專利名稱：生物組織細(xì)胞玻璃化凍存液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種能夠保持深低溫凍存生物組織細(xì)胞活性的組合物。進(jìn)一步，涉及一種深低溫凍存生物組織細(xì)胞的玻璃化凍存液。
背景技術(shù)：
目前深低溫凍存生物組織細(xì)胞采用的常規(guī)方式是慢速凍存法。該法一般需配備凍存液和程序降溫儀，并且操作過程比較復(fù)雜。以深低溫凍存大鼠胚胎神經(jīng)細(xì)胞為例所采用的凍存液為含有20％DMSO(二甲基亞砜)和40％小牛血清的RPMI 1640液(培養(yǎng)液).與大鼠胚胎神經(jīng)細(xì)胞懸浮液等量混合，使DMSO的終濃度為10％，4℃平衡20min后，用程序降溫儀控溫，以1℃/min的降溫速率冷卻至-75℃，再以3℃/min降至-95℃，投入液氮(-196℃)凍存。在凍存20d(天)后，檢測細(xì)胞的回收率為86.57±6.87％，存活率為81.74±8.47％，琥珀酸脫氫酶(SDH)活性為0.598±0.086。電鏡下觀察，大部分胚胎神經(jīng)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化，細(xì)胞膜和細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整，核膜清晰可見。
由于慢速凍存法所配備的程序降溫儀價格昂貴，一般規(guī)模的應(yīng)用單位無能力購置；程序降溫儀又體積較大，攜帶不便，在草原、牧場等畜獸養(yǎng)殖地區(qū)授精應(yīng)用量較大的地方使用尤感困難；而且程序降溫儀使用時，由于是慢速降溫故處理過程時間較長，一般需要一個多小時。由于慢速凍存法存在的上述諸多缺陷，因而其應(yīng)用受到了很大的限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種適合多種生物組織細(xì)胞深低溫凍存的玻璃化溶液，該溶液能有效保持冷凍后的生物組織細(xì)胞的活性，并具有配置簡單即不需昂貴的程序降溫儀、操作方便、價格低廉和容易推廣的特點(diǎn)。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案是生物組織細(xì)胞玻璃化凍存液，其各成分的體積百分比中含有19.5-21.5的二甲基亞砜，該凍存液中還含有14.5-16.5的乙酰胺，3.5-5.5的丙二醇，4.5-6.5的2，3-丁二醇，5-7的聚乙二醇。
所述的聚乙二醇的分子量為6000。
本發(fā)明提供的玻璃化凍存液能有效地防止生物組織細(xì)胞在極快的降溫和復(fù)溫過程中冰晶形成對生物組織細(xì)胞造成冷凍損傷，因而顯著提高了生物組織細(xì)胞冷凍保存的存活率。所需的配置除常規(guī)的冷凍設(shè)備外不需配備昂貴的程序降溫儀，大幅度簡化了現(xiàn)有的生物組織細(xì)胞的冷凍保存程序，而且方便攜帶，操作也變得十分簡單，進(jìn)而顯著降低了冷凍保存的成本。由于容易推廣使用，對于草原、牧場等畜獸養(yǎng)殖地區(qū)尤其具有積極意義。
具體實(shí)施例方式
玻璃化概念實(shí)質(zhì)上就是液體固化時不產(chǎn)生晶體，而溶液的粘滯度極度升高的一種狀態(tài)。在玻璃化過程中，溶液被認(rèn)為變成非晶體狀態(tài)，分子間的運(yùn)動受到很大程度的束縛。把生物材料用玻璃化方法進(jìn)行低溫凍存的概念，首先由B.J.Luyet在1937年提出。他認(rèn)為生命是生物活體系統(tǒng)的原子或其他結(jié)構(gòu)元的一種特殊排列，改變這種原子或結(jié)構(gòu)元的位置，將可能破壞其平衡引起死亡，而結(jié)晶會使水分子從這些結(jié)構(gòu)元中被撕裂開來，導(dǎo)致構(gòu)筑生命物質(zhì)的結(jié)構(gòu)元遭到破壞。低溫?fù)p傷就是由于細(xì)胞內(nèi)外的結(jié)晶，造成細(xì)胞質(zhì)和生物膜破壞而引起的。
