專利名稱：抗人cd154單克隆抗體及其應用的制作方法
發(fā)明的領域本發(fā)明涉及抗人CD154單克隆抗體1B1和4F1，其制備方法以及基于這些單克隆抗體配對制備的可溶性人CD154酶聯(lián)檢測試劑盒。本發(fā)明進一步涉及使用所說的試劑盒定性和定量檢測人生物學樣品中存在的可溶性人CD154，借以診斷自身免疫性疾病和鑒定血小板活化程度。
發(fā)明的背景在特異性免疫應答中，T細胞的活化需要雙信號。當T細胞表面TCR/CD3識別抗原遞呈細胞表達的MHC-抗原肽復合物并與之發(fā)生特異性結合時，即產生T細胞活化的第一信號。第二信號則由多對共刺激分子的相互作用產生。作為主要的共刺激分子，CD40-CD154信號在免疫應答中的作用越來越受到關注。
CD154(CD40L、gp39、TRAP-1)是分子量約33kDa的II型跨膜糖蛋白，為腫瘤壞死因子(TNF)超家族的成員并主要在活化的CD4+T細胞和活化的血小板表面上表達。此外，Th0、Th1、Th2、CD8+T、肥大細胞、嗜堿性粒細胞、單核巨噬細胞、樹突狀細胞、上皮細胞、平滑肌細胞等多種細胞也能表達CD154。CD154的表達受到嚴格調控，其特征是瞬時性。業(yè)已表明，CD154有膜型和可溶性CD154(sCD154)兩種存在形式。它們均能與CD40特異性結合，但sCD154因結構不穩(wěn)定而易于被降解。其受體CD40分子屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族，可表達于樹突狀細胞、單核巨噬細胞、B細胞、血管內皮細胞、肌纖維細胞及某些腫瘤細胞表面。
CD40-CD154信號傳導在不同細胞可產生截然不同的效應，可以是導致細胞增殖或分化的正性調節(jié)，也可以是導致細胞生長抑制和/或凋亡的負性調節(jié)。研究表明，CD40-CD154信號途徑參與調節(jié)B細胞的發(fā)育、增殖和分化、漿細胞的形成、抗體合成、分泌和類型轉換、記憶性B細胞的形成、生發(fā)中心的形成和維持、樹突狀細胞的分化與成熟、T淋巴細胞的活化和增殖、記憶性T細胞的形成、內皮細胞粘附分子的改變、炎癥因子的釋放、白細胞在炎癥部位的聚集等多種細胞或體液免疫反應。因此，CD40-CD154分子結合對倍受人們的關注。
近年來，有關可溶性CD154的功能活性及其可能的臨床應用研究不斷深入。業(yè)已證實，在炎癥反應中，血小板在活化的數(shù)分鐘內即高水平表達CD154分子。該分子與炎癥部位的血管內皮細胞、巨噬細胞表面的CD40分子相互作用，介導血管內皮細胞、巨噬細胞的炎癥反應。CD40-CD154相互作用的數(shù)分鐘至1小時內，膜型CD154分子通過蛋白質水解作用形成sCD154。此外，某些血小板活化因子如腎上腺素、凝血酶活化的血小板亦可表達CD154分子并釋放sCD154(Viallard JF，et al.Blood.2002；992612)。血清sCD154水平與血小板數(shù)量及血小板的活化程度密切相關，例如原發(fā)性血小板增多癥和動脈粥樣硬化患者的血清sCD154水平常常明顯高于正常人。某些自身免疫疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的血清sCD154水平異常升高。這種現(xiàn)象可能是由于活化的CD4+T細胞表達的膜型CD154被水解后形成sCD154所至。
鑒于CD40-CD154相互作用和共刺激途徑在免疫系統(tǒng)中重要作用，人們試圖通過阻斷CD40-CD154相互作用所產生的信號，為各種自身免疫病、過敏反應、炎癥甚至腫瘤的治療提供一類新的生物制劑。另一方面，也可望通過對可溶性CD154分子的生物學特性及其實際應用的研究，為血小板功能相關性疾病以及自身免疫性疾病的診斷和治療提供實驗室依據(jù)。
