專利名稱：一種永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞系及其建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)學(xué)科人類和哺乳動(dòng)物細(xì)胞(組織)工程領(lǐng)域，涉及體外分離、純化、鑒定、基因轉(zhuǎn)染、永生化及多向誘導(dǎo)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，特別涉及一種永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞系及其建立方法。
背景技術(shù)：
由于某種因素如外傷、感染、腫瘤等而使骨喪失了一些或一段骨質(zhì)，形成較大的間隙，稱為骨缺損，絕大多數(shù)骨缺損都難以愈合，最后形成骨不連。由于缺損間隙大，成骨細(xì)胞難以爬過間隙而不能發(fā)生正常的愈合過程，僅由纖維組織充填。為此，許多學(xué)者進(jìn)行了相關(guān)的研究，取得了一些成績(jī)，但是對(duì)于大段的骨缺損，仍然是矯形外科的難題。近年來(lái)，隨著科學(xué)技術(shù)迅速發(fā)展，骨缺損的修復(fù)進(jìn)入組織工程學(xué)修復(fù)研究時(shí)代的轉(zhuǎn)變。種子細(xì)胞、支架材料、生長(zhǎng)因子是組織工程的三要素。目前，作為骨組織工程的種子細(xì)胞有4種來(lái)源骨、骨外膜、骨髓和骨外組織。比較而言，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Stromal Stem Cells，BMSCss)來(lái)源不受限，取材方便，對(duì)供體損傷小，易于分離培養(yǎng)，體外增殖能力強(qiáng)，大量傳代培養(yǎng)后仍具有成骨能力，目前在臨床骨缺損的修復(fù)中占有重要的地位。而且BMSCs作為其它非組織工程的種子細(xì)胞也具有廣闊前景，許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)BMSCs具有成體干細(xì)胞特性，表現(xiàn)為較強(qiáng)的增殖能力和向多種間充質(zhì)細(xì)胞分化的潛能。不但在骨組織工程，在其他組織工程研究中也占有重要地位。
目前，對(duì)BMSCs及其在組織工程方面的研究雖已取得了很大的進(jìn)展，但該領(lǐng)域的研究尚處于探索階段，以下問題有待解決。
(1)對(duì)BMSCs本身特性的研究和在骨組織工程方面的利用研究，都希望利用純的干細(xì)胞成分，但實(shí)驗(yàn)證明體外的BMSCs均為各種細(xì)胞的混雜。如何才能有效地獲得純的BMSCs，有待于對(duì)BMSCs的細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)和分化各階段細(xì)胞標(biāo)志物的研究。
(2)BMSCs的增殖、分化的控制需要合適的條件。如何使既控制增殖，避免成腫瘤，又能在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候啟動(dòng)沿所需路徑的分化，還有待進(jìn)一步研究。
(3)BMSCs間相互作用、與造血干細(xì)胞間相互作用、與不同成熟階段的細(xì)胞的相互作用直接對(duì)其生長(zhǎng)、分化產(chǎn)生影響，但目前這些作用的機(jī)制還不清楚。
(4)對(duì)BMSCs在各種力學(xué)條件下的改變還知之甚少，而BMSCs在骨髓中及用于骨組織工程顯然要受到周圍環(huán)境力的作用。對(duì)這方面的研究將促進(jìn)對(duì)BMSCs全面了解和有效利用。
(5)BMSCs在體外培養(yǎng)存在細(xì)胞老化問題，并由此限制了可獲得的細(xì)胞數(shù)量，無(wú)法達(dá)到組織工程的要求。
(6)目前的骨組織工程研究中，已證實(shí)BMSCs能與多種材料相容生長(zhǎng)并在體內(nèi)成骨。但這些材料自身的缺陷使得人們不斷嘗試使用新的載體材料。如何促進(jìn)BMSCs與理想材料相容生長(zhǎng)并成骨將是今后骨組織工程研究的重要方面。
綜上所述，目前人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞還沒有完全定性，它的的分離、純化及擴(kuò)增方法均處于探索中，獲得的人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞鑒定結(jié)果也不盡一致，世界范圍內(nèi)還沒有已建立人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞系的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞系及其建立方法，為研究人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)行為提供標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系，為組織工程基礎(chǔ)研究提供平臺(tái)，為臨床應(yīng)用提供足量種子細(xì)胞，并為建立人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞系提供一種有效、可靠的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是設(shè)計(jì)一種永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞系，原代人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于正常流產(chǎn)胎兒骨髓組織.其特征在于，該永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞系體外培養(yǎng)能無(wú)限克隆，但不具備轉(zhuǎn)化細(xì)胞或癌細(xì)胞的特征，在細(xì)胞生物學(xué)特征上是正常細(xì)胞，且具有多向分化潛能；具體包括1)形態(tài)特征 H.E染色，永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞完全貼壁后呈纖維樣或多角型，核多為圓形。電鏡顯示，細(xì)胞核質(zhì)比大，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器發(fā)達(dá)，屬生長(zhǎng)旺盛的成纖維樣細(xì)胞；2)生長(zhǎng)特性 細(xì)胞數(shù)較少時(shí)，可見典型的單克隆生長(zhǎng)方式；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至75％融合時(shí)，呈纖維樣。生長(zhǎng)曲線表明，細(xì)胞接種1～2天生長(zhǎng)緩慢，3～5天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞倍增時(shí)間為40.08小時(shí)。