物長(zhǎng)度和引物不同作相應(yīng)調(diào)整。
連接產(chǎn)物然后用熱激法或電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，用藍(lán)白斑法選擇陽(yáng)性克隆，并用PCR擴(kuò)增目標(biāo)片段進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證后的陽(yáng)性克隆送到上海生物工程有限公司或大連寶生物(Takara)工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。
(1)TT51-1轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)上游側(cè)翼片段的克隆
首先用pFHBT1質(zhì)粒單一切點(diǎn)酶KpnI酶切TT51-1的基因組總DNA，酶切后的DNA片段經(jīng)1％凝膠電泳后按4-9kb、9-16kb和16-30kb分段回收，分別自連后作為模板；以Bt1533、Bt1593和Bt1747為巢式特異引物分別與隨機(jī)簡(jiǎn)并引物AD1、AD2、AD3、AD4、AD5、AD6、AD7、AD8和AD9配對(duì)進(jìn)行TAIL-PCR擴(kuò)增，結(jié)果從16-30kb的自連片段中擴(kuò)增出一條特異帶，記為Bt1747AD5，其長(zhǎng)度為2.303kb(圖9)。為驗(yàn)證這一擴(kuò)增結(jié)果，重新酶切TT51-1基因組DNA，經(jīng)電泳回收16-30kb的片段，自連后用作模板進(jìn)行TAIL-PCR擴(kuò)增，結(jié)果再次獲得Bt1747AD5特異片段。因此，初步認(rèn)為Bt1747AD5是期望的側(cè)翼片段。
換用Bt基因下游290bp處另一質(zhì)粒單切點(diǎn)酶ClaI酶切TT51-1基因組總DNA，經(jīng)電泳、分段回收和分別自連后作為模板，以pBt1533、pBt1593和pBt1747為特異引物分別與隨機(jī)簡(jiǎn)并引物AD1、AD2、AD3、AD4、AD5、AD6、AD7和AD8配組進(jìn)行TAIL-PCR擴(kuò)增，結(jié)果得到多條特異帶(圖10)。分別對(duì)上述特異帶進(jìn)行克隆、測(cè)序和網(wǎng)上同源序列比較，發(fā)現(xiàn)ClaI酶切自連的擴(kuò)增產(chǎn)物中有一個(gè)1.420kb的片段Bt1747AD2與先前用KpnI酶切并自連后的擴(kuò)增產(chǎn)物Bt1747AD5(2.303kb)片段都位于水稻第10染色體的同一BAC克隆上(基因庫(kù)收錄編號(hào)是AC122146或AC091238)，兩者僅相距3015bp。因而，證實(shí)這兩個(gè)TAIL-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物確實(shí)是期望的側(cè)翼片段。這兩個(gè)擴(kuò)增片段的測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖11和圖12。
(2)TT51-1轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)下游旁側(cè)翼片段的克隆
直接以TT51-1基因組總DNA為模板，以pBt1533、pBt1593、pBt1747為特異引物，與隨機(jī)簡(jiǎn)并引物AD1、AD2、AD3、AD4、AD5、AD6、AD7和AD8匹配作TAIL-PCR擴(kuò)增，結(jié)果得到多條特異帶(圖13)。分別對(duì)這些特異帶進(jìn)行克隆、測(cè)序和網(wǎng)上同源序列比較，發(fā)現(xiàn)其中的一個(gè)2.3kb的片段Bt1747AD7的3′端含有48個(gè)堿基長(zhǎng)度的水稻基因組序列(后證實(shí)為緊鄰插入位點(diǎn)的邊界序列)，緊接著反方向上朔為128bp的未知來(lái)源序列和2kb長(zhǎng)的Bt基因及其載體序列。由網(wǎng)上同源序列比較的結(jié)果顯示這個(gè)48bp短片段也是位于水稻第10染色體的同一個(gè)BAC克隆(AC122146或AC091238)上，它與上游的兩個(gè)片段的3′端分別相距11,839bp和17,030bp。因此，證實(shí)這一短序列就是插入位點(diǎn)下游的旁側(cè)序列(圖14)。
(3)TT51-1轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)上下游旁側(cè)翼片段的克隆
根據(jù)網(wǎng)上與TT51-1轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的已知序列在轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)的上游及其下游各合成若干特異引物，并與載體序列上的一系列特異引物分別匹配進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得一系列特異片段。從中選擇了兩個(gè)長(zhǎng)度為1.5kb和2.0kb的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖15)，MHL2714Act266和MHR1883Vec1993進(jìn)行克隆、測(cè)序和網(wǎng)上同源序列比較，結(jié)果證實(shí)它們分別是含轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)上游的緊鄰邊界序列和包含48bp短序列在內(nèi)的下游的緊鄰邊界序列(圖16)。