發(fā)明目的本發(fā)明的一個目的是提供選自1B1和4F1的抗人CD154單克隆抗體。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，如上限定的抗人CD154單克隆抗體1B1和4F1是抗可溶性人CD154單克隆抗體，并且是分別由保藏編號為CGMCC No.1162和CGMCC No.1163的雜交瘤細胞產生并分泌的。
本發(fā)明的另一個目的是提供制備如上限定的抗人CD154單克隆抗體的方法，該方法包括1.用預制備的高表達人CD154分子的轉基因細胞作為免疫原免疫動物；
2.分離被免疫動物的脾淋巴細胞并在適于生產雜交瘤細胞的條件下與適當?shù)墓撬枇黾毎诤希?.篩選并培養(yǎng)如上得到的雜交瘤細胞；4.從細胞培養(yǎng)液或接種雜交瘤細胞的動物的腹水液中分離并純化所需的單克隆抗體。
本發(fā)明的再一個目的是提供基于本發(fā)明單克隆抗體的可溶性CD154檢測試劑盒及其在血小板功能鑒定和自身免疫疾病診斷中的組合應用。
附圖簡要說明

圖1顯示以間接免疫熒光法流式細胞術分析抗人CD154單克隆抗體1B1和4F1對L/CD154分子的識別。其中灰色峰為陰性對照(鼠纖維母細胞)，一抗為小鼠IgG，二抗為熒光素FITC標記的羊抗鼠IgG。透明峰顯示L/CD154與抗人CD154單克隆抗體反應的結果，其中第一抗體分別是商品化抗人CD154單克隆抗體TRAP-1(陽性對照)及我們制備的2株抗人CD154單克隆抗體1B1和4F1，第二抗體是熒光素FITC標記的羊抗鼠IgG。
圖2顯示1B1和4F1雜交瘤細胞株染色體的核型分析(×1000倍)。
圖3顯示Western blot免疫印跡結果。抗人CD154單克隆抗體1B1和4F1能特異性識別分子量約為18kDa的重組人sCD154蛋白。
圖4顯示采用流式細胞術完成的抗人CD154單克隆抗體1B1和4F1識別抗原位點的競爭性抑制實驗。A為所選定的待測L/CD154細胞；B為陰性對照(小鼠IgG-PE)；C為陽性對照(CD154-PE，TRAP-1)；D顯示L/CD154細胞與1B1反應后加入CD154-PE；E顯示L/CD154細胞與4F1反應后加入CD154-PE。
圖5顯示sCD154標準工作曲線。以1B1為包被抗體，4F1為檢測抗體，然后加入不同濃度的標準品rhCD154重組蛋白作為檢測抗原，繪制標準工作曲線。X軸代表抗原劑量，Y軸代表光密度OD值。
圖6顯示健康供血員血漿和血清sCD154水平。X軸代表標本種類，Y軸代表sCD154濃度。
圖7顯示健康獻血員、再生障礙性貧血(AA)和原發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)患者血清及血漿sCD154含量的對比分析。
圖8顯示健康獻血員和類風濕性關節(jié)炎(RA)患者血清及血漿sCD154含量的對比分析。
發(fā)明的具體內容本發(fā)明涉及腫瘤壞死因子超家族成員的結合蛋白質或多肽，更具體地說，本發(fā)明涉及抗人CD154單克隆抗體1B1和4F1的制備方法、基于所說的單克隆抗體的可溶性CD154(sCD154)檢測試劑盒，以及所說的單克隆抗體在自身免疫性疾病診斷和血小板功能鑒定中的組合應用。
本說明書中所說的“CD154”是指抗原活化的CD4+T細胞表面上表達的蛋白質；CD154是某些哺乳動物細胞上表達的可與CD40受體特異結合的蛋白質。