從細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及1年以上擴(kuò)增細(xì)胞生長(zhǎng)情況看，該細(xì)胞系為永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞系；3)流式細(xì)胞分析特征 永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)CD29，CD44，CD106，不表達(dá)CD14，CD34，CD45，HLA-DR分子。從mRNA和蛋白表達(dá)水平證實(shí)本研究獲得的永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞系并非造血細(xì)胞；4)染色體核型分析 傳至112代的人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞染色體數(shù)目為2n＝46，其中，中部著絲粒染色體有5對(duì)，臂比值為1.33±0.02～1.07±0.03；亞中部著絲粒染色體有7對(duì)，臂比值為3.18±0.03～1.45±0.07；端部著絲粒染色體有6對(duì)，小染色體有4對(duì)，性染色體1對(duì)，染色體核型正常；
5)生物學(xué)特征 體外連續(xù)培養(yǎng)過程中，永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞具有克隆形成能力，無(wú)裸鼠致瘤性，在軟瓊脂內(nèi)不能生長(zhǎng)，血清依賴性無(wú)顯著降低，仍具有接觸抑制性。不具備轉(zhuǎn)化細(xì)胞或癌細(xì)胞的特征，是正常細(xì)胞；6)成體干細(xì)胞特征 永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞可以定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞以及心肌細(xì)胞，具備成體干細(xì)胞的特性；所述的人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的獲取包括以下步驟1)分離培養(yǎng)原代人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞無(wú)菌采取6～8月齡正常流產(chǎn)胎兒雙側(cè)股骨、肱骨、脛骨骨髓，PBS沖洗髓腔；Percoll細(xì)胞分離液分離細(xì)胞，DMEM低糖培養(yǎng)基(DMEM-L)+10％Hyclone胎牛血清為基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)，獲得原代呈成纖維樣細(xì)胞。
2)純化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞0.25％胰酶消化原代細(xì)胞并傳代，用有限稀釋法獲得純化的單細(xì)胞克隆生長(zhǎng)的人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。
所述的永生化是通過導(dǎo)入外源性人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(Human telomerase reversetranscriptase，hTERT)激活端粒酶而得到的參考文獻(xiàn)J.薩姆布魯克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯，等著。金冬雁，黎孟楓，等譯。分子克隆實(shí)驗(yàn)指南。北京科學(xué)出版社。2002年，第三版1276-1282。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將編碼hTERT和neo基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pCIneo-hTERT導(dǎo)入單克隆培養(yǎng)的人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。在24孔板內(nèi)利用脂質(zhì)體LipofectAMINE 2000將pCIneo-hTERT導(dǎo)入BMSCs-2細(xì)胞，24小時(shí)后1∶10傳代細(xì)胞，72小時(shí)后G418 200μg/mL加壓篩選，10d后100μg/mL，20天左右出現(xiàn)明顯抗性克隆。挑選27個(gè)克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，其中8個(gè)克隆的細(xì)胞可以擴(kuò)大至培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)長(zhǎng)期培養(yǎng)。體外連續(xù)培養(yǎng)3個(gè)月時(shí)，克隆3、8在培養(yǎng)中污染；克隆1、6、7細(xì)胞發(fā)生衰老死亡，可能是細(xì)胞僅渡過了細(xì)胞增長(zhǎng)的M1期，延緩了衰老；克隆2、4、5生長(zhǎng)良好，同時(shí)渡過了細(xì)胞增長(zhǎng)的M1、M2期，得以永生化。3個(gè)克隆的細(xì)胞給予保存，克隆2繼續(xù)培養(yǎng)，至今在體外已連續(xù)傳代179PDs(Population doubles，細(xì)胞一分為二為一個(gè)PDs)，命名為MSCxj細(xì)胞系。
所述的經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，細(xì)胞表達(dá)CD29，CD44，CD106，不表達(dá)CD34，CD45，CD14，HLA-DR分子。
所述的具有成體干細(xì)胞特性經(jīng)條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)24天，可以分化為成骨、軟骨、心肌樣細(xì)胞。成骨誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基加地塞米松、β-甘油磷酸、維生素C，終濃度分別為10-8mol/L，50mg/L，10mmol/L；軟骨誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基加地塞米松、TGF-β、維生素C，終濃度分別為10-8mol/L，5ug/L，10mmol/L；心肌細(xì)胞誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基加3umol/L 5-氮胞苷?；A(chǔ)培養(yǎng)基DMEM-L+10％Hyclone胎牛血清。
所述的具備正常細(xì)胞的生物學(xué)特性是不具備以往導(dǎo)入病毒基因等所建立的細(xì)胞所特有的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的特征。比如，永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞有克隆形成能力，不具備裸鼠致瘤性，無(wú)懸浮生長(zhǎng)能力，具有血清依賴性，因此不具備轉(zhuǎn)化細(xì)胞的特征，是正常細(xì)胞。
