專利名稱：水稻稻瘟菌dna指紋圖譜帶型編碼程式分類分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水稻病菌變異性的研究分析方法，尤其是一種水稻病菌變異性的遺傳性狀研究分析方法，屬于農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
稻瘟病以及白葉枯病、紋枯病在我國(guó)南北稻區(qū)都有嚴(yán)重危害，為我國(guó)水稻的三大病害。其中稻瘟病菌(Magnapor the grisea)引起的稻瘟病是流行最廣、危害最大的世界性水稻病害。培育和利用抗病品種是目前最有效和最實(shí)用的防治方法。然而，由于稻瘟病菌的致病性分化嚴(yán)重，生理小種繁多、致病性變化較大，容易發(fā)生變異，往往一個(gè)高抗品種不到3～5年便成為高度的感病品種，給抗病品種的選育和推廣帶來了極大的困難。
為了掌握水稻病菌的變異規(guī)律，從而便于對(duì)癥下藥，采取行之有效的相應(yīng)措施，長(zhǎng)期以來一直采取對(duì)病菌致病性研究的方法，了解病菌的變異情況。這種方法通常需要經(jīng)過以下主要步驟1、采樣——采集病株；2、分離——將病菌從病株上分離出來；3、培養(yǎng)——培養(yǎng)病菌；4、接種——將病菌接種到實(shí)驗(yàn)株上；5、癥狀分析——通過比較接種病株的癥狀，分析變異情況。
由于以上過程需要一定周期，受季節(jié)影響，至少需要一年以上的時(shí)間，因此無法做到對(duì)變異的快速監(jiān)測(cè)和及時(shí)分析。
隨著生物工程技術(shù)的迅速發(fā)展，上世紀(jì)九十年代，人們開始從遺傳學(xué)角度對(duì)稻瘟病菌的變異進(jìn)行研究，并取得一定成績(jī)。尤其是通過rep-PCR指紋圖譜分析技術(shù)，逐漸摸索出一些稻瘟病菌的變異系譜(Hamer1991，1993；Levy1993；沈瑛1996；George1998)。但是，由于不同研究者對(duì)自己所報(bào)道的稻瘟菌系譜并未公開相應(yīng)的獲取方法，也沒有按統(tǒng)一的帶型標(biāo)準(zhǔn)去命名系譜，加之所采用的軟件和計(jì)算公式互不相同，因此與異地其他研究者報(bào)道的相應(yīng)研究結(jié)果很難直接進(jìn)行比較。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)以上現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提出一種可以對(duì)稻瘟病菌生理小種致病性分化快速監(jiān)測(cè)、并便于異地研究結(jié)果相互比對(duì)的水稻病菌DNA指紋圖譜帶型編碼程式分類分析方法，從而使有關(guān)研究成果標(biāo)準(zhǔn)化，有利于實(shí)現(xiàn)資源共享。
為了達(dá)到以上目的，本發(fā)明的水稻病菌DNA指紋圖譜帶型編碼程式分類分析方法包括以下基本步驟1、采樣——采集病株，分離單孢菌株；2、基因組DNA提取2、1提取菌絲——單孢菌株在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上培養(yǎng)產(chǎn)孢后，洗取孢子至液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再凍干或在干燥器中抽干菌絲；2、2提取DNA——將菌絲研磨成粉，先后加入提取液、SDS、NaCl、CTA、氯仿∶異戊醇，異丙醇，每次加入均需充分混勻，低溫沉淀DNA；3、rep-PCR擴(kuò)增——加入前后引物，使兩端核苷酸序列進(jìn)行反向擴(kuò)增；4、電泳形成指紋圖譜——將以上PCR產(chǎn)物放入瓊脂糖凝膠電泳，形成指紋圖譜；5、根據(jù)指紋圖譜得出編碼程式
