專(zhuān)利名稱(chēng)：利用酵母表達(dá)、生產(chǎn)及糖基化改造人干擾素－β的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用基因工程技術(shù)生產(chǎn)干擾素的方法，尤其涉及利用酵母表達(dá)、生產(chǎn)及對(duì)人干擾素-β進(jìn)行糖基化改造的方法。
背景技術(shù)：
干擾素β(interferonβ，簡(jiǎn)稱(chēng)IFNβ)是由成纖維細(xì)胞受病毒感染或誘生劑誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子，具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)和抗增殖的作用。
以往所用的干擾素是采用特定的誘生劑誘導(dǎo)人白細(xì)胞，經(jīng)提取后制成，此為血源性干擾素。血源性干擾素容易被全血中的病毒污染，從而威脅使用者的健康；并且血源性干擾素提取純度低，比活性低，生產(chǎn)成本高。
與傳統(tǒng)方法相比，用基因工程技術(shù)生產(chǎn)干擾素的成本比血制品下降約1萬(wàn)倍。并具有無(wú)污染、安全性高、純度高、比活性高、成本低、療效確切等優(yōu)點(diǎn)。
目前生產(chǎn)、使用的IFNβ產(chǎn)品有三種(1)天然人IFNβ，由刺激后的人成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，但這種方法產(chǎn)生的干擾素易受全血病毒的感染，且提出純度低、活性低、生產(chǎn)成本高，限制了在臨床上的使用。(2)大腸桿菌表達(dá)的重組突變型IFNβ，其肽鏈N端第17位的半胱氨酸被替換為絲氨酸，該蛋白是非糖基化蛋白，1993年美國(guó)FDA批準(zhǔn)Chiron公司的Betaseron上市銷(xiāo)售，主要用于治療多發(fā)性硬化癥。(3)瑞士雪蘭諾公司生產(chǎn)的干擾素β-1a(商品名Rebif)，由CHO產(chǎn)生，其氨基酸序列與人IFNβ完全一致，為天然形式的糖基化蛋白。
最近十多年來(lái)，酵母作為一個(gè)基因工程表達(dá)系統(tǒng)受到廣泛研究和應(yīng)用。但是酵母細(xì)胞內(nèi)的糖基化過(guò)程與高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的糖基化有一定的差別。酵母細(xì)胞內(nèi)的糖基化主要為高甘露糖性糖基化，并存在過(guò)糖基化現(xiàn)象。具有酵母糖基化的蛋白作為治療藥物，在人體內(nèi)常常具有抗原性，研究表明此抗原性是由酵母細(xì)胞內(nèi)的糖基化過(guò)程與高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的糖基化差異引起的。另外，在畢赤酵母表達(dá)體系表達(dá)異源蛋白一般存在過(guò)糖基化現(xiàn)象，蛋白的高度糖基化可以使一些外源蛋白(如酶)降低酶活，甚至喪失酶活。常常表達(dá)出無(wú)功能蛋白。
國(guó)內(nèi)市場(chǎng)目前還沒(méi)有我國(guó)自行研制并擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的IFNβ產(chǎn)品。利用酵母表達(dá)、生產(chǎn)及糖基化改造人干擾素-β的工作至今未見(jiàn)報(bào)道。
本項(xiàng)目通過(guò)利用畢赤酵母(Picha pastoris)生產(chǎn)干擾素β，并利用外切糖苷酶如N-糖酰安酶(Peptide-N-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase(PNGase，EC3.5.1.52)對(duì)其糖鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，使生產(chǎn)出的人干擾素β蛋白沒(méi)有免疫原性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是獲得一個(gè)既具有真核生物的蛋白翻譯后修飾和加工，又不具有抗原性的干擾素β蛋白。本發(fā)明提供了一種利用酵母表達(dá)、生產(chǎn)人干擾素-β并對(duì)其進(jìn)行糖基化改造的方法。
本發(fā)明涉及的利用酵母表達(dá)、生產(chǎn)及糖基化改造人干擾素-β，由下述步驟組成；(1)重組表達(dá)載體的構(gòu)建克隆出人IFNβ基因，通過(guò)PCR方法將IFNβ基因起始密碼子ATG前增加KR＝AAAAGA序列，以提高Kex2蛋白酶的酶切作用，避免畢赤酵母分泌表達(dá)外源基因時(shí)存在信號(hào)肽切割不完全，使重組蛋白N端帶有信號(hào)肽氨基酸序列的情況。同時(shí)末端Arg的堿基CGA設(shè)計(jì)為畢赤酵母喜好密碼子AGA，以提高IFNβ在畢赤酵母中的表達(dá)。完成分子水平基因改造后將基因構(gòu)建到酵母表達(dá)載體中。
干擾素β基因，基因庫(kù)Genbank[gi50593016]。