術語“CD154”包括完整的CD154、可溶性CD154及包括CD154之功能活性部分的融合蛋白。術語“抗CD154抗體”可以是CD154特異性單克隆或多克隆抗體或它們的免疫學活性部分。本發(fā)明中，優(yōu)選的是單克隆抗體，特別是小鼠抗人CD154單克隆抗體。
可以按照本領域已知的常規(guī)方法制備本發(fā)明的抗人CD154單克隆抗體1B1和4F1(參見Kohler and Milrtein，Nature 256495-96，1975；Harlow and Lane，Aatibodies，A Laboratory，Cold Spring Harbor Laboritory，1988)。必要時，也可以按照美國專利5,585,089中所述的方法制備相應的人源化形式的抗CD154單克隆抗體。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，最好使用被攜帶人CD154基因的表達載體轉化的并可在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下高效表達人CD154多肽的重組體細胞作為制備本發(fā)明單克隆抗體的免疫原。
因此，為了制備本發(fā)明的抗人CD154單克隆抗體，首先構建高表達人CD154的轉基因細胞(L/CD154)。高表達人CD154分子的轉基因細胞具有較強的免疫原性，并且所表達的抗原分子的空間構型能以自然狀態(tài)暴露于細胞膜表面，從而可更有效地激發(fā)機體的免疫反應。另外，由于L細胞是鼠源性的纖維母細胞，細胞表面其他分子具有相對較弱的抗原性，因此用該細胞作為免疫原將會減少非特異性抗體的產生，使單克隆抗體的篩選更為方便并大大提高陽性檢出率。
為了制備L/CD154細胞，可以按照本領域技術人員熟知的DNA操作技術(例如參見Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold SpringHarbour，1989)進行基因的分離、核苷酸片段的切割與連接、克隆和表達載體的構建及擴增、核苷酸序列的分析與鑒定、細胞的轉化和擴大培養(yǎng)等操作。例如，可以首先使用RT-PCR技術從活化的T細胞中擴增出人CD154基因。將CD154基因裝入逆轉錄載體pEGZ-Term，得到重組逆轉錄病毒載體pEGZ-Term/CD154。然后，使用重組逆轉錄病毒載體pEGZ-Term/CD154與輔助病毒pHIT456和pHIT60一起共轉染293T細胞。48小時后，收集含病毒顆粒的293T細胞培養(yǎng)物上清，以其感染L細胞，連續(xù)感染3天。最后，用含Zeocin的選擇培養(yǎng)基篩選并培養(yǎng)抗性細胞。待抗性單克隆生長至足夠大，挑取單克隆集落進行擴大培養(yǎng)。按上述方法獲得的轉基因細胞的CD154表達率高達98％以上。
本發(fā)明的雜交瘤細胞株分別被命名為SI CD 154.1(1B1)和SI CD 154.2(4F1)，并已按照布達佩斯條約和中國專利法實施細則第25條的規(guī)定，于2004年6月2日將這些雜交瘤細胞系樣品保藏在中國北京中國普通微生物保藏管理中心(CGMCC)，保藏編號分別為CGMCC No.1162和CGMCC No.1163。