本發(fā)明特點(diǎn)如下1.永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞系經(jīng)多種方法鑒定，本發(fā)明分離、克隆、轉(zhuǎn)染hTERT基因的永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞系具有以下特征1.1形態(tài)特征 H.E染色如圖1所示，永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞完全貼壁后呈纖維樣或多角型，核多為圓形。電鏡顯示如圖2所示，細(xì)胞核質(zhì)比大，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器發(fā)達(dá)，屬生長(zhǎng)旺盛的成纖維樣細(xì)胞。
1.2生長(zhǎng)特性 細(xì)胞數(shù)較少時(shí)，可見典型的單克隆生長(zhǎng)方式；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至75％融合時(shí)，呈纖維樣。生長(zhǎng)曲線表明如圖3所示，細(xì)胞接種1～2天生長(zhǎng)緩慢，3～5天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞倍增時(shí)間為40.08h。從細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及1年以上擴(kuò)增細(xì)胞生長(zhǎng)情況看，該細(xì)胞系為永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞系。
1.3流式細(xì)胞分析特征 永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)CD29，CD44，CD106，不表達(dá)CD34，CD45，CD14，HLA-DR分子如圖4所示。從細(xì)胞表面特征分子分析證實(shí)本研究獲得的永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞系并非造血系細(xì)胞。
1.4染色體核型分析 傳至112代的人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞染色體數(shù)目為2n＝46，其中，中部著絲粒染色體有5對(duì)，臂比值為1.33±0.02～1.07±0.03；亞中部著絲粒染色體有7對(duì)，臂比值為3.18±0.03～1.45±0.07；端部著絲粒染色體有6對(duì)，小染色體有4對(duì)，性染色體1對(duì)，染色體核型正常如圖5所示。
1.5生物學(xué)特征 體外連續(xù)培養(yǎng)過程中，永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞具有克隆形成能力，無(wú)裸鼠致瘤性，在軟瓊脂內(nèi)不能生長(zhǎng)，血清依賴性無(wú)顯著降低，仍具有接觸抑制性。不具備轉(zhuǎn)化細(xì)胞的特征，具有正常二倍體細(xì)胞的生物學(xué)特征。如圖6所示。
1.6成體干細(xì)胞的可塑性 永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞可以定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞以及心肌細(xì)胞如圖7、8、9、10所示，具備成體干細(xì)胞的特性。
2.建立人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞系的方法
2.1分離培養(yǎng)原代人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞無(wú)菌采取6～8月齡正常流產(chǎn)胎兒雙側(cè)股骨、肱骨、脛骨骨髓，PBS沖洗髓腔；Percoll細(xì)胞分離液分離細(xì)胞，DMEM低糖培養(yǎng)基(DMEM-L)+10％Hyclone胎牛血清為基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)，獲得原代呈成纖維樣細(xì)胞。
2.2純化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞0.25％胰酶消化原代細(xì)胞并傳代，有限稀釋法獲得純化的單細(xì)胞克隆生長(zhǎng)的人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。
2.3人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志檢測(cè)經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)CD29，CD44，CD106，不表達(dá)CD34，CD45，CD14，HLA-DR分子，表明培養(yǎng)細(xì)胞不是造血系細(xì)胞。
2.4人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成體干細(xì)胞特性經(jīng)條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)24天，可以分化為成骨、軟骨、心肌樣細(xì)胞。成骨誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基加地塞米松、β-甘油磷酸、維生素C，終濃度分別為10-8mol/L，50mg/L，10mmol/L；軟骨誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基加地塞米松、TGF-β、維生素C，終濃度分別為10-8mol/L，5ug/L，10mmol/L；心肌細(xì)胞誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基加3umol/L 5-氮胞苷?；A(chǔ)培養(yǎng)基DMEM-L+10％Hyclone胎牛血清。
2.5導(dǎo)入外源性hTERT激活端粒酶采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將編碼hTERT和neo基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pCIneo-hTERT導(dǎo)入單克隆培養(yǎng)的人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。
1)取單細(xì)胞克隆培養(yǎng)的BMSCs第7代細(xì)胞接種24孔板，計(jì)數(shù)，每孔約1×105個(gè)細(xì)胞。