(2)重組酵母菌株的轉(zhuǎn)化用SalI將重組載體pPIC9kIFNβ線性化；電轉(zhuǎn)到酵母菌株基因組中，構(gòu)建重組酵母菌株；在MD平板上長(zhǎng)出的菌落為陽(yáng)性克??；其中，MD平板培養(yǎng)基配方為13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖；通過(guò)G418抗生素篩選出高拷貝的陽(yáng)性菌株。
(3)人干擾素-β蛋白在酵母中誘導(dǎo)表達(dá)將上述陽(yáng)性菌株，接種于YPD培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)12-24小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為230-270轉(zhuǎn)/分；當(dāng)發(fā)酵液濃度達(dá)OD＝5-6時(shí)，按體積比1∶100的接種量轉(zhuǎn)接到BMG培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速為240-270轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)28～35小時(shí)；5000g離心5～10分鐘，收集菌體，用PBS洗滌菌體1～2次，轉(zhuǎn)接到BMM液體培養(yǎng)基中，使發(fā)酵液濃度達(dá)OD＝0.5-1.0時(shí)，誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)溫度20-30℃，搖床轉(zhuǎn)速為180-250轉(zhuǎn)/分，每隔12小時(shí)向培養(yǎng)基中加入5～10ml/L量的甲醇，培養(yǎng)24-96小時(shí)。
其中PBS為pH6.0，100mM磷酸鹽緩沖液；其中YPD培養(yǎng)基配方為10g/L酵母粉；20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖；其中BMG培養(yǎng)基配方為pH6.0，100mM磷酸鹽緩沖液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L；其中BMM液體培養(yǎng)基配方為pH6.0，100mM磷酸鹽緩沖液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L；其中，上述重組陽(yáng)性克隆工程菌株可以通過(guò)離心、過(guò)濾去除。
(4)重組蛋白提取及純化選用藍(lán)譜(blue sepharose 6 fast flow affinity chromatography column)，直接將酵母菌株的上清液進(jìn)行重組蛋白的純化。
(5)對(duì)重組蛋白進(jìn)行表面糖鏈的改造選用外切糖苷酶如N-糖酰胺酶(Peptide-N-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagineamidase(PNGase，EC 3.5.1.52)對(duì)所得重組蛋白進(jìn)行糖基化改造。
步驟(1)所述的IFNβ是具有IFNβ活性的干擾素β類(lèi)似物。
優(yōu)選的，步驟(1)所述的酵母表達(dá)載體為pPIC9k、pA0815、pPIC3.5k、pPIC9等酵母表達(dá)載體及在此基礎(chǔ)上改造后的表達(dá)載體。
優(yōu)選的，步驟(2)所述的電轉(zhuǎn)條件是1.5Kv；25μF。
優(yōu)選的，步驟(2)所述的酵母菌株是甲醇營(yíng)養(yǎng)酵母菌株——畢赤酵母Gs115。
優(yōu)選的，步驟(3)所述誘導(dǎo)溫度是20℃，搖床轉(zhuǎn)速為230轉(zhuǎn)/分。每隔12小時(shí)向培養(yǎng)基加甲醇的量為8ml/L。
優(yōu)選的，步驟(5)所述外切糖苷酶可以是N-糖酰胺酶(Peptide-N-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase(PNGase，EC 3.5.1.52)。更優(yōu)選的，所述N-糖酰胺酶(Peptide-N-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase(PNGase，EC 3.5.1.52)為PNG1或PNGaseF。
本發(fā)明涉及的利用酵母表達(dá)、生產(chǎn)及糖基化改造人干擾素-β方法，通過(guò)重組酵母菌株表達(dá)的人干擾素-β蛋白具有真核翻譯修飾后加工過(guò)程，與天然的人干擾素-β蛋白相比具有相同的構(gòu)象，只是去掉了糖鏈，作為治療藥物在人體內(nèi)不具有抗原性，但具有生物活性。


圖1是實(shí)施例1的重組酵母菌株的PCR篩選電泳圖。1DNA分子量標(biāo)記五(marker)；2陰性對(duì)照(以GS115為模板)；3陽(yáng)性對(duì)照(以轉(zhuǎn)化前質(zhì)粒為模板)；4-8所挑單克隆，沸水煮20min，離心，取上清作模板PCR.