可以按照本領域已知的常規(guī)方法(Kohler and Milstein，Nature 265495-497，1975)制備本發(fā)明的抗人CD154單克隆抗體1B1和4F1。簡單地說，用轉基因細胞L/CD154免疫Balb/C小鼠。當被免疫動物的血清抗體水平達到峰值時，分離動物的脾細胞并制備單細胞懸液。必要時，可使用免疫吸附方法篩選脾細胞。例如，可以將脾細胞懸液加到CD154抗原蛋白質包被的平板或小孔內，表達CD154多肽特異性免疫球蛋白的B細胞即結合到平板上，而不能被其余的懸液洗掉。收集所得到的B細胞或所有解離的脾細胞，在適當?shù)娜诤蟿┤缇垡叶嫉恼T導下與骨髓瘤融合以形成雜交瘤，并在選擇性培養(yǎng)基如HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)以篩選融合的雜交瘤細胞。用流式細胞術、Western印跡法等方法鑒定所需的陽性抗性細胞株。于體外(例如在組織培養(yǎng)瓶或多孔纖維反應器中)或體內(作為小鼠腹水)培養(yǎng)所選擇的分泌抗人CD154抗體的雜交瘤，并從細胞培養(yǎng)液或小鼠腹水液中收集和純化所需的抗體。
流式細胞儀分析結果顯示，本發(fā)明提供的抗人CD154單克隆抗體1B1和4F1均能識別L/CD154細胞表面上表達的CD154分子。競爭抑制試驗結果進一步顯示，本發(fā)明的抗人CD154單克隆抗體1B1和4F1識別抗原分子上不同的結合位點。
因此，可以利用本發(fā)明的1B1和4F1抗體制備用于檢測可溶性人CD154蛋白的試劑盒?？墒褂没诒景l(fā)明單克隆抗體制備的試劑盒檢測細胞或組織、正常人或病人血液或其它體液樣品中CD154分子的存在及其含量。所說的試劑盒除包括本發(fā)明的抗人CD154單克隆抗體外，還可包括微量測定板、包被抗體1B1或4F1、陽性和陰性對照標準品、已知濃度的可溶性CD154抗原、抗原或抗體樣品稀釋液或包被液、酶或熒光素或放射性核素標記的1B1或4F1抗體、酶或熒光素或放射性核素標記的第二抗體，以及酶的相應底物和洗液等。
由于許多疾病特別是免疫系統(tǒng)疾病條件下均存在細胞膜型或可溶性的CD154蛋白水平的異常改變，所以有可能使用本發(fā)明的試劑盒作為某些免疫系統(tǒng)疾病特別是自身免疫性疾病的實驗室診斷手段。某些自身免疫疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的血清sCD154水平異常升高，推測可能是由于活化的CD4+T細胞表面表達的膜型CD154被水解而形成sCD154所至。我們在使用本發(fā)明的試劑盒檢測類風濕性關節(jié)炎患者血清sCD154水平的實踐中，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，類風濕性關節(jié)炎患者的血清sCD154水平顯著高于健康成年人(數(shù)據(jù)未示出)。因此我們推測，有可能使用基于本發(fā)明單克隆抗體的試劑盒，通過檢測患者血清或血漿中的sCD154水平為臨床診斷類風濕性關節(jié)炎等自身免疫性疾病提供實驗室參考數(shù)據(jù)。
另一方面，已知某些血小板活化劑如腎上腺素、凝血酶活化的血小板均表達CD154分子并釋放出sCD154，而且血清sCD154水平與血小板數(shù)量和血小板的活化程度成正相關。例如，原發(fā)性血小板增多癥和動脈粥樣硬化病人的血清sCD154水平明顯升高，并提示這些病人的血小板分化和活化均不完善。因此，有可能應用本發(fā)明的單克隆抗體檢測病人外周血中的sCD154水平，借以為診斷這些疾病和判斷預后提供參考數(shù)據(jù)。
眾所周知，在進行成分輸血特別是血小板輸注的醫(yī)療實踐中，待輸入的血小板細胞的活化程度將直接影響治療的效果。然而，目前尚沒有建立一種簡便快速地檢測血小板細胞活化程度的方法。