2)24～48小時(shí)后細(xì)胞長(zhǎng)到80％時(shí)，用無(wú)血清、無(wú)抗生素的L-DMEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次，每孔加該培養(yǎng)液0.5ml。
3)配制A液無(wú)血清、無(wú)抗生素L-DMEM 48μl加2μl LipofectAMINE 2000。
4)配制B液無(wú)血清、無(wú)抗生素L-DMEM 48μl加2μl(1μg)質(zhì)粒pCIneo-hTERT。
5)B液配制好后，輕輕混勻，室溫放置5分鐘，與A液輕柔混勻，室溫放置30分鐘，以形成脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物。
6)將以上AB混合液緩慢滴加到細(xì)胞培養(yǎng)液中，邊加邊混勻。
7)常規(guī)條件下培養(yǎng)6小時(shí)后，更換為含10％胎牛血清的L-DMEM完全培養(yǎng)基。
8)24小時(shí)后1∶10傳代。
72小時(shí)后用G418 200μg/mL加壓篩選，10天后100μg/mL，20天左右出現(xiàn)明顯抗性克隆。挑選27個(gè)克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，其中8個(gè)克隆的細(xì)胞可以擴(kuò)大至培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)長(zhǎng)期培養(yǎng)。體外連續(xù)培養(yǎng)3個(gè)月時(shí)，克隆3、8在培養(yǎng)中污染；克隆1、6、7細(xì)胞發(fā)生衰老死亡，可能是細(xì)胞僅渡過了細(xì)胞增長(zhǎng)的M1期，延緩了衰老；克隆2、4、5生長(zhǎng)良好，同時(shí)渡過了細(xì)胞增長(zhǎng)的M1、M2期，得以永生化。3個(gè)克隆的細(xì)胞給予保存，克隆2繼續(xù)培養(yǎng)，至今在體外已連續(xù)傳代179PDs，命名為MSCxj細(xì)胞系。
2.6永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志檢測(cè)取第112代細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)CD29，CD59，CD116，不表達(dá)CD34，CD45，CD112，HLA-DR。
2.7永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成體干細(xì)胞特性取第112代細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)，人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞，具有成體干細(xì)胞的多向分化特征。軟骨誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基加地塞米松、TGF-β、維生素C，終濃度分別為10-8mol/L，5ug/L，10mmol/L；成骨誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基加地塞米松、β-甘油磷酸、維生素C，終濃度分別為10-8mol/L，50mg/L，10mmol/L；心肌細(xì)胞誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基加3umol/L 5-氮胞苷。
2.8永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性取第112代細(xì)胞，永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)，裸鼠致瘤性實(shí)驗(yàn)，懸浮生長(zhǎng)能力實(shí)驗(yàn)，血清依賴性實(shí)驗(yàn)，接觸抑制實(shí)驗(yàn)。染色體核型析。結(jié)果顯示細(xì)胞克隆形成率與轉(zhuǎn)染前相似時(shí)，仍具有血清依賴性和接觸抑止，不具備懸浮生長(zhǎng)能力，在裸鼠皮下種植無(wú)致瘤性，染色體核型分析仍為二倍體，說明細(xì)胞具備正常細(xì)胞生物學(xué)行為，無(wú)轉(zhuǎn)化細(xì)胞或癌細(xì)胞特征。
2.9永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的冷凍與復(fù)蘇冷凍以40％DMEM-L培養(yǎng)基+10％DMSO+50％Hyclone胎牛血清為冷凍液凍存細(xì)胞，并將其分裝于冷凍1.8mL凍存管。4℃條件30分鐘，負(fù)80℃過夜，投入液氮保存冷凍。
解凍取出冷凍細(xì)胞管，迅速投入37℃水域中解凍。培養(yǎng)液清洗解凍細(xì)胞2遍，收集細(xì)胞。胎盤藍(lán)染色檢測(cè)，細(xì)胞成活率達(dá)89％以上。
采用以上分離、純化、基因轉(zhuǎn)染及冷凍保存的方法，已獲得大量純化的永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。目前穩(wěn)定培養(yǎng)，已經(jīng)傳179PDs。這種永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞系及其建立方法有效、可靠，為研究人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)行為提供標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系，為組織工程基礎(chǔ)研究提供平臺(tái)，為臨床應(yīng)用提供足量種子細(xì)胞。


圖1是永生化人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞HE染色觀察×20；圖2.是永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)SEM觀察；圖3是永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和群體倍增時(shí)間(40.08h)；圖4是永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞MSCxj細(xì)胞表面分子檢測(cè)；圖5是永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞染色體核型分析；圖6是永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞裸鼠致瘤性實(shí)驗(yàn)無(wú)腫瘤生長(zhǎng)HEX100；圖7是永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨樣細(xì)胞的檢測(cè)第127PDs MSCxj成骨誘導(dǎo)24d成骨鑒定；圖7a是成骨誘導(dǎo)24d HE×400；圖7b是成骨誘導(dǎo)24d，ALP染色，鈣-鈷法×200；圖7c是成骨誘導(dǎo)24d有I型膠原表達(dá)，免疫細(xì)胞化學(xué)SABC法，DAB顯色×400；圖7d是成骨誘導(dǎo)24d骨鈣素表達(dá)，免疫熒光×200；圖7e是成骨誘導(dǎo)24d鈣結(jié)節(jié)形成，茜素紅染色×40；圖8是永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞的檢測(cè)；圖8-1是是永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)24d甲苯胺藍(lán)染染色細(xì)胞成多角型×400；圖8-2是永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)24d細(xì)胞表達(dá)II型膠原SABC DAB顯色×200；圖9a是是永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)后細(xì)胞連接形成合胞體樣結(jié)構(gòu)生長(zhǎng)，細(xì)胞變?yōu)槎讨鶢?