專利名稱：有效提高西洋參懸浮細胞產(chǎn)量的生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物細胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)，特別是有效提高西洋參懸浮細胞產(chǎn)量的生產(chǎn)工藝。
背景技術(shù)：
我國作為中草藥的發(fā)源地，雖然中藥資源豐富，但蘊藏量有限。由于生態(tài)環(huán)境的破壞、無計劃的采伐和栽培技術(shù)等原因而致使珍稀瀕危藥用植物種類不斷增加。如80年代后期，甘草資源比50年代減少60％，麝香資源此50年代減少70％，其它如厚樸、杜仲、黃柏、麻黃、肉蓯蓉、松貝等資源的破壞也十分嚴重。所以供需矛盾日益加劇。
在植物組織培養(yǎng)研究中，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)細胞中含有各種特殊的代謝產(chǎn)物如生物堿、色素、甾體、萜類等藥用成分及香精等，其中有些是微生物和人工不能合成的，有些則是在整株植物含量甚微或本身資源就十分匱乏，而在培養(yǎng)的細胞中含量有時卻很高。因此，利用植物細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)有用代謝產(chǎn)物，已成為繼微生物技術(shù)以后當代生物技術(shù)重要的發(fā)展領(lǐng)域。
西洋參(Panax quinquefoiium)是五加科人參屬的一種名貴中藥材，其所含的西洋參皂甙是主要的藥理成份，具有健胃、強心、鎮(zhèn)定、降血糖和降血脂的功效，并有一定的防癌和抗衰老的作用。西洋參，最適生長于海拔1000米左右的山地闊葉林地帶。喜陰，宜斜射光和散射光，忌強光怕高溫，生長期最適宜溫度18℃～24℃要求栽培土層深厚，土質(zhì)為疏松、肥沃、腐殖質(zhì)含量豐富、透水性強的偏酸性的壤土或沙質(zhì)壤土。無論野生或是栽培的西洋參，由于其自身的生理特性，生長緩慢，一般需四至六年才能收獲入藥。它們的市場供需矛盾突出，價格昂貴，約1000元/kg。迄今為止其皂甙成分尚不能人工合成。因此，通過細胞培養(yǎng)方法大量生產(chǎn)西洋參皂甙，成為研究熱點。我國的鄭光植、方綺民、周立剛、原曉勇、張美萍等分別研究了西洋參細胞懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)條件，并測定了不同培養(yǎng)條件下懸浮培養(yǎng)物中有效成分的含量，為西洋參細胞培養(yǎng)的進一步研究提供了基礎(chǔ)。
目前，西洋參細胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)仍有不完善之處，缺乏適合大規(guī)模懸浮培養(yǎng)的高產(chǎn)、穩(wěn)定的細胞株，細胞懸浮培養(yǎng)工藝不完善，懸浮細胞培養(yǎng)水平及皂甙產(chǎn)量較低，使利用懸浮細胞培養(yǎng)技術(shù)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)西洋參皂甙受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種西洋參懸浮細胞大量生產(chǎn)工藝，以實現(xiàn)提高西洋參懸浮細胞的產(chǎn)量，降低工業(yè)化生產(chǎn)成本和增加有效物質(zhì)含量的目的。
本發(fā)明采用如下技術(shù)方案本發(fā)明所述的有效提高西洋參懸浮細胞產(chǎn)量的生產(chǎn)工藝，采用以下步驟(1)配制儲備液；儲備液的成分及含量如下


(2)配制培養(yǎng)液在已配制好的儲備液中加入去離子水稀釋18-22倍，再依次加入白糖、水解乳蛋白、2，4-二氯苯氧乙酸、α-萘乙酸、激動素和吲哚丁酸，，終濃度分別為1.5％-6％、0.3％-1％、0.5-1.5mg/L、0-0.5mg/L、0.2-1.0mg/L和0.2-1.0mg/L，然后調(diào)節(jié)pH值為5.5-6.5，充分攪拌后裝瓶，100ml-500ml三角瓶，裝液量為三角瓶容積的1/5-1/2。