圖2是實(shí)施例1的重組酵母菌株中誘導(dǎo)表達(dá)IFNβ的SDS-PAGE電泳圖。
1藍(lán)譜(blue sepharose Fast Flow)純化rHuIFNβ；2-596h，72h，48h，24h收集上清；6低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)記物(marker).
圖3是實(shí)施例1的重組酵母菌株中誘導(dǎo)表達(dá)IFNβ的Western-blot檢測(cè)圖。證實(shí)所表達(dá)的蛋白是IFNβ。1pPIC9k-GS115表達(dá)上清液；2IFNβ-pPIC9k-GS115表達(dá)上清液.
圖4是實(shí)施例1的純化后IFNβ蛋白經(jīng)PNG1消化后的SDS-PAGE分析，重組干擾素β蛋白的糖鏈部分完全被切除。1PNG1消化IFNβ(箭頭所指為PNG1酶)；2-3純化IFNβ；4低分子量蛋白質(zhì)marker.
表1是實(shí)施例1的純化后IFNβ蛋白經(jīng)PNG1消化后的生物活性檢測(cè)分析。
對(duì)純化的IFNβ及PNG1酶糖鏈修飾后的IFNβ通過(guò)細(xì)胞病變法分別進(jìn)行生物活性檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如下表所示。結(jié)果表明，糖苷酶修飾后的重組干擾素β蛋白也具有生物活性。
表1.生物活性檢測(cè)結(jié)果

具體實(shí)施方式
下列實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。
實(shí)施例1利用N-糖酰胺酶PNG1對(duì)畢赤酵母菌株中表達(dá)生產(chǎn)的人干擾素-β進(jìn)行糖基化改造。
1、材料PNG1Genbank[gi50593503]，干擾素β基因Genbank[gi50593016]、pPIC9K載體(Invitrogen Ltd.)、畢赤氏酵母GS115菌株(Invitrogen Ltd.)2、方法(1)重組表達(dá)載體的構(gòu)建克隆出人IFNβ基因，通過(guò)PCR方法將IFNβ基因起始密碼子ATG前增加KR＝AAAAGA序列，以提高Kex2蛋白酶的酶切作用，避免畢赤酵母分泌表達(dá)外源基因時(shí)存在信號(hào)肽切割不完全，使重組蛋白N端帶有信號(hào)肽氨基酸序列的情況。同時(shí)末端Arg的堿基CGA設(shè)計(jì)為畢赤酵母喜好密碼子AGA，以提高IFNβ在畢赤酵母中的表達(dá)。完成分子水平基因改造后將基因構(gòu)建到畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9k中。得重組表達(dá)載體pPIC9kIFNβ。
(2)重組酵母菌株的轉(zhuǎn)化用SalI將重組載體pPIC9kIFNβ線性化；電轉(zhuǎn)到酵母菌株基因組中，構(gòu)建重組酵母菌株；電轉(zhuǎn)條件1.5Kv；25μF，在MD平板上長(zhǎng)出的菌落為陽(yáng)性克??；其中，MD平板培養(yǎng)基配方為13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖；通過(guò)G418抗生素篩選出高拷貝的陽(yáng)性菌株。篩選電泳圖見(jiàn)圖1。
(3)人干擾素-β蛋白在酵母中誘導(dǎo)表達(dá)將上述陽(yáng)性菌株，接種于YPD培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)12-24小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為240-270轉(zhuǎn)/分；當(dāng)發(fā)酵液濃度達(dá)OD＝5-6時(shí)，按體積比1∶100的接種量轉(zhuǎn)接到BMG培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速為240-270轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)28～35小時(shí)；5000g離心5～10分鐘，收集菌體，用PBS洗滌菌體1～2次，轉(zhuǎn)接到BMM液體培養(yǎng)基中，使發(fā)酵液濃度達(dá)OD＝0.5-1.0時(shí)，誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)溫度20℃，搖床轉(zhuǎn)速為230轉(zhuǎn)/分，每隔12小時(shí)向培養(yǎng)基中加入5～10ml/L量的甲醇，培養(yǎng)36-60小時(shí)。