(4)TT51-1基因組中兩個(gè)Bt轉(zhuǎn)基因拷貝間連接序列的克隆
考慮到前述結(jié)果已經(jīng)證實(shí)兩個(gè)Bt轉(zhuǎn)基因拷貝是以頭尾相接的方式插入到受體基因組中這一事實(shí)，因此，要擴(kuò)增這兩個(gè)拷貝之間的連接序列，其引物對(duì)的設(shè)計(jì)方向必須是從5′端拷貝遠(yuǎn)下游的基因編碼區(qū)到3′端拷貝遠(yuǎn)上游的啟動(dòng)子序列。依照此思路共設(shè)計(jì)了4個(gè)PCR特異引物Act3、AcT29、Act266和Act409，將其分別與Bt基因的1個(gè)特異引物Bt1747配對(duì)擴(kuò)增兩個(gè)Bt轉(zhuǎn)基因拷貝之間的連接序列，結(jié)果都得到了期望大小的片段(圖17)。從中選擇一個(gè)1.2kb的亮帶Bt1747Act29進(jìn)行克隆和測(cè)序，并將測(cè)得的序列(圖18)與已知的質(zhì)粒載體和基因及啟動(dòng)子序列加以比較，發(fā)現(xiàn)自5′端開(kāi)始，最前面的106bp是第一個(gè)Bt轉(zhuǎn)基因拷貝的3′端編碼序列，其中首20bp如下劃線(xiàn)表出的為Bt1747引物序列；接下來(lái)的349bp是終止子及其緊鄰的載體序列；接著是反向插入的長(zhǎng)度為51bp的ActI內(nèi)含子序列；再接下來(lái)的98bp仍然是第一個(gè)Bt轉(zhuǎn)基因拷貝的載體序列，只是其中的123bp被反向插入的長(zhǎng)度為51bp的ActI內(nèi)含子序列所替換；緊接著的550bp和74bp分別是第二個(gè)Bt轉(zhuǎn)基因拷貝的載體序列和ActI啟動(dòng)子序列，在末端用下劃線(xiàn)表出的20bp為Act29引物序列。具體說(shuō)來(lái)，在該實(shí)施方案中Bt基因之間的連接序列如SEQ ID NO.4所示。
(5)TT51-1復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)及其插入位點(diǎn)的染色體定位
將上述經(jīng)分離、測(cè)序和驗(yàn)證的插入位點(diǎn)上下游旁側(cè)序列、外源Bt基因及其啟動(dòng)子和終止子序列和轉(zhuǎn)基因拷貝之間的連接序列拼接起來(lái)即為本發(fā)明所述的復(fù)合轉(zhuǎn)基因一級(jí)DNA結(jié)構(gòu)，也即復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)。將克隆的轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)的旁側(cè)序列所在的BAC克隆基因庫(kù)收錄序號(hào)(GenBank Accession No)輸入禾本科數(shù)據(jù)庫(kù)(Gramene datab se)進(jìn)行搜索，得出其插入位點(diǎn)位于水稻第10染色體短臂靠近著絲點(diǎn)的位置上，具體在第5354669至第5354670堿基之間。進(jìn)一步按復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)各組成部分片段大小繪出的結(jié)構(gòu)圖及其各酶切片段長(zhǎng)度見(jiàn)圖19。
對(duì)插入位點(diǎn)兩邊的水稻基因組序列分析表明，遠(yuǎn)離該插入位點(diǎn)上游(5′端)5.668kb和下游0.900kb處各有一個(gè)長(zhǎng)度均為500bp的富AT序列，即所謂MAR序列。這兩個(gè)MAR序列具有所有MAR序列應(yīng)有的典型特征如A盒(AATAAAAA/CAA)或T盒(TATAAA)；拓?fù)洚悩?gòu)酶II識(shí)別序列(TATACGCATGCT)；復(fù)制起始點(diǎn)序列(ATTA，ATTTA和ATTTTA)；富TG區(qū)；卷曲DNA花式(AAAAn7AAAn7AAAA，TTTAAA)；彎曲DNA花式[TG(CA or TA)n2-4 or 9-12TG(CA or TA)]和ATC規(guī)律等。在這兩個(gè)MAR序列之間包含1個(gè)內(nèi)源的水稻基因，外源的兩拷貝Bt轉(zhuǎn)基因與這個(gè)內(nèi)源的水稻基因一起組成一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單位，因而，能夠穩(wěn)定地遺傳與表達(dá)。
實(shí)施例3外源Bt轉(zhuǎn)基因復(fù)合結(jié)構(gòu)的有性雜交轉(zhuǎn)育