(3)培養(yǎng)液滅菌密封瓶口，將溫度控制在115-122℃，壓力控制在1.0-1.2kg/cm2，滅菌20-30分鐘，培養(yǎng)液冷卻后備用。
(4)接種、培養(yǎng)制成的培養(yǎng)液中，在無菌條件下接入西洋參對數(shù)生長期的懸浮細胞，每升培養(yǎng)液接入15-50克鮮重的懸浮細胞，放入搖床中懸浮暗培養(yǎng)，接種后2-6天收集懸浮細胞，重新接種到新培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，每升培養(yǎng)液中接入15-50克鮮重的懸浮細胞，10-15天后補充培養(yǎng)液，補充量為培養(yǎng)體積的1/4-1/2，再培養(yǎng)5-10天，收獲細胞，提取西洋參皂甙。
本發(fā)明工藝接種后培養(yǎng)溫度控制在22-26℃，暗培養(yǎng)。
本發(fā)明工藝搖床轉(zhuǎn)速為90-150rpm。
本發(fā)明積極效果如下利用本發(fā)明工藝開展西洋參懸浮細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后，可使細胞生長量比接種量增長近15-30倍。比通常使用的懸浮細胞培養(yǎng)工藝，即接種后，在細胞培養(yǎng)過程中不換液，細胞生長量提高1-3倍。細胞的生長量(鮮重)可達到800g/L左右，細胞干重可達30g/L以上。
具體實施例方式
實施例1配制1000ml懸浮細胞培養(yǎng)液，pH5.5，分裝20個100ml三角瓶，每瓶30ml；分裝2瓶500ml三角瓶，每瓶200ml。高壓滅菌，壓力控制在1.0kg/cm2，120℃，20min。取對數(shù)期西洋參懸浮細胞接種到500ml培養(yǎng)瓶中，接種量為每升培養(yǎng)液接入15克鮮重的懸浮細胞，培養(yǎng)溫度24℃，搖床轉(zhuǎn)速90rpm，暗培養(yǎng)。4天后，無菌條件下收集懸浮細胞，再將懸浮細胞轉(zhuǎn)接到100ml三角瓶中，每升培養(yǎng)液接入15克鮮重的懸浮細胞，繼續(xù)培養(yǎng)15天，每瓶補充新培養(yǎng)液10ml，再培養(yǎng)5天，收獲細胞。平均每瓶收獲鮮細胞22.2g。
實施例2配制1000ml懸浮細胞培養(yǎng)液，pH6.0，分裝30個100ml三角瓶，每瓶30ml。高壓滅菌，壓力控制在1.1kg/cm2，115℃，22min。取對數(shù)期西洋參懸浮細胞分別接種到培養(yǎng)液中，每升培養(yǎng)液接入20克鮮重的懸浮細胞，接種15瓶。培養(yǎng)溫度22℃，搖床轉(zhuǎn)速100rpm，暗培養(yǎng)。2天后，無菌條件下分別收集細胞，再分別轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)液中，每升培養(yǎng)液接入20克鮮重的懸浮細胞，繼續(xù)培養(yǎng)10天，每瓶補充培養(yǎng)液7.8ml，再培養(yǎng)8天，收獲細胞。平均每瓶收獲鮮細胞15.9g。
實施例3配制1000ml懸浮細胞培養(yǎng)液，pH6.5，分裝20個100ml三角瓶，每瓶30ml；分裝2瓶500ml三角瓶，每瓶200ml。高壓滅菌，壓力控制在1.2kg/cm2，122℃，30min。取對數(shù)期西洋參懸浮細胞接種到500ml培養(yǎng)瓶中，每升培養(yǎng)液接入30克鮮重的懸浮細胞，培養(yǎng)溫度26℃，搖床轉(zhuǎn)速150rpm，暗培養(yǎng)。6天后，無菌條件下收集懸浮細胞，再將懸浮細胞轉(zhuǎn)接到100ml三角瓶中，每升培養(yǎng)液接入30克鮮重的懸浮細胞，繼續(xù)培養(yǎng)10天，每瓶補充培養(yǎng)液12ml，再培養(yǎng)10天，收獲細胞。平均每瓶收獲鮮細胞27.0g。