，突起位于兩端，相互連接(伊紅染色×400)；圖9b是是永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞表達(dá)肌動(dòng)蛋白免疫熒光×400；圖10是永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨、軟骨、心肌細(xì)胞誘導(dǎo)后RT-PCR檢測(cè)I型膠原、骨鈣素、II型膠原、MLC-2V的mRNA表達(dá)(Mmark；C-陰性對(duì)照；1，2，3，4誘導(dǎo)第6，12，18，24d細(xì)胞mRNA表達(dá)；C+陽(yáng)性對(duì)照)具體實(shí)施方式
1.建立人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞系1.1分離、克隆純化原代人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞骨髓來(lái)源西京醫(yī)院婦產(chǎn)科6-8月水囊引產(chǎn)胎兒，取胎兒雙側(cè)股骨、脛骨、肱骨，用完全培養(yǎng)基反復(fù)沖洗髓腔。吸取沖洗的培養(yǎng)液入離心管，250×g離心10分鐘，棄去上清；用5mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，然后沿管壁緩慢滴加入底部裝有Percoll(比重1073g/L)分離液的離心管中，900×g離心30分鐘，吸取界面云霧狀白膜層，加入PBS混勻細(xì)胞，250×g離心10分鐘，洗滌2遍，計(jì)數(shù)。以2×106接種于50ml培養(yǎng)瓶，6天后第一次換液，此后2～3天換液一次，細(xì)胞90％匯合時(shí)0.25％胰酶消化，1∶3傳代，傳代細(xì)胞90％匯合時(shí)0.25％胰酶消化，進(jìn)行有限稀釋法克隆培養(yǎng)1)消化液消化后制成單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)。2)細(xì)胞計(jì)數(shù)后，以10倍等階式稀釋細(xì)胞懸液為103個(gè)/mL，將此細(xì)胞懸液100倍稀釋即為10個(gè)細(xì)胞/ml，最后將10個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液經(jīng)2倍稀釋，即為5細(xì)胞/ml。3)將稀釋好的細(xì)胞懸液分別接種于96孔板中，每孔加液0.1ml。然后5％CO2，37℃條件下培養(yǎng)。4)兩天后，倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)板各孔細(xì)胞數(shù)，挑選只含一個(gè)細(xì)胞的孔，做好標(biāo)記并補(bǔ)加0.1ml培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。5)培養(yǎng)期間，視培養(yǎng)液PH值的變化，決定是否更換培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)一周左右，孔中即形成較大克隆。待克隆長(zhǎng)到70％融合時(shí)，用消化法分離克隆細(xì)胞，轉(zhuǎn)種于24孔培養(yǎng)板、6孔板及培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)擴(kuò)大培養(yǎng)。6)共選取培養(yǎng)17個(gè)生長(zhǎng)良好的成纖維樣細(xì)胞克隆，將所有的單克隆細(xì)胞均擴(kuò)大培養(yǎng)，并凍存。7)選取形態(tài)較好的克隆2、5的細(xì)胞進(jìn)行鑒定和基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
1.2人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的鑒定1.2.1細(xì)胞表面標(biāo)志檢測(cè)取第6代細(xì)胞0.25％胰酶消化，離心，PBS洗滌收獲細(xì)胞，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，分別于CD14，CD29，CD34，CD44，CD45，CD106，HLA-DR單克隆抗體室溫閉光反應(yīng)30分鐘，送流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面標(biāo)記。
1.2.2人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成體干細(xì)胞特征1.2.2.1人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化取生長(zhǎng)良好的第6代細(xì)胞，更換培養(yǎng)液為成骨條件培養(yǎng)液培養(yǎng)，分別取誘導(dǎo)后6、12、18、24天細(xì)胞以2×105/mL接種于孔底預(yù)先鋪好1cm2經(jīng)過酸處理過的細(xì)胞玻璃爬片的24孔板，36小時(shí)細(xì)胞完全貼壁后，進(jìn)行成骨細(xì)胞的鑒定，檢測(cè)免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)I型膠原和骨鈣素的表達(dá)鈣-鈷法檢測(cè)堿性磷酸酶表達(dá)；茜素紅染色檢測(cè)鈣結(jié)節(jié)1.2.2.2人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化取生長(zhǎng)良好的第6代細(xì)胞，更換培養(yǎng)液為成軟骨條件培養(yǎng)液，分別取誘導(dǎo)后6、12、18、24天以2×105/ml接種于孔底預(yù)先鋪好1cm2經(jīng)過酸處理過的細(xì)胞玻璃爬片的24孔板，36小時(shí)細(xì)胞完全貼壁后，取出玻片40g/L多聚甲醛固定20分鐘后作以下軟骨細(xì)胞鑒定甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)蛋白多糖的表達(dá)；免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)II型膠表達(dá)。