無(wú)特別說(shuō)明的情況下，轉(zhuǎn)育試驗(yàn)中采用的試驗(yàn)方法和試驗(yàn)材料均是本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)采用的。
1轉(zhuǎn)Bt基因復(fù)合結(jié)構(gòu)的BT5193的選育
以TT51-1為供體親本，以常規(guī)水稻品種9311為受體親本進(jìn)行雜交，雜交后代進(jìn)行系譜選育，并在系譜選育過(guò)程中輔以分子標(biāo)記選擇來(lái)清除供體親本的遺傳背景和追蹤外源Bt基因的傳遞情況，于F4代獲得了含有本發(fā)明所述的復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定抗蟲(chóng)株系BT5193。從該株系葉片組織中提取DNA，擴(kuò)增出Bt基因及其側(cè)翼的DNA片斷(圖20-21)。經(jīng)測(cè)序分析證證實(shí)，來(lái)自于供體親本的由SEQ ID NO.1、Bt復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)和SEQ ID NO.2構(gòu)成了插入在基因組上的外源Bt復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)保持不變，穩(wěn)定的轉(zhuǎn)育到新的受體材料之中。經(jīng)田間抗蟲(chóng)性試驗(yàn)，所育成的抗蟲(chóng)株系BT5193具有良好的抗蟲(chóng)性，高抗水稻螟蟲(chóng)。
2轉(zhuǎn)Bt基因復(fù)合結(jié)構(gòu)的BT51725的選育
以TT51-1為供體親本，以水稻三系恢復(fù)系綿恢725為受體親本進(jìn)行雜交，雜交后代進(jìn)行系譜選育，并在系譜選育過(guò)程中輔以分子標(biāo)記選擇來(lái)清除供體親本的遺傳背景和追蹤外源Bt基因的傳遞情況，于F5代獲得了含有本發(fā)明所述的復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定抗蟲(chóng)株系BT51725。從該株系葉片組織中提取DNA，擴(kuò)增出Bt基因及其側(cè)翼的DNA片斷(圖20-21)。經(jīng)測(cè)序分析證證實(shí)，來(lái)自于供體親本的由SEQ IDNO.1、Bt復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)和SEQ ID NO.2構(gòu)成了插入在基因組上的外源Bt復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)保持不變，穩(wěn)定的轉(zhuǎn)育到新的受體材料之中。經(jīng)田間抗蟲(chóng)性試驗(yàn)，所育成的抗蟲(chóng)株系BT5193具有良好的抗蟲(chóng)性，高抗水稻螟蟲(chóng)。
3轉(zhuǎn)Bt基因復(fù)合結(jié)構(gòu)的水稻抗蟲(chóng)光溫敏雄性不育系BT5118的培育
根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)操作方法，以TT51-1為供體親本，以水稻光溫敏雄性不育系2018S為受體親本進(jìn)行一次雜交，3次回交和兩次自交，并在回交過(guò)程中輔以分子標(biāo)記選擇來(lái)清除供體親本的遺傳背景和追蹤外源Bt基因的傳遞情況，同時(shí)進(jìn)行系譜選育和水稻光溫敏雄性不育特性的選育，于BC3F2代獲得了含有本發(fā)明所述的復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定具有光溫敏雄性不育特性的株系BT5118。從該株系葉片組織中提取DNA，擴(kuò)增出Bt基因及其側(cè)翼的DNA片斷，經(jīng)測(cè)序分析證證實(shí)，來(lái)自于供體親本的由SEQ ID NO.1、Bt復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)和SEQID NO.2構(gòu)成了插入在基因組上的外源Bt復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)保持不變，穩(wěn)定的轉(zhuǎn)育到新的受體材料之中。應(yīng)用與實(shí)施例1類(lèi)似的方式，經(jīng)田間抗蟲(chóng)性試驗(yàn)，所育成的抗蟲(chóng)株系BT5118具有良好的抗蟲(chóng)性，高抗水稻螟蟲(chóng)，并且具有光溫敏雄性不育特性，可以用于兩系雜交水稻制種應(yīng)用。
4轉(zhuǎn)Bt基因復(fù)合結(jié)構(gòu)的水稻抗蟲(chóng)三系不育系的選育
以TT51-1為供體親本，以水稻三系不育系保持系為受體親本進(jìn)行雜交，對(duì)雜交后代進(jìn)行系譜選育，并在系譜選育過(guò)程中輔以分子標(biāo)記選擇來(lái)清除供體親本的遺傳背景和追蹤外源Bt基因的傳遞情況，可以獲得含有本發(fā)明所述的復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定抗蟲(chóng)保持系。用此保持系和其相應(yīng)的不育系連續(xù)雜交兩代并根據(jù)后代抗蟲(chóng)性分離情況的鑒定就可以獲得含有本發(fā)明所述的復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定抗蟲(chóng)不育系。