實施例4配制1000ml懸浮細胞培養(yǎng)液，pH6.0，分裝20個100ml三角瓶，每瓶30ml；分裝2瓶500ml三角瓶，每瓶200ml。高壓滅菌，120℃，20min。取對數(shù)期西洋參懸浮細胞接種到500ml培養(yǎng)瓶中，每升培養(yǎng)液接入50克鮮重的懸浮細胞，培養(yǎng)溫度24℃，搖床轉(zhuǎn)速90rpm，暗培養(yǎng)。5天后，無菌條件下收集懸浮細胞，再將懸浮細胞轉(zhuǎn)接到100ml三角瓶中，每升培養(yǎng)液接入50克鮮重的懸浮細胞，，繼續(xù)培養(yǎng)10天，每瓶補充培養(yǎng)液10ml，再培養(yǎng)5天，收獲細胞。平均每瓶收獲鮮細胞16.1g。
權(quán)利要求
1.一種有效提高西洋參懸浮細胞產(chǎn)量的生產(chǎn)工藝，其特征在于采用以下步驟(1)配制儲備液；(2)配制培養(yǎng)液在已配制好的儲備液中加入去離子水稀釋18-22倍，再依次加入白糖、水解乳蛋白、2，4-二氯苯氧乙酸、α-萘乙酸、激動素和吲哚丁酸，，終濃度分別為1.5％-6％、0.3％-1％、0.5-1.5mg/L、0-0.5mg/L、0.2-1.0mg/L和0.2-1.0mg/L，然后調(diào)節(jié)pH值為5.5-6.5，充分攪拌后裝瓶，100ml-500ml三角瓶，裝液量為三角瓶容積的1/5-1/2。(3)培養(yǎng)液滅菌密封瓶口，將溫度控制在115-122℃，壓力控制在1.0-1.2kg/cm2，滅菌20-30分鐘，培養(yǎng)液冷卻后備用。(4)接種、培養(yǎng)制成的培養(yǎng)液中，在無菌條件下接入西洋參對數(shù)生長期的懸浮細胞，每升培養(yǎng)液接入15-50克鮮重的懸浮細胞，放入搖床中懸浮暗培養(yǎng)，接種后2-6天收集懸浮細胞，重新接種到新培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，每升培養(yǎng)液中接入15-50克鮮重的懸浮細胞，10-15天后補充培養(yǎng)液，補充量為培養(yǎng)體積的10％-30％，再培養(yǎng)5-10天，收獲細胞，提取西洋參人參皂甙。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種有效提高西洋參懸浮細胞產(chǎn)量的生產(chǎn)工藝，其特征在于儲備液的成分及含量如下
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種有效提高西洋參懸浮細胞產(chǎn)量的生產(chǎn)工藝，其特征在于接種后培養(yǎng)溫度控制在22-26℃暗培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種有效提高西洋參懸浮細胞產(chǎn)量的生產(chǎn)工藝，其特征在于搖床轉(zhuǎn)速為90-150rpm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高西洋參懸浮細胞生長量的簡易生產(chǎn)工藝，該工藝包括以下步驟配制儲備液，裝瓶，滅菌，制成液體培養(yǎng)基，在無菌條件下接入西洋參對數(shù)生長期的懸浮細胞，放入搖床中懸浮暗培養(yǎng)，接種后2－6天，收集懸浮細胞，10－15天后補料，再培養(yǎng)5－10天，收獲細胞，提取西洋參人參皂甙，利用該工藝，可使細胞生長量增長近20倍，比對照提高1－3倍，懸浮細胞的生長量可達500－850g/L。
文檔編號C12N5/04GK1800365SQ200510048269
公開日2006年7月12日 申請日期2005年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月31日
發(fā)明者閆靜輝, 李書生, 張小兵, 李亞璞, 李春生, 吳萌, 陳英珠, 程華, 韓廣彥, 籍寶霞, 陳瑞芹, 辛春艷 申請人:河北省生物研究所