5、1確定主帶——將出現(xiàn)頻率較高的擴(kuò)增帶定義為主帶，并以此為參照帶確定其它條帶的位置；5、2主帶編碼——以大寫字母順序按分子量由小到大排列主帶的代號(hào)，所缺主帶分別用小寫字母表示；5、3形成主帶程式——程式的第一部分表示主帶數(shù)目；5、4形成副帶程式——程式的第二部分為主帶之間的擴(kuò)增帶，即副帶，用小寫字母表示，以相鄰兩主帶之間距離中線劃分，比中線分子量小的帶編碼為前一分子量主帶的符號(hào)，符號(hào)前面加上負(fù)號(hào)；比中線分子量大的帶編碼為后一分子量主帶的符號(hào)，前面加上正號(hào)；5、5形成編碼程式——將主帶程式與副帶程式合并。
可以理解，本發(fā)明的上述方法不僅可以借助分子遺傳學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)水稻病菌變異的快速監(jiān)測(cè)，并且由于提出了切實(shí)可行的相應(yīng)編碼程式，因此易于解讀，便于異地研究結(jié)果相互比對(duì)，使有關(guān)研究成果得以標(biāo)準(zhǔn)化，既可以相互參照，又可以避免重復(fù)研究。
由此可見，本發(fā)明以清晰完整的思路，解決了本領(lǐng)域的一大技術(shù)難題，與現(xiàn)有技術(shù)相比，取得了顯著的實(shí)質(zhì)性進(jìn)步。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一本實(shí)施例的水稻病菌DNA指紋圖譜帶型編碼程式分類分析方法具體針對(duì)江蘇和中國(guó)北方粳稻種植區(qū)的稻瘟病菌進(jìn)行，其詳細(xì)過程如下1、采樣rep-PCR帶型、系譜研究供試材料來自于穗瘟樣品，分別采自江蘇省五大稻區(qū)的穗期水稻。樣品經(jīng)單孢分離后用于基因組DNA提取。樣品菌株經(jīng)培養(yǎng)產(chǎn)孢低溫干燥保存在稻秸和濾紙碟上。rep-PCR帶型分析的樣品總數(shù)為296個(gè)。
2、稻瘟病菌基因組DNA提取2、1提取菌絲用CTAB/NaCl微量法置備稻瘟菌基因組DNA，方法為單孢菌株在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上培養(yǎng)產(chǎn)孢后，洗取孢子至25ml液體培養(yǎng)基(PDA液體培養(yǎng)基)中，27～30℃振蕩培養(yǎng)3天左右。凍干或在干燥器中抽干菌絲。
2、2提取DNA取出大約25mg的菌絲放入Ependorf管中研磨成粉末。加入500μl提取液(Extraction buffer100mmol/L tris-HCl pH8.0；100mmol/LEDTA，150mmol/L NaCl)震蕩混勻；再加入50μl 10％SDS輕輕混勻，在37℃下震蕩孵育1小時(shí)(80rpm)；加入75μl 5mol/L NaCl，輕輕地充分混勻，再加入65μl 10％CTAB，65℃水浴20分鐘；加入700μl 24∶1氯仿∶異戊醇后，搖床上5分鐘搖勻，離心10,000g/12min。水相加入0.6倍體積的異丙醇。輕輕充分混勻，置-20℃下1小時(shí)以上沉淀DNA；離心10,000g/12min，去上清液，用70％和95％酒精洗沉淀各一次，干燥后懸浮在50μl的1×TE緩沖液中，置-20℃下保存?zhèn)溆谩?br> 3、rep-PCR擴(kuò)增在稻瘟菌中克隆的中等重復(fù)序列的兩端核苷酸序列進(jìn)行反向擴(kuò)增，使其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為該中等重復(fù)序列之間的DNA片段。進(jìn)行PCR擴(kuò)增的前引物Pot2-1序列為5′CGGAAGCCCTAA AGCTGTTT3′，后引物Pot2-2序列為5′CCCTCATTCGTCACACGTTC3′。由Takara大連寶森生物技術(shù)公司合成。25μl rep-PCR反應(yīng)體系為15ng模板DNA、2.5μl10Buffer(Takara)、2mmol/ml MgCl2、2.5μl DNTP(2.5mM each)、引物各1.25μl、0.7u Taq酶。
PCR擴(kuò)增循環(huán)為95℃/2.5min預(yù)變性；變性94℃/1min，退火62℃/1min，延伸65℃/10min四次循環(huán)；再94℃/30sec，62℃/1min，65℃/10min 26次循環(huán)；65℃/15min后結(jié)束擴(kuò)增，4℃保存待測(cè)。