1.2.2.3人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化取生長(zhǎng)良好的第6代細(xì)胞，更換培養(yǎng)液為心肌細(xì)胞誘導(dǎo)條件培養(yǎng)液，分別取誘導(dǎo)后6、12、18、24天以2×105/ml接種于孔底預(yù)先鋪好1cm2經(jīng)過酸處理過的細(xì)胞玻璃爬片的24板，36小時(shí)細(xì)胞完全貼壁后，取出玻片40g/L多聚甲醛固定20分鐘后作以下心肌細(xì)胞鑒定伊紅染色觀察細(xì)胞形態(tài)；免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)肌動(dòng)蛋白表達(dá)。
1.2.2.4人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞誘導(dǎo)后mRNA水平的鑒定(RT-PCR檢測(cè))取3種誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后6、12、18、24天的細(xì)胞，成骨誘導(dǎo)檢測(cè)I型膠原、骨鈣素，成軟骨誘導(dǎo)檢測(cè)II型膠原，心肌細(xì)胞誘導(dǎo)檢測(cè)心室肌特異性肌球蛋白輕鏈MLC-2V的mRNA表達(dá)RNA的提取細(xì)胞接種于35mm平皿，待長(zhǎng)滿約80％后，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞3次→加1ml Trizol，室溫放置5分鐘→吹打均勻，移入1.5ml離心管→加氯仿200μl，震蕩15s混勻→室溫孵育5分鐘→4℃，12000rpm離心15分鐘→吸取上層水樣帶，轉(zhuǎn)移入另一離心管→加6/10體積異丙醇，混勻→4℃，12000rpm離心10分鐘→棄上清，加75％乙醇1ml洗滌→4℃，7500rpm離心5分鐘→棄上清，干燥5分鐘，加無(wú)RNase水20μl重溶→加入RQ1 RNase-Free DNase以消化混雜的基因組DNA→參照文獻(xiàn)顏?zhàn)臃f，王海林譯.精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南?？茖W(xué)出版社，1998120-145。進(jìn)行RNA的瓊脂糖變性膠(1％)電泳分析，核酸蛋白分析儀進(jìn)行濃度和純度的測(cè)定。-70℃保存?zhèn)溆谩?br> RT-PCR根據(jù)Gene Bank數(shù)據(jù)庫(kù)人I型膠原、骨鈣素、II型膠原、MLC-2V的mRNA序列，采用PCGENE軟件設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增的兩條引物表1 RT-PCR引物設(shè)計(jì)(5’→3’)

RT-PCR，reverse transcription-polymerase chain reaction.
采用TitanTMOne Tube RT-PCR Kit進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)體系為2μl模板RNA，0.2mM dNTP，0.4μM引物，5mM DTT，10u RNasin，1.5mM MgCl2，1μl Enzyme Mix，加無(wú)菌雙蒸水至50μl。RT-PCR參數(shù)50℃30分鐘；94℃10s，56℃30s，68℃45s，10個(gè)循環(huán)；94℃10s，56℃30s，68℃2分鐘，25個(gè)循環(huán)；68℃，7分鐘。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照和陰性對(duì)照(第3代人血管內(nèi)皮細(xì)胞總RNA)。RT-PCR產(chǎn)物1％瓊脂糖凝膠電泳分析。
1.3基因轉(zhuǎn)染和細(xì)胞培養(yǎng)取克隆培養(yǎng)生長(zhǎng)良好的第5代細(xì)胞接種24孔板，每孔約1×105個(gè)細(xì)胞。待長(zhǎng)到80％匯合時(shí)，按LipofectAMINE 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，參考文獻(xiàn)J.薩姆布魯克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯，等著。金冬雁，黎孟楓，等譯。分子克隆實(shí)驗(yàn)指南。北京科學(xué)出版社。2002年，第三版1276-1282。進(jìn)行pCIneo-hTERT的轉(zhuǎn)染。
1)取單細(xì)胞克隆培養(yǎng)的BMSCs第7代細(xì)胞接種24孔板，計(jì)數(shù)，每孔約1×105個(gè)細(xì)胞。
2)24～48小時(shí)后細(xì)胞長(zhǎng)到80％時(shí)，用無(wú)血清、無(wú)抗生素的L-DMEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次，每孔加該培養(yǎng)液0.5ml。
3)配制A液無(wú)血清、無(wú)抗生素L-DMEM 48μl加2μl LipofectAMINE 2000。
4)配制B液無(wú)血清、無(wú)抗生素L-DMEM 48μl加2μl(1μg)質(zhì)粒pCIneo-hTERT。
5)B液配制好后，輕輕混勻，室溫放置5分鐘，與A液輕柔混勻，室溫放置30分鐘，以形成脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物。
6)將以上AB混合液緩慢滴加到細(xì)胞培養(yǎng)液中，邊加邊混勻。
7)常規(guī)條件下培養(yǎng)6小時(shí)后，更換為含10％胎牛血清的L-DMEM完全培養(yǎng)基。
8)24小時(shí)后1∶10傳代。
72小時(shí)后用G418 200μg/mL加壓篩選，10天后100μg/mL，20天左右出現(xiàn)明顯抗性克隆。挑選27個(gè)克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，其中8個(gè)克隆的細(xì)胞可以擴(kuò)大至培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)長(zhǎng)期培養(yǎng)。體外連續(xù)培養(yǎng)3個(gè)月時(shí)，克隆3、8在培養(yǎng)中污染；克隆1、6、7細(xì)胞發(fā)生衰老死亡，克隆2、4、5生長(zhǎng)良好，給予保存，克隆2繼續(xù)培養(yǎng)，至今在體外已連續(xù)傳代179PDs，命名為MSCxj細(xì)胞系。
1.4永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的鑒定取第112代永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)對(duì)象，鑒定方法同1.2。