本發(fā)明對玻璃化凍存液的篩選、低溫保護(hù)劑的毒性、冷凍-復(fù)溫、凍存液的洗脫等程序進(jìn)行了比較研究，并通過對凍存后細(xì)胞膜及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化、胞內(nèi)有關(guān)離子、超氧化物歧化酶(SOD)活性、琥珀酸脫氫酶(SDH)活性、三磷酸腺苷(ATP)含量以及細(xì)胞凍存后的體外培養(yǎng)等結(jié)構(gòu)和功能變化的研究，獲得了理想的凍存液配方。經(jīng)使用該玻璃化凍存液仍然能夠保持多種生物組織細(xì)胞的活性，進(jìn)而為建立細(xì)胞和組織庫提供技術(shù)支持。
本發(fā)明提供的生物組織細(xì)胞玻璃化凍存液，其組成成分中含有體積百分比19.5-21.5的二甲基亞砜、14.5-16.5的乙酰胺、3.5-5.5的丙二醇、4.5-6.5的2，3-丁二醇、5-7的聚乙二醇。所述的聚乙二醇包括不同分子量的所有聚乙二醇。
聚乙二醇中，分子量6000的優(yōu)先選用。
這些低溫保護(hù)劑可分為滲透性和非滲透性兩類，全部可外購獲得。
本發(fā)明提供的玻璃化凍存液進(jìn)行了以下測試一、采用以下三個實(shí)施例實(shí)施例1中的玻璃化溶液含有(體積百分比)DMSO-19.5，乙酰胺-14.5，丙二醇-3.5，2，3-丁二醇-4.5，聚乙二醇-5。
實(shí)施例2中的玻璃化溶液含有(體積百分比)DMSO-21.5，乙酰胺-16.5，丙二醇-5.5，2，3-丁二醇-6.5，聚乙二醇-7。
實(shí)施例3中的玻璃化溶液含有(體積百分比)DMSO-20.5，乙酰胺-15.5，丙二醇-4.5，2，3-丁二醇-5.5，聚乙二醇-6。
二、將前述實(shí)施例同時按以下方式測試1.玻璃化凍存液對胚胎神經(jīng)細(xì)胞回收率的影響測試前處理引頸處死孕18d的SD大鼠孕鼠，剖腹取出胚胎，分離出大腦皮層，置于D-Hank’s液(無鈣無鎂的生理溶液)中，仔細(xì)剔除腦膜及血管組織，漂洗2次。將其切碎后用0.25％胰蛋白酶在37℃水浴中攪拌消化。收集到的細(xì)胞懸液，加入等量含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液(細(xì)胞培養(yǎng)基)終止消化。用220目的尼龍網(wǎng)過濾，濾液以1000r/min離心8min，棄上清，加D-Hank’s液制成懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至108個/mL。該處理過程與背景技術(shù)的前處理過程相同。
玻璃化凍存取108個/mL的細(xì)胞懸液1份(體積份)，加1/3份凍存液，在4℃平衡10min；再加2/3份凍存液，平衡10min；最后加0℃的凍存液8份。分裝到凍存管中，直接投入液氮中。將凍存20d的胚胎神經(jīng)細(xì)胞在37℃水浴中快速復(fù)溫，然后用1.5M(摩爾)和0.5M的蔗糖溶液0℃或室溫平衡10min，離心洗去凍存液，再用D-Hank’s液洗脫2次，最后用D-Hank’s液重新懸浮。按照實(shí)驗(yàn)要求調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度。
回收率測定細(xì)胞回收率的計算公式為回收率＝(洗脫后細(xì)胞數(shù)/洗脫前細(xì)胞數(shù))×100％結(jié)果實(shí)施例1至3的細(xì)胞回收率分別為84.68±5.42％，87.87±6.54％，86.58±7.11％。
2.玻璃化凍存液對胚胎神經(jīng)細(xì)胞存活率的影響測試前處理和玻璃化凍存與上述1相同。
存活率測定細(xì)胞存活率計算公式為存活率＝(洗脫后活細(xì)胞數(shù)/洗脫后細(xì)胞總數(shù))×100％結(jié)果實(shí)施例1至3的細(xì)胞存活率分別為79.87±6.48％，82.72±7.11％，80.27±6.21％。
3.玻璃化凍存液對胚胎神經(jīng)細(xì)胞琥珀酸脫氫酶(SDH)活性的影響測試前處理四唑鹽(MTT)比色法是一種快速、簡便的檢測細(xì)胞存活和生長的測定方法。活細(xì)胞中的線粒體能夠?qū)ⅫS綠色的MTT還原形成藍(lán)紫色的結(jié)晶(甲臜)沉積在細(xì)胞中，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定甲臜的含量以定量測定酶活性的變化。