4、電泳形成指紋圖譜電泳緩沖液均為×0.5TBE。用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的基因組DNA的濃度，Marker為λDNA(GibcoBRL產(chǎn)品)。PCR產(chǎn)物的檢測(cè)用1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。指紋圖譜分析用0.5％瓊脂糖凝膠和0.75％Synergel配成半長(zhǎng)膠電泳(膠長(zhǎng)12cm)或長(zhǎng)膠(膠長(zhǎng)24cm)，電泳時(shí)間分別為3-4h和7～9h，電壓為120v，Marker用1kb+(GibcoBRL產(chǎn)品)。EB染色后用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。以Quentity One ver 4.1(Bio-rad產(chǎn)品)軟件按UPGRAM(unweightedpair-group method with arithmetic averages)完成相似性聚類分析。
所有樣品處理及所有數(shù)據(jù)均有3次以上的重復(fù)。
5、根據(jù)指紋圖譜得出編碼程式5、1確定主帶根據(jù)296個(gè)樣品指紋圖譜的分析，將出現(xiàn)頻率較高的6條帶定義為主帶(它們?cè)谒鶞y(cè)菌株中出現(xiàn)的頻率按分子量由小到大分別為92.59％、76.77％、93.27％、61.62％、100％、95.96％；在代表性49個(gè)帶型中擴(kuò)增帶分布頻率見圖2)，以此為參照帶確定其它條帶的位置。
5、2主帶編碼按分子量由小到大排列主帶的代號(hào)分別為A(MW＝640bp)、B(1,260)、C(1,720)、D(1,920)、E(2,780)和F(4,020)(

圖1箭頭所示及圖2所示)，所缺主帶分別用小寫字母a、b、c、d、e、f表示。
5、3形成主帶程式程式第一部分表示主帶數(shù)目，如4、5、6分別代表主帶數(shù)目為4、5、6條；主帶不完全的帶型，在現(xiàn)存主帶數(shù)字后分別用小寫字母a、b、c、d、e、f標(biāo)出所缺主帶；如所缺主帶超過3條，可直接用大寫字母表示現(xiàn)存主帶編碼；如4ac+b-b1-1d-nf中4ac則表示在主帶中有B、D、E、F帶，缺A、C帶；ABE+c+d-d+e1-e+2f-nf中ABE則表示有A、B、E三條主帶存在，其它帶缺。
5、4形成副帶程式程式的第二部分為主帶之間的擴(kuò)增帶可看成副帶，一律用小寫字母表示，以相鄰兩主帶之間距離中線劃分，比中線分子量小的帶編碼為前一分子量主帶的符號(hào)，符號(hào)前面加上負(fù)號(hào)(-)；比中線分子量大的帶編碼為后一分子量主帶的符號(hào)，前面加上正號(hào)(+)。如4ac+b-b1-1d-nf中+b-b為主帶B前有一副帶，主帶B后也有一副帶。
在同一區(qū)域內(nèi)如存在不止一條副帶，可在副帶的符號(hào)前加上阿拉伯?dāng)?shù)字表示的副帶數(shù)量，如有一副帶緊靠著主帶，在副帶符號(hào)后面加寫數(shù)字1。4ad+b+2c-3d1+f表示在B帶的前方有一副帶、C帶前方有2條副帶、D帶后方有3條副帶，其中一副帶緊靠D帶，F(xiàn)帶前方還有一條副帶。
具有完全相同帶型編碼程式或僅在其中一條帶的位置上有很小差異，使用同一帶型編號(hào)，編號(hào)后加小寫a、b。如29a、29b有完全相同的帶型編碼程式，但-b帶與B帶的位置距離不同。
有F帶或分子量比F帶大的副帶被認(rèn)為該樣品PCR擴(kuò)增有效，否則被認(rèn)為有可能為模板DNA降介，大分子量條帶沒有擴(kuò)增出來。須重新提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，3次以上未見F帶或大于F帶的副帶出現(xiàn)，可確定該樣品無此擴(kuò)增帶，該樣品被認(rèn)為擴(kuò)增有效。分子量大于F帶的條帶可能出現(xiàn)不太穩(wěn)定的結(jié)果，因此，帶型確定主要依據(jù)分子量小于F帶的擴(kuò)增帶的位置。