同樣地，從技術(shù)上分析，利用雜交系譜法和體細(xì)胞雜交法，也可達(dá)到相同的目的。另外，利用上述方法進(jìn)行轉(zhuǎn)育，所用的受體親本除了恢復(fù)系、保持系和不育系以外，還可以是常規(guī)水稻品種。在分類(lèi)上這些品種或系可以是秈稻粳稻、爪洼稻等亞洲栽培稻，亦可以是非洲栽培稻和它們的近緣野生種。
序列表
<110>浙江大學(xué)
<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120>一種受植物系統(tǒng)獲得性抗性誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的啟動(dòng)子及其應(yīng)用
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>50
<212>DNA
<213>水稻(Oryza Sativa)
<400>1
CGACTTTCAA GCATCAGTAC AGGAAGGATA AAAAGTGCCG AACATGGAGA 50
<210>2
<211>50
<212>DNA
<213>水稻(Oryza Sativa)
<400>2
CAGATAAGCA GTAGTGGTGG GGCTACGAAC ATATTCCTTT TCCTTCTGGA 50
<210>3
<211>610
<212>氨基酸序列
<213>水稻(Oryza Sativa)
<400>3
MDNNCRPYNC LSNPEVEVLG GERIETGYTP IDISLSLTQF LLSEFVPGAG FVLGLVDIIW 60
GIFGPSQWDA FLVQIEQLIN QRIEEFARND AISRLEGLSN LYQIYAESFR EWEADPTNPA 120
LREEMRIQFN DMNSALTTAI PLFAVQNYQV PLLSVYVQAA NLHLSVLRDV SVFGQRWGFD 180
AATINSRYND LTRLIGNYTD HAVRWYNTGL ERVWGPDSRD WIRYNQFRRE LTLTVLDIVS 240
LFPNYDSRTY PIRTVSQLTR EIYTNPVLEN FDGSFRGSAQ GIEGSIRSPH LMDILNSITI 300
YTDDHRGEYY WSGHQIMASP VGFSGPEFTF PLYGTMGNAA PQQRIVAQLG QGVYRTLSST 360
LYRRPFNIGI NNQQLSVLDG TEFADGTSSN LPSAVYRKSG TVDSLDEIPP QNNNVPPRQG 420
FSHRLSHVSM FRSGFSNSSV SIIRAPMFSW IHRSAEFNNI IASDSITQIP AVRGNFLFNG 480
SVISGPGFTG GDLVRLNSSG NNIQNRGYIE VPINFPSTST RYRVRVRYAS VTPIHLNVNW 540
GNSSIFSNTV PATATSLDNL QSSDFGYFES ANAFTSSLGN IVGVRNFSGT AGVIIDRFEF 600
IPVTATLEAE610
<210>4
<211>797
<212>DNA
<213>水稻(Oryza Sativa)
<400>4
CATCGATGAT ATCAGATCTG CCGGTCTCCC TATAGTGAGT CGTATTAATT TCGATAAGCC 60
AGCACATCTA AGCCTGACGA AGCAGCAGAA ATATATAAAA ATATAAACCA TGCTCACTCA120
AAGGCGGTAA CACGGTTATC CACAGAATCA GGGGATAACG CAGGAAAGAA CATGTGAGCA180
AAAGGCCAGC AAAAGGCCAG GAACCGTAAA GCGTTTCTGG GTGAGCAAAA ACAGGAAGGC240
AAAATGCCGC AAAAAAGGGA ATAAGGGCGA CACGGAAATG TTGAATACTC ATACTCTTCC300
TTTTTCAATA TTATTGAAGC ATTTATCAGG GTTATTGTCT CATGAGCGGA TACATATTTG360
AATGTATTTA GAAAAATAAA CAAATAGGGG TTCCGCGCAC ATTTCCCCGA AAAGTGCCAC420
CTGACGTCTA AGAAACCATT ATTATCATGA CATTAACCTA TAAAAATAGG CGTATCACGA480
GGCCCTTTCG TCTCGCGCGT TTCGGTGATG ACGGTGAAAA CCTCTGACAC ATGCAGCTCC540
CGGAGACGGT CACAGCTTGT CTGTAAGCGG ATGCCGGGAG CAGACAAGCC CGTCAGGGCG600
CGTCAGCGGG TGTTGGCGGG TGTCGGGGCT GGCTTAACTA TGCGGCATCA GAGCAGATTG660