在使用本發(fā)明的單克隆抗體進行大面積人群sCD154水平檢測中，本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)人血清和血漿的可溶性CD154水平存在明顯差異，并證明血小板活化釋放的sCD154是血清sCD154的主要來源。因此可以認為，血清和血漿的可溶性CD154水平的差異在很大程度上反映了同一個體的外周血血小板細胞的平均數(shù)量和活化狀態(tài)。一般說來，血清和血漿可溶性CD154水平的相對值越高，前者相對于后者的比值越大，說明同一個體的活化的外周血血小板數(shù)目越多而且細胞活化程度也越高。
我們的初步研究顯示，在使用本發(fā)明的抗體檢測的情況下，血小板活化程度高的個體的血清中可溶性CD154水平可以比血漿中可溶性CD154水平高2-4倍。本發(fā)明人基于上述發(fā)現(xiàn)，使用我們制備的單克隆抗體，通過檢測個體的血清可溶性CD154水平并與同一個體的血漿可溶性CD154水平相比較，即可間接判斷該個體的血小板活化程度，從而可以為選擇性地使用血小板，提高或改善成分輸血特別是血小板輸注的效果提供實驗室參考數(shù)據(jù)(參見實施例3)。
以下借助非限制性實施例舉例詳細描述本發(fā)明。本領域技術人員可以在不背離本發(fā)明的基本精神和原則前提下，改變或改動本說明書中描述的某些技術內容或技術環(huán)節(jié)。但人們可以理解到，這些平行的改變或改動均將包括在本發(fā)明的待批權利要求范圍之內。
實施例1抗人CD154單克隆抗體的制備本實施例描述本發(fā)明的抗人CD154單克隆抗體1B1和4F1的制備。
1.轉基因細胞L/CD154和L/mock的建立1.1CD154基因的克隆。使用TRIZOL試劑(Gibco，BRL)抽提抗原誘導成熟的DC的總RNA。按照MBI逆轉錄試劑盒使用說明書推薦的方法，將mRNA逆轉錄成cDNA。PCR引物為P15’-GA GCT GAA TTC ATG ATC GAA ACAACC-3’(SEQ ID NO1)和P25’-GA GCT GGA TCC TCA GAG TTT GAG TAAGCC AAA GG-3’(SEQ ID NO2)進行PCR擴增(94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，30個循環(huán)后72℃延伸5分鐘)。純化后，在T4DNA連接酶作用下直接將PCR產物與pMD18-T載體連接過夜。用所得連接產物轉化感受態(tài)細菌TOP10，并對篩選的陽性克隆進行PCR和酶切鑒定以及DNA測序。結果顯示，所獲得的cDNA序列與GenBank中注冊的人CD154cDNA序列完全一致。
1.2重組逆轉錄病毒載體的構建。分別用核酸內切酶EcoRI和BamHI消化測序正確的pMD18-T/CD154質粒和逆轉錄病毒載體pEGZ-Term(現(xiàn)代免疫學，2004，24(2)99-103)(37℃，4小時)。回收含目的基因的片段，并用連接產物轉化感受態(tài)細菌。用上述方法鑒定證實后，將所獲得的重組逆轉錄病毒載體定名為pEGZ-Term/CD154。
1.3穩(wěn)定表達人CD154的L轉基因細胞的構建。首先以試劑盒操作手冊推薦的脂質體法，用重組逆轉錄病毒載體pEGZ-Term/CD154和輔助病毒pHIT456與pHIT60(現(xiàn)代免疫學，2004，24(2)99-103)(體積比2∶1∶1)共轉染6孔板中60-70％匯合生長成片的293T細胞。48小時后收集含病毒顆粒的293T培養(yǎng)上清，以其感染L細胞。加入polybrene至終濃度為8ng/ml，繼續(xù)37℃感染6小時。再加入含10％胎牛血清(FCS)的1640培養(yǎng)基(2ml/孔，隔天換液)。重復感染3次后收集細胞，將1∶6稀釋的細胞培養(yǎng)物置于含Zeocin(Invitrogen，500μg/ml)的選擇培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)2周。待抗性單克隆生長至足夠大，挑取單克隆菌落進行擴大培養(yǎng)。同時制備用作陰性對照的轉基因細胞L/mock。流式細胞儀檢測顯示，L/CD154細胞膜上人CD154蛋白的表達率約為97％。