具有完全相同帶型編碼程式或僅在其中一條帶的位置上有很小差異，使用同一帶型編號(hào)，編號(hào)后加小寫a、b。如29a、29b有完全相同的帶型編碼程式，但-b帶與B帶的位置距離不同。
5、5形成編碼程式根據(jù)以上帶型編碼程式規(guī)則，將江蘇稻瘟菌樣品rep-PCR指紋圖譜分的49個(gè)帶型的編碼程式列于表1。
表1.江蘇稻瘟菌rep-PCR指紋圖譜帶型的編碼程式

本實(shí)施例不僅借助本發(fā)明的方法，對(duì)江蘇范圍內(nèi)稻瘟病菌成功進(jìn)行了rep-PCR指紋圖譜的帶型分析，而且形成了便于直讀和交流的指紋圖譜帶型編碼程式，開國(guó)內(nèi)外稻瘟菌研究方面的先河，是該菌遺傳多樣性方面研究的一個(gè)新嘗試，將為全國(guó)以及國(guó)際上稻瘟菌指紋圖譜的帶型編碼程式研究提供借鑒。
實(shí)施例二本實(shí)施例的水稻病菌DNA指紋圖譜帶型編碼程式分類分析方法具體針對(duì)中國(guó)南方稻區(qū)稻瘟病菌進(jìn)行，其詳細(xì)過程如下1、采樣——采集浙江、北方參試菌株105個(gè)，進(jìn)行菌株的分離和培養(yǎng)。
1、1單孢分離在采集的標(biāo)樣中選取癥狀典型的穗頸2-3枝，用清水把表面沖洗干凈，在小試管內(nèi)浸泡6-8小時(shí)至標(biāo)樣完全濕潤(rùn)，26℃保濕24小時(shí)左右(一般以病斑產(chǎn)孢為準(zhǔn))，把標(biāo)樣放在改造過的顯微鏡的玻片上，在顯微鏡下觀察產(chǎn)孢情況，用固定在載物臺(tái)上的針挑取單孢，在PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯、蔗糖)斜面上培養(yǎng)。
1、2培養(yǎng)挑取的單孢在斜面上(26℃)生長(zhǎng)7-10天后，用挑針把菌絲和孢子輕輕刮下，移入液體培養(yǎng)基(馬鈴薯、蔗糖)內(nèi)震蕩培養(yǎng)3-4天(一般以白色菌絲球充滿液體培養(yǎng)基，但顏色未變深為準(zhǔn))。
2、基因組DNA提取2、1提取菌絲——單孢菌株在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上培養(yǎng)產(chǎn)孢后，洗取孢子至液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再制成菌絲粉；2、2提取DNA——取大約25mg菌絲粉放在1.5μl Eppendourf管中，加入500μl提取緩沖液(100mM Tris-HCl，pH＝8.0；100mM EDTA；150mM NaCl)震蕩混勻；加入50μl 10％SDS(十二烷基苯磺酸鈉)輕輕混勻，恒溫?fù)u床上80rpm、37℃混合震蕩1hr；加入75μl 5M NaCl輕輕地充分混勻，再加10％ CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)65μl，65℃水浴20min；加入700μl(24∶1)氯仿∶異戊醇，搖床上5min、80rpm搖勻，12000rpm低溫離心12min；將水相轉(zhuǎn)移至一新的Eppendourf管中，加入0.6×(約400μl)異丙醇，輕輕充分混勻，-20℃ 1hr以上沉淀DNA；12000rpm低溫離心12min，去上清液，分別用75％和95％的乙醇洗沉淀一次，充分干燥；加入50μl 1×TE緩沖液，65℃ 5min溶解；0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA濃度，稀釋至終濃度25ng/μl，冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?br> 3、rep-PCR擴(kuò)增——Pot2-rep-PCR擴(kuò)增的前引物Pot2-1序列為5’-CGGAAGCCCTAAAGCTGTTT-3’，后引物Pot2-2序列為5’-CCCTCATTCGTCACACGTTC-3’。