將玻璃化凍存20d的大鼠胚胎神經(jīng)細(xì)胞，復(fù)溫洗脫凍存液后，加入到96孔培養(yǎng)板，每孔200μL，濃度為106個/mL。每孔加入20μL MTT(5mg/mL)，在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵化4h，使MTT充分被還原，棄上清液，加入100μL DMSO溶解MTT結(jié)晶，30min后用酶聯(lián)檢測儀測定570nm處吸光度(OD值)，比較甲臜值即細(xì)胞活性變化。該處理過程與背景技術(shù)的前處理過程相同。
結(jié)果實(shí)施例1至3的胚胎神經(jīng)細(xì)胞SDH活性分別為0.557±0.132，0.623±0.097，0.598±0.102。
4.玻璃化凍存液凍存后胚胎神經(jīng)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化測試前處理將凍存20d的胚胎神經(jīng)細(xì)胞洗脫凍存液后，經(jīng)2000r/min離心10min，棄上清，2.5％戊二醛固定1～2h，0.1M的磷酸緩沖液(pH7.2)洗滌3次，每次15min，再加入鋨酸固定1～4h，也用0.1M的磷酸緩沖液(pH7.2)洗滌3次，每次15min(以上各步均在冰浴中進(jìn)行)，然后在不同濃度丙酮溶液中進(jìn)行脫水，其順序?yàn)?0％→50％→70％→80％→90％→95％→100％→100％→100％(以上各步時間均為15min)，充分脫水后將樣品分為二部分。
一部分樣品放入醋酸異戊酯中置換20min，然后把樣品放入CO2臨界干燥儀中臨界點(diǎn)干燥，然后用離心濺射法鍍鉑，日立S-570掃描電鏡觀察。
另一部分樣品加入以1/2包埋劑和1/2脫水劑配成的滲透劑進(jìn)行滲透。然后將滲透完全的樣品注入包埋劑，在室溫聚合12～20h。再放入恒溫箱中37℃中聚合12h、45℃聚合12h，最后在60℃中聚合24h。樣品經(jīng)聚合后進(jìn)行切片，厚度為500-700，然后進(jìn)行染色。用2～7％醋酸鈾染40min，用雙蒸水洗3遍，再用檸檬酸鈾染12min，同樣用雙蒸水洗3遍。干燥后用日立-300透射電鏡觀察。該處理過程與背景技術(shù)的前處理過程相同。
結(jié)果實(shí)施例1至3的胚胎神經(jīng)細(xì)胞，從電鏡照片中可見，細(xì)胞膜和細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整，核膜平滑整齊，核孔清晰可見，核仁明顯，表明超微結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化。
權(quán)利要求
1.一種生物組織細(xì)胞玻璃化凍存液，其各成分的體積百分比中含有19.5-21.5的二甲基亞砜，其特征在于該凍存液中還含有14.5-16.5的乙酰胺，3.5-5.5的丙二醇，4.5-6.5的2，3-丁二醇，5-7的聚乙二醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物組織細(xì)胞玻璃化凍存液，其特征在于所述的聚乙二醇的分子量為6000。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種能夠保持深低溫凍存生物組織細(xì)胞活性的組合物質(zhì)。進(jìn)一步，涉及一種深低溫凍存生物組織細(xì)胞的玻璃化凍存液。所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種適合多種生物組織細(xì)胞深低溫凍存的玻璃化溶液，該溶液能有效保持冷凍后的生物組織細(xì)胞的活性，并具有配置簡單即不需昂貴的程序降溫儀、操作方便、價格低廉和容易推廣的特點(diǎn)。技術(shù)方案是生物組織細(xì)胞玻璃化凍存液，其各成分的體積百分比中含有19.5－21.5的二甲基亞砜，該凍存液中還含有14.5－16.5的乙酰胺，3.5－5.5的丙二醇，4.5－6.5的2，3－丁二醇，5－7的聚乙二醇。所述的聚乙二醇的分子量為6000。
文檔編號C12N5/06GK1670193SQ20051004910
公開日2005年9月21日 申請日期2005年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月5日
發(fā)明者胡軍祥, 姜玉新 申請人:胡軍祥, 姜玉新