2.抗人CD154單克隆抗體的制備使用如上得到的高表達CD154分子的轉基因細胞(L/CD154)作為免疫原，三次免疫接種Balb/c小鼠(107/500μl/只，每次間隔3周)。末次免疫后第四天，取小鼠脾臟細胞與SP2/0骨髓瘤細胞株進行細胞融合(共20塊96孔板)。以高表達CD154分子的L/CD154為陽性對照及表達CD154分子的L/mock為陰性對照，用間接免疫熒光法對雜交瘤培養(yǎng)物上清進行初步篩選、蛋白鑒定及Ig亞類鑒定(參見圖1)。陽性克隆經3次有限稀釋后，克隆的陽性率達到約95％。經復篩及亞克隆后獲得穩(wěn)定地分泌特異性鼠抗人CD154的雜交瘤細胞株，并分別被命名為1B1和4F1。這些雜交瘤細胞經體外持續(xù)傳代(40代)后，仍能穩(wěn)定地分泌特異性抗體。對雜交瘤細胞株1B1和4F1的染色體分析顯示，這兩株雜交瘤細胞的染色體數(shù)目分別為96、102(參見圖2)。
3.抗人CD154單克隆抗體的生產與特性鑒定3.1采用本室建立的腹水體內誘生方法生產單克隆抗體。取6-8周齡的雌性Balb/c小鼠，腹腔內注入Pristane(0.5ml/只)。14天后腹腔內接種雜交瘤細胞(1×107/只)，同時腹腔內注射Pristane與福氏不完全佐劑的等體積混合物(0.2ml/只)。10天后收獲腹水，并離心取上清于-80℃保存。
3.2腹水型單抗的純化和定量分析。腹水液經去除纖維蛋白和鹽析處理后，以蛋白G親和柱層析法純化。收集蛋白峰流出液，對磷酸鹽緩沖液(PBS)透析后用751紫外分光光度計測定抗體蛋白濃度為0.8～10mg/ml。間接免疫熒光法分析表明，純化后單抗的效價為1/1000以上。
3.3Ig亞鑒定。采用試紙快速測定法(Argen公司)，鑒定Ig亞類，結果顯示1B1和4F1的重鏈均為小鼠IgG1型，輕鏈均為小鼠κ型。
3.4抗體識別抗原位點的競爭性抑制試驗。在L/CD154細胞(5×105/管)懸液分別加入CD154單克隆抗體1B1或4F1，4℃孵育45分鐘。洗細胞后依次加入PE標記的單克隆抗體(CD154-PE，TRAP-1)，并分別4℃孵育30分鐘。再次洗滌后用流式細胞儀分析，同時設陽性和陰性對照。如圖4所示，單抗1B1不影響單抗CD154-PE(TRAP-1)與L/CD154細胞上CD154分子的結合，單抗4F1完全阻斷單抗CD154-PE(TRAP-1)與L/CD154細胞上CD154分子的結合。由此表明，1B1與4F1識別的CD154分子抗原位點不完全相同。
3.6單抗的Western印跡鑒定。重組人可溶性CD154經12％SDS-PAGE電泳，并電轉移(0.65mA/cm2)至硝酸纖維膜上，用5％脫脂奶粉4℃封閉過夜。翌日加入純化的抗體室溫孵育1小時。用TBST溶液洗去未結合的抗體，加入AP標記的二抗，30分鐘。孵育后加入底物顯色。1B1和4F1均能與分子量約為18kDa的CD154蛋白特異性結合，形成陽性條帶(參見圖3)。
實施例2本發(fā)明的sCD154酶聯(lián)檢測試劑盒的制備A.用于本發(fā)明試劑盒的材料和試劑包括(1)聚苯乙烯微孔板(8×12，Costar，USA)；(2)包被液(0.01mol/L、Tris-HCl pH8.9)；(3)包被抗體用包被液稀釋的單克隆抗體1B1，終濃度為2.0μg/ml；(4)磷酸鹽緩沖液0.01mol/L PBS、pH7.4；(5)封閉液和抗體稀釋液含20％胎牛血清和0.01g NaN3的PBS；