其中PBS為pH6.0，100mM磷酸鹽緩沖液；其中YPD培養(yǎng)基配方為10g/L酵母粉；20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖；其中BMG培養(yǎng)基配方為pH6.0，100nM磷酸鹽緩沖液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L；其中BMM液體培養(yǎng)基配方為pH6.0，100mM磷酸鹽緩沖液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L；其中，上述重組陽(yáng)性克隆工程菌株可以通過(guò)離心、過(guò)濾去除。
重組酵母菌株中誘導(dǎo)表達(dá)IFNβ的SDS-PAGE電泳圖，見(jiàn)圖2。
重組酵母菌株中誘導(dǎo)表達(dá)IFNβ的Western-blot檢測(cè)圖，見(jiàn)圖3。證實(shí)所表達(dá)的蛋白是IFNβ。
(4)重組蛋白提取及純化選用藍(lán)譜(blue sepharose 6 fast flow affinity chromatography column)，直接將酵母菌株的上清液進(jìn)行重組蛋白的純化。純化后IFNβ蛋白經(jīng)PNG1消化后的SDS-PAGE分析見(jiàn)圖4。
(5)對(duì)重組蛋白進(jìn)行表面糖鏈的改造選用PNG1對(duì)所得重組蛋白進(jìn)行糖基化改造。酶反應(yīng)條件為適量PNG1酶及純化干擾素凍干粉，40mMMES-NaOH緩沖液，pH6.6，10mMDTT共100μl反應(yīng)體系于30℃2小時(shí)。SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，重組干擾素β蛋白的糖鏈部分被完全切除?；钚詸z測(cè)表明切除糖鏈后的重組干擾素β蛋白具有生物活性(見(jiàn)表1)。
實(shí)施例2如實(shí)施例1所述，所不同的是步驟(1)所述的酵母表達(dá)載體為pA0815，得重組表達(dá)載體pA0815IFNβ。步驟(5)所述外切糖苷酶是PNGaseF。
權(quán)利要求
1.一種利用酵母表達(dá)、生產(chǎn)及糖基化改造人干擾素-β的方法，由下述步驟組成(1)重組表達(dá)載體的構(gòu)建克隆出人IFNβ基因，通過(guò)PCR方法將IFNβ基因起始密碼子ATG前增加KR＝AAAAGA序列，以提高Kex2蛋白酶的酶切作用，避免畢赤酵母分泌表達(dá)外源基因時(shí)存在信號(hào)肽切割不完全，使重組蛋白N端帶有信號(hào)肽氨基酸序列的情況；同時(shí)末端Arg的堿基CGA設(shè)計(jì)為畢赤酵母喜好密碼子AGA，以提高IFNβ在畢赤酵母中的表達(dá)；完成分子水平基因改造后將基因構(gòu)建到酵母表達(dá)載體中，得重組表達(dá)載體；(2)重組酵母菌株的構(gòu)建用SalI將重組載體pPIC9kIFNβ線性化；電轉(zhuǎn)到酵母菌株基因組中，構(gòu)建重組酵母菌株；在MD平板上長(zhǎng)出的菌落為陽(yáng)性克??；其中，MD平板培養(yǎng)基配方為13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖；通過(guò)G418抗生素篩選出高拷貝的陽(yáng)性菌株；(3)人干擾素-β蛋白在酵母中誘導(dǎo)表達(dá)將上述陽(yáng)性菌株，接種于YPD培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)12-24小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為240-270轉(zhuǎn)/分；當(dāng)發(fā)酵液濃度達(dá)OD＝5-6時(shí)，按體積比1∶100的接種量轉(zhuǎn)接到BMG培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速為240-270轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)28～35小時(shí)；5000g離心5～10分鐘，收集菌體，用PBS洗滌菌體1～2次，轉(zhuǎn)接到BMM液體培養(yǎng)基中，使發(fā)酵液濃度達(dá)OD＝0.5-1.0時(shí)，誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