1.5永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特征1.5.1生長(zhǎng)曲線和群體倍增時(shí)間將第112PDs的MSCxj按1×104/孔接種于24孔板，3～4天換液1次，每隔2天用0.25％胰蛋白酶消化細(xì)胞，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)平行孔，每個(gè)孔計(jì)數(shù)3次，取其平均值繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，并按以下公式計(jì)算群體倍增時(shí)間(population doubling time，PDT)PDT＝[log2/(logNt-loN0)]×t，其中N0和Nt分別代表接種時(shí)和培養(yǎng)t小時(shí)后的細(xì)胞數(shù)。
1.5.2染色體核型分析取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加秋水仙素至濃度0.4μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。0.25％胰蛋白酶消化細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1次，200g離心5分鐘，棄上清；75mmol/LKCl重懸細(xì)胞沉淀，室溫放置8分鐘。然后加入1滴甲醇/冰醋酸(3∶1)固定液，混勻后4℃離心，棄上清；加1ml固定液，4℃放置30分鐘，重懸后4℃離心，棄上清；繼續(xù)加入固定液，混勻離心。根據(jù)細(xì)胞沉淀加適量固定液，重懸后將細(xì)胞懸液滴加在潔凈的玻片上，空氣干燥，然后將玻片浸入0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液中，30℃處理10～20分鐘，系列甲醇脫水，Giemsa染色10分鐘左右，常規(guī)脫水封片，光鏡下觀察。
1.5.3致瘤性收集第112代的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個(gè)/ml，于5周齡Balb/c nu-/nu-裸鼠背部皮下接種細(xì)胞懸液0.2ml，定期觀察。宮頸癌細(xì)胞系Hela及第7代原代細(xì)胞分別為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。
1.5.4懸浮生長(zhǎng)能力采用軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的懸浮生長(zhǎng)能力。在24孔板制備含0.5％瓊脂的底層凝膠，取第112PDs的MSCxj，制備成單細(xì)胞懸液，按照25、50、100、200、400和800個(gè)/孔的密度配成0.3％瓊脂培養(yǎng)基作為上層膠。培養(yǎng)2～3周后相差顯微鏡下觀察克隆形成情況。Hela及第7代原代細(xì)胞分別為陽(yáng)性和陰性細(xì)胞對(duì)照。
1.5.5血清依賴性取第112代的細(xì)胞按3000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板。接種后24小時(shí)分別換為無(wú)FCS以及含2％、5％和10％FCS的L-DMEM，每組8孔。換液后第5天以四唑鹽(MTT)比色實(shí)驗(yàn)比較細(xì)胞增殖率。具體方法如下終止培養(yǎng)后，每孔加入MTT(5mg/ml)20μl，37℃繼續(xù)孵育4～6小時(shí)，然后小心吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入150μl二甲基亞砜，振蕩10分鐘使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔490nm波長(zhǎng)處的吸光度A值，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
1.5.6接觸抑制性第112代細(xì)胞以1×105個(gè)/ml的密度接種于25ml培養(yǎng)瓶，觀察細(xì)胞接近匯合和匯合時(shí)的生長(zhǎng)情況。
權(quán)利要求
1.一種永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞系及其建立方法，原代人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于正常流產(chǎn)胎兒骨髓組織，其特征在于，該永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞系體外培養(yǎng)能無(wú)限克隆增殖、且具有多向分化潛能；具體包括1)形態(tài)特征 H.E染色，永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞完全貼壁后呈纖維樣或多角型，核多為圓形，細(xì)胞核質(zhì)比大，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器發(fā)達(dá)，屬生長(zhǎng)旺盛的成纖維樣細(xì)胞；2)生長(zhǎng)特性 細(xì)胞數(shù)較少時(shí)，可見典型的單克隆生長(zhǎng)方式；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至75％融合時(shí)，呈纖維樣，生長(zhǎng)曲線表明，細(xì)胞接種1～2天生長(zhǎng)緩慢，3～5天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞倍增時(shí)間為40.08小時(shí)，從細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及1年以上擴(kuò)增細(xì)胞生長(zhǎng)情況看，該細(xì)胞系為永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞系；3)流式細(xì)胞分析特征 永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)CD29，CD44，CD106，不表達(dá)CD34，CD45，CD14，HLA-DR分子，從細(xì)胞表面分子標(biāo)志證實(shí)本研究獲得的永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞系并非造血系細(xì)胞；4)染色體核型分析 傳至112代的人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞染色體數(shù)目為2n＝46，其中，中部著絲粒染色體有5對(duì)，臂比值為1.33±0.02～1.07±0.03；亞中部著絲粒染色體有7對(duì)，臂比值為3.18±0.03～1.45±0.07；端部著絲粒染色體有6對(duì)，小染色體有4對(duì)，性染色體1對(duì)，染色體核型正常；5)生物學(xué)特征 