由Takara寶(大連)生物技術(shù)公司合成。25μl rep-PCR反應(yīng)體系中含1.5ng模板DNA、2.5μl 10×taqBuffer(Takara)、2mM MgCl2、2.5μl dNTP(2.5mM each)、引物各1.25μl、0.7u Taq酶(Takara ex TaqTM)。PCR擴(kuò)增循環(huán)為95℃(2.5min)預(yù)變性；94℃(1min)變性，62℃(1min)退火，延伸65℃(10min)4次循環(huán)；94℃(30s)，62℃(1min)，65℃(10min)26次循環(huán)；65℃(15min)，4℃保存待用。
4、電泳形成指紋圖譜——Rep-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，篩選擴(kuò)增好的樣品進(jìn)行Synergel凝膠電泳(0.5％Agarose+0.75％Synergel)，0.5×TBE，120V，8.5hr。用Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)照相。
5、按與實(shí)施例一相同的步驟、根據(jù)指紋圖譜得出編碼程式。不另贅述。
對(duì)福建、安徽、廣東、廣西、四川、重慶、云南、湖北、江西9個(gè)稻區(qū)98個(gè)代表稻瘟菌株指紋圖譜中的條帶出現(xiàn)頻率統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，9個(gè)稻區(qū)中分子量分別為1,260bp、1,820bp、2,300bp、2,780bp、2,900bp、3,200bp、5,000bp的7條條帶出現(xiàn)的頻率分別為90.32％、19.36％、44.09％、90.32％、67.74％、74.19％、36.56％。把這些條帶定義為這些稻區(qū)稻瘟菌株指紋圖譜中的主帶，依此為參考帶決定其他帶的相對(duì)位置，參照江蘇稻區(qū)稻瘟病菌指紋圖譜編碼程式規(guī)則并做相應(yīng)的修改。為方便使用，作者把該編碼程式描述為編碼程式II(CII)，相對(duì)應(yīng)的江浙、北方稻區(qū)編碼程式描述為編碼程式I(CI)。
a)7條主帶按分子量大小排列分別是A(1,260bp)、B(1,820bp)、C(2,300bp)、D(2,780bp)、E(2,900bp)、F(3,200bp)、G(5,000bp)，這些條帶在該稻區(qū)稻瘟菌株指紋圖譜中的分布如圖，所缺主帶分別用小寫字母a、b、c、d、e、f、g表示。
b)程式的第一部分表示主帶數(shù)目，如4、5、7分別代表主帶數(shù)目為4、5、7條；主帶不完全的帶型，在現(xiàn)存主帶數(shù)目后邊分別用小寫字母a、b、c、d、e、f、g標(biāo)出所缺主帶；如所缺主帶超過4條，可直接用大寫字母表示現(xiàn)有主帶編碼；如5bg+e中5表示該帶型中有5條主帶，bg表示在主帶中缺少B、G帶；CFG-a+g中CFG則表示有C、F、G 3條主帶存在，缺其他4條主帶。
c)程式的第二部分為主帶之間的擴(kuò)增帶可看成副帶，一律用小寫字母表示，以相臨兩主帶之間距離中線劃分，比中線分子量小的帶用前面主帶的符號(hào)編碼，符號(hào)前加一負(fù)號(hào)(-)；比中線分子量大的帶用后面主帶的符號(hào)編碼，符號(hào)前加一正號(hào)(+)。圖，如7-a-f±g中表示在主帶A后邊有一副帶，主帶F后有一副帶，主帶G前、后各有一副帶。
d)在同一區(qū)域內(nèi)若存在2條及以上副帶，可以在副帶符號(hào)前加上數(shù)字表示數(shù)量，若有副帶緊靠主帶，則在副帶符號(hào)后加1表示，如6b+2b-f±g則表示在主帶B前面有2條副帶。
e)分析的數(shù)據(jù)均經(jīng)過3次重復(fù)，有些菌株沒有大分子量的條帶認(rèn)為不是操作問題，并且分子量大的條帶出現(xiàn)不太穩(wěn)定，所以帶型編碼以分子量小于G帶的條帶為主。
f)有些菌株具有完全相同的編碼程式，但是副帶的位置不同，所以仍把它們放在表中，表明它們的DNA指紋圖譜是有差異的。