TACTGAGAGT GCACCATATG GACATATTGT CGTTAGAACG CGGCTACAAT TAATGCATAA720
CCTTATGTAT CATACACATA CGATTTAGGT GACACTATAG AACTCGAGCA GCTGAAGCTT780
GCATGCCTGC AGGTCGA 79權(quán)利要求
1.一種重組水稻細(xì)胞，其特征在于在該細(xì)胞的基因組的特定位點(diǎn)上攜帶了一種能穩(wěn)定遺傳的復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)，所述特定位點(diǎn)是水稻基因組第10染色體的第5354619與5354720位堿基之間的區(qū)域。
2.如權(quán)利要求1所述的水稻細(xì)胞，其特征在于，所述的細(xì)胞是光溫敏不育系水稻細(xì)胞、雄性不育恢復(fù)系水稻細(xì)胞、質(zhì)核互作雄性不育系或者質(zhì)核互作雄性不育系保持系水稻細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求1或2中任意一項(xiàng)所述的水稻細(xì)胞，其特征在于，所述的一種能穩(wěn)定遺傳的復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)是由以下幾部分序列沿5′到3′方向順序連接而成
(i)SEQ ID NO.1所示的序列，或其中經(jīng)插入、缺失、替換、添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸所得的不導(dǎo)致水稻細(xì)胞不良表型的核酸序列；
(ii)外源基因序列；
(iii)SEQ ID NO.2所示的核酸序列，或其中經(jīng)插入、缺失、替換、添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸所得的不導(dǎo)致水稻細(xì)胞不良表型的核酸序列。
4.如權(quán)利要求3所述的水稻細(xì)胞，其中(ii)中所述的外源基因是編碼SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的核酸序列，或在所述核酸序列中經(jīng)插入、缺失、替換、添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸后所得的與編碼SEQ ID NO.3所示氨基酸序列功能相同的核酸序列。
5.如權(quán)利要求3所述的水稻細(xì)胞，其中(ii)中所述的外源基因是間以連接序列的兩個(gè)拷貝的Bt基因。
6.如權(quán)利要求5所述的水稻細(xì)胞，其中所述的連接序列是如SEQID NO.4所示的核酸序列，或其中經(jīng)插入、缺失、替換、添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸所得的不影響所插入的Bt基因功能的核酸序列。
7.如權(quán)利要求1所述的水稻細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞是保藏號(hào)為CCTCC-P200501的細(xì)胞。
8.包含如權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的水稻細(xì)胞的植物組織。
9.一種改善水稻抗蟲(chóng)特性的方法，該方法包括應(yīng)用權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的水稻細(xì)胞或植物組織的步驟。
10.一種外源基因整合位點(diǎn)，其特征在于，所述位點(diǎn)是水稻基因組第10染色體的第5354619至5354720位堿基之間的區(qū)域。
全文摘要
本發(fā)明提供在水稻基因組上的一個(gè)可以有效地整合了外源基因并使整合的外源基因可以穩(wěn)定地表達(dá)、而又對(duì)受體植株的農(nóng)藝性狀沒(méi)有明顯的不良影響的特定位點(diǎn)。此外，還提供一種復(fù)合基因結(jié)構(gòu)，該基因結(jié)構(gòu)可以是由特定位點(diǎn)上下游旁側(cè)的水稻基因組DNA序列，與該位點(diǎn)的外源基因DNA序列相整合，構(gòu)成的遺傳上穩(wěn)定的復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)，并可以通過(guò)有性雜交和體細(xì)胞雜交技術(shù)重組到新的水稻種質(zhì)中去，培育成為水稻新品種(系)。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1840655SQ200510062980
公開(kāi)日2006年10月4日 申請(qǐng)日期2005年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月31日
發(fā)明者凃巨民, 張啟發(fā), 黃海清, 潘剛, 何予卿, 張集文 申請(qǐng)人:浙江大學(xué), 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)