體外連續(xù)培養(yǎng)過程中，永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞具有克隆形成能力，無(wú)裸鼠致瘤性，在軟瓊脂內(nèi)不能生長(zhǎng)，血清依賴性無(wú)顯著降低，仍具有接觸抑制性，不具備轉(zhuǎn)化細(xì)胞或癌細(xì)胞的特征，是正常細(xì)胞；6)成體干細(xì)胞特征 永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞可以定向誘導(dǎo)分化為成骨、軟骨以及心肌樣細(xì)胞，具備成體干細(xì)胞的特性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞系及其建立方法，其特征在于，人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的獲取包括以下步驟1)分離培養(yǎng)原代人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞無(wú)菌采取6～8月齡正常流產(chǎn)胎兒骨髓，PBS沖洗髓腔；Percoll細(xì)胞分離液分離細(xì)胞，DMEM-L+10％Hyclone胎牛血清為基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)，獲得原代呈成纖維樣細(xì)胞；2)純化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞0.25％胰酶消化原代細(xì)胞并傳代，有限稀釋法獲得純化的克隆生長(zhǎng)的人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞系及其建立方法，其特征在于其永生化是通過導(dǎo)入外源性hTERT基因激活端粒酶而得到的采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將編碼hTERT和neo基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pCIneo-hTERT導(dǎo)入單克隆培養(yǎng)的人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；培養(yǎng)液加G418篩選約20天后，抗性細(xì)胞克隆形成，移液槍轉(zhuǎn)移、擴(kuò)增，經(jīng)加壓篩選獲hTERT穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞克隆，同時(shí)細(xì)胞端粒酶活性轉(zhuǎn)為陽(yáng)性；獲得永生化細(xì)胞系。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞系及其建立方法，其特征在于經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，細(xì)胞表達(dá)CD29，CD44，CD106，不表達(dá)CD34，CD45，CD14，HLA-DR分子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞系及其建立方法，其特征在于具有成體干細(xì)胞特性經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)，可以分化為成骨、軟骨以及心肌樣細(xì)胞，軟骨誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基成骨誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基加地塞米松、β-甘油磷酸、維生素C，終濃度分別為10-8mol/L，50mg/L，10mmol/L；基礎(chǔ)培養(yǎng)基加地塞米松、TGF-β、維生素C，終濃度分別為10-8mol/L，5ug/L，10mmol/L；心肌細(xì)胞誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基加3umol/L 5-氮胞苷。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞系及其建立方法，其特征在于具備正常細(xì)胞的生物學(xué)特性，不具備以往導(dǎo)入病毒基因等所建立的細(xì)胞所特有的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的特征，永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞有克隆形成能力，不具備裸鼠致瘤性，無(wú)懸浮生長(zhǎng)能力，具有血清依賴性，因此細(xì)胞具備正常細(xì)胞生物學(xué)行為，無(wú)轉(zhuǎn)化細(xì)胞或癌細(xì)胞生物學(xué)特征。
全文摘要
本發(fā)明屬于一種永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞系及其建立方法，原代人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于正常流產(chǎn)胎兒骨髓組織，有限稀釋法進(jìn)行單細(xì)胞克隆培養(yǎng)純化原代細(xì)胞，通過轉(zhuǎn)染pCIneo－h(huán)TERT基因獲得永生化。該人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞系體外培養(yǎng)能無(wú)限克隆增殖，但不具備轉(zhuǎn)化細(xì)胞或癌細(xì)胞的特征，在細(xì)胞生物學(xué)特征上是正常細(xì)胞；細(xì)胞可以定向誘導(dǎo)分化為成骨、軟骨以及心肌樣細(xì)胞，具有多向分化潛能，仍具備成體干細(xì)胞的特性?？梢栽谏锕こ填I(lǐng)域得到應(yīng)用。這種永生化人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞系及其建立方法，為研究人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)行為提供標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系，為組織工程基礎(chǔ)研究提供平臺(tái)，為臨床應(yīng)用提供足量種子細(xì)胞，并為建立人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞系提供一種有效、可靠的方法。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1810957SQ20051004196
公開日2006年8月2日 申請(qǐng)日期2005年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月19日
發(fā)明者胡蘊(yùn)玉, 滕勇, 白建萍, 呂榮, 李丹 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)