根據(jù)以上編碼程式規(guī)則，將南方9省稻區(qū)稻瘟菌株指紋圖譜編碼程式列于表1.5結(jié)果見表2。
表2.南方9省稻區(qū)菌株rep-PCR指紋圖譜帶型編碼程式Table 1.5.Haplotypic formula of rep-PCR fingerprint patterns for M.grisea from rice inother areas in South China


通過以上實(shí)施例，可以看出，采用本發(fā)明的方法不僅可以對(duì)稻瘟病菌生理小種致病性分化快速監(jiān)測(cè)，而且可以很方便地對(duì)異地研究結(jié)果進(jìn)行相互比對(duì)，從而使有關(guān)研究成果標(biāo)準(zhǔn)化，有利于實(shí)現(xiàn)資源共享。
權(quán)利要求
1.一種水稻病菌DNA指紋圖譜帶型編碼程式分類分析方法，其特征在于包括以下基本步驟1)、采樣——采集病株，分離單孢菌株；2)、基因組DNA提取2、1)提取菌絲——單孢菌株在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上培養(yǎng)產(chǎn)孢后，洗取孢子至液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再凍干或在干燥器中抽干菌絲；2、2)提取DNA——將菌絲研磨成粉，先后加入提取液、SDS、NaCl、CTA、氯仿:異戊醇，異丙醇，每次加入均需充分混勻，低溫沉淀DNA；3)、rep-PCR擴(kuò)增——加入前后引物，使兩端核苷酸序列進(jìn)行反向擴(kuò)增；4)、電泳形成指紋圖譜——將以上PCR產(chǎn)物放入瓊脂糖凝膠電泳，形成指紋圖譜；5)、根據(jù)指紋圖譜得出編碼程式5、1)確定主帶——將出現(xiàn)頻率較高的擴(kuò)增帶定義為主帶，并以此為參照帶確定其它條帶的位置；5、2)主帶編碼——以大寫字母順序按分子量由小到大排列主帶的代號(hào)，所缺主帶分別用小寫字母表示；5、3)形成主帶程式——程式的第一部分表示主帶數(shù)目；5、4)形成副帶程式——程式的第二部分為主帶之間的擴(kuò)增帶，即副帶，用小寫字母表示，以相鄰兩主帶之間距離中線劃分，比中線分子量小的帶編碼為前一分子量主帶的符號(hào)，符號(hào)前面加上負(fù)號(hào)；比中線分子量大的帶編碼為后一分子量主帶的符號(hào)，前面加上正號(hào)；5、5)形成編碼程式——將主帶程式與副帶程式合并。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述形水稻病菌DNA指紋圖譜帶型編碼程式分類分析方法，其特征在于所述電泳形成指紋圖譜步驟中——電泳緩沖液均為×0.5TBE；——用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)經(jīng)采樣后提取的基因組DNA的濃度，Marker為λDNA(GibcoBRL產(chǎn)品)；——PCR產(chǎn)物的檢測(cè)用1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；——指紋圖譜分析用0.5％瓊脂糖凝膠和0.75％Synergel配成半長(zhǎng)膠電泳(膠長(zhǎng)12cm)或長(zhǎng)膠(膠長(zhǎng)24cm)，電泳時(shí)間分別為3～4h和7～9h，電壓為120v，Marker用1kb+(GibcoBRL產(chǎn)品)；——EB染色后用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；樣品處理及數(shù)據(jù)至少作3次以上的重復(fù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述形水稻病菌DNA指紋圖譜帶型編碼程式分類分析方法，其特征在于所述電泳形成指紋圖譜中——將經(jīng)采樣后提取的DNA基因組所得的Rep-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；——篩選擴(kuò)增好的樣品進(jìn)行Synergel凝膠電泳(0.5％Agarose+0.75％Synergel)，0.5×TBE，120V，8.5hr；——用Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)照相。