)溫度20℃-30℃，搖床轉(zhuǎn)速為180-250轉(zhuǎn)/分，每隔12小時(shí)向培養(yǎng)基中加入5～10ml/L量的甲醇，培養(yǎng)24-96小時(shí)；其中PBS為pH6.0，100mM磷酸鹽緩沖液；其中YPD培養(yǎng)基配方為10g/L酵母粉；20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖；其中BMG培養(yǎng)基配方為pH6.0，100mM磷酸鹽緩沖液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L；其中BMM液體培養(yǎng)基配方為pH6.0，100mM磷酸鹽緩沖液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L；其中，上述重組陽(yáng)性克隆工程菌株可以通過(guò)離心、過(guò)濾去除；(4)重組蛋白提取及純化選用藍(lán)譜直接將酵母菌株的上清液進(jìn)行重組蛋白的純化；(5)對(duì)重組蛋白進(jìn)行表面糖鏈的改造選用外切糖苷酶對(duì)所得重組蛋白進(jìn)行糖基化改造；在一定的酶反應(yīng)條件下切除重組干擾素β蛋白的糖鏈部分。
2.如權(quán)利要求1所述的利用酵母表達(dá)、生產(chǎn)及糖基化改造人干擾素-β的方法，其特征是，步驟(1)所述的IFNβ是具有IFNβ活性的干擾素β類(lèi)似物。
3.如權(quán)利要求1所述的利用酵母表達(dá)、生產(chǎn)及糖基化改造人干擾素-β的方法，其特征是，步驟(1)所述的酵母表達(dá)載體為pPIC9k、pAO815、pPIC3.5k或pPIC9酵母表達(dá)載體及在此基礎(chǔ)上改造后的表達(dá)載體。
4.如權(quán)利要求1所述的利用酵母表達(dá)、生產(chǎn)及糖基化改造人干擾素-β的方法，其特征是，步驟(2)所述的電轉(zhuǎn)條件是1.5Kv；25μF。
5.如權(quán)利要求1所述的利用酵母表達(dá)、生產(chǎn)及糖基化改造人干擾素-β的方法，其特征是，步驟(2)所述的酵母菌株是甲醇營(yíng)養(yǎng)酵母菌株——畢赤酵母Gs115。
6.如權(quán)利要求1所述的利用酵母表達(dá)、生產(chǎn)及糖基化改造人干擾素-β的方法，其特征是，步驟(3)所述誘導(dǎo)溫度是20℃，搖床轉(zhuǎn)速為230轉(zhuǎn)/分，每隔12小時(shí)向培養(yǎng)基加甲醇的量為8ml/L。
7.如權(quán)利要求1所述的利用酵母表達(dá)、生產(chǎn)及糖基化改造人干擾素-β的方法，其特征是，步驟(5)所述外切糖苷酶是N-糖酰胺酶。
8.如權(quán)利要求9所述的利用酵母表達(dá)、生產(chǎn)及糖基化改造人干擾素-β的方法，其特征是，所述N-糖酰胺酶為PNG1或PNGaseF。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用酵母表達(dá)、生產(chǎn)及糖基化改造人干擾素－β的方法。本發(fā)明應(yīng)用重組DNA技術(shù)在甲醇酵母細(xì)胞如巴斯德畢赤酵母細(xì)胞中生產(chǎn)基因重組人干擾素β并進(jìn)行糖基化改造的方法，獲得既具有真核生物的蛋白翻譯后修飾和加工，又不具有抗原性的干擾素β蛋白。本發(fā)明還涉及適合甲醇酵母表達(dá)的人干擾素β改構(gòu)基因的設(shè)計(jì)；表達(dá)載體的構(gòu)建；基因組中至少穩(wěn)定地整合有一個(gè)拷貝改構(gòu)干擾素β基因的甲醇酵母工程菌；工程菌的基因表達(dá)；糖基化改造等方面。本發(fā)明方法可實(shí)現(xiàn)干擾素β高效表達(dá)及糖鏈改造，且分離工藝簡(jiǎn)便。所產(chǎn)生的干擾素β不具有酵母蛋白的N－糖基化，若作為蛋白藥物不會(huì)在人體內(nèi)產(chǎn)生免疫源性；也不會(huì)因?yàn)檫^(guò)糖基化使表達(dá)蛋白失去活性。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1793324SQ20051004520
公開(kāi)日2006年6月28日 申請(qǐng)日期2005年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月25日
發(fā)明者陳敏, 王慶杰, 王鵬 申請(qǐng)人:山東大學(xué)