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述形水稻病菌DNA指紋圖譜帶型編碼程式分類分析方法，其特征在于所述根據(jù)指紋圖譜得出編碼程式步驟中確定主帶——根據(jù)樣品指紋圖譜的分析，將出現(xiàn)頻率較高的6條帶定義為主帶以此確定其它條帶的位置；主帶編碼——按分子量由小到大排列主帶的代號(hào)分別為A(MW＝640bp)、B(1,260)、C(1,720)、D(1,920)、E(2,780)和F(4,020)，所缺主帶分別用小寫字母a、b、c、d、e、f表示；形成主帶程式——程式第一部分表示主帶數(shù)目，主帶不完全的帶型，在現(xiàn)存主帶數(shù)字后分別用小寫字母a、b、c、d、e、f標(biāo)出所缺主帶；形成副帶程式——程式的第二部分為主帶之間的擴(kuò)增帶可看成副帶，一律用小寫字母表示，以相鄰兩主帶之間距離中線劃分，比中線分子量小的帶編碼為前一分子量主帶的符號(hào)，符號(hào)前面加上負(fù)號(hào)(-)；比中線分子量大的帶編碼為后一分子量主帶的符號(hào)，前面加上正號(hào)(+)；形成編碼程式——將所述主帶程式與副帶程式合并。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述形水稻病菌DNA指紋圖譜帶型編碼程式分類分析方法，其特征在于所述形成副帶程式步驟中——在同一區(qū)域內(nèi)如存在不止一條副帶，可在副帶的符號(hào)前加上阿拉伯?dāng)?shù)字表示的副帶數(shù)量；——具有完全相同帶型編碼程式或僅在其中一條帶的位置上有很小差異，使用同一帶型編號(hào)，編號(hào)后加小寫a、b；——有F帶或分子量比F帶大的副帶被認(rèn)為該樣品PCR擴(kuò)增有效，否則被認(rèn)為有可能為模板DNA降介，大分子量條帶沒有擴(kuò)增出來；須重新提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，3次以上未見F帶或大于F帶的副帶出現(xiàn)，可確定該樣品無此擴(kuò)增帶，該樣品被認(rèn)為擴(kuò)增有效；——具有完全相同帶型編碼程式或僅在其中一條帶的位置上有很小差異，使用同一帶型編號(hào)，編號(hào)后加小寫a、b。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種水稻病菌變異性的研究分析方法，屬于農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的方法通過采集病株，分離單孢菌株，基因組DNA提取，rep－PCR擴(kuò)增，電泳形成指紋圖譜，根據(jù)指紋圖譜得出編碼程式，不僅可以借助分子遺傳學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)水稻病菌變異的快速監(jiān)測(cè)，并且由于提出了切實(shí)可行的相應(yīng)編碼程式，因此易于解讀，便于異地研究結(jié)果相互比對(duì)，使有關(guān)研究成果得以標(biāo)準(zhǔn)化，從而解決了本領(lǐng)域的一大技術(shù)難題，與現(xiàn)有技術(shù)相比，取得了顯著的實(shí)質(zhì)性進(jìn)步。
文檔編號(hào)C12N15/00GK1699564SQ20051004023
公開日2005年11月23日 申請(qǐng)日期2005年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月26日
發(fā)明者周益軍, 程榜, 范永堅(jiān), 白娟 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院