(6)標準抗原sCD154(Peprotech，USA)的系列稀釋液；(7)檢測抗體碳酸鹽緩沖液(CBS，0.01mol/L，pH9.3)稀釋的4F1(200μg/ml)經生物素標記(加琥珀酰羥基生物素-二甲基亞砜40μl(1mg/ml))后再用抗體稀釋液稀釋至工作濃度1μg/ml；(8)親和素辣根過氧化物酶用抗體稀釋液稀釋至工作濃度1μg/ml；(9)反應底物辣根過氧化物酶的反應底物鄰苯二胺；(10)底物緩沖液檸檬酸緩沖液(0.4mol/L，pH4.8)；(11)底物反應液鄰苯二胺溶于底物緩沖液(1mg/ml)；(12)洗滌液含0.1％Tween-20的0.01mol/LPBS(pH7.4)；(13)終止液1.0mol/LH2SO4；B.sCD154標準曲線的繪制將包被抗體1B1(2.0μg/ml)加于96孔微孔板中(100μl/孔)4℃過夜；然后加封閉液37℃放置2h。洗滌后加人重組sCD154標準品的倍比稀釋液(0.4-50ng/ml，100μl/孔)，37℃孵育2h。洗滌5次后加生物素標記的4F1(1μg/ml，100μl/孔)，37℃孵育1h。洗滌后加親和素辣根過氧化物酶(1μg/ml，100μl/孔)，37℃孵育1h。洗滌5次后加反應底物100μl/孔(1mg/ml)，37℃孵育15min。然后加終止液(50μl/孔)終止酶與底物反應。用酶標檢測儀(Biorad，USA)測定OD490值。以sCD154的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制sCD154的標準工作曲線。試驗結果顯示，該檢測方法在抗原濃度0.8-50.0ng/ml區(qū)間具有良好的線性關系，其靈敏度為0.2ng/ml(如圖5所示)。
3.檢測方法的穩(wěn)定性分析將1B1包被后的酶標檢測板置4℃保存0、30、60、90天，重復1.2的步驟，按公式CV＝S/X(S為標準差，X為均值)，分析標準曲線中部分測定點(5.0、10.0、15.0和20.0ng/ml)的變異系數(shù)。統(tǒng)計學處理結果顯示，試劑盒在放置不同時間后，其離散度(CV％)＜6.9％，檢測結果之間無顯著性差異(P＞0.05)，證明該檢測系統(tǒng)具有較好的穩(wěn)定性。
4.檢測方法的準確性分析采用加入法在5份已知sCD154濃度的血清標本稀釋液中分別加入sCD154的標準品5.00ng。按公式回收率＝(樣品檢出量+標準品加入量)/總檢出量×100％計算回收率?；厥章蕿?4.7-104.8％，由此證明該檢測方法具有較高的準確度。
實施例3本發(fā)明的sCD154酶聯(lián)檢測試劑盒的應用A.200例健康成年人血清血漿sCD154水平的測定采集200名健康成年人(其中男性126例，女性74例，年齡26～47歲)的外周靜脈血(蘇州大學附屬第一醫(yī)院提供)各2ml，等分置塑料管中。其中一管為自然凝固的血清，另一管為己二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝血漿。經血球計數(shù)儀測定，其血小板計數(shù)為104-257×109/L。應用該檢測系統(tǒng)測定健康成年人外周血血清和血漿中的sCD154水平。
結果顯示，血清sCD154含量為9.56±4.71ng/ml，明顯高于同一個體的血漿sCD154的含量(2.98±1.13ng/ml)，兩者之間差異顯著(P＜0.05)，這種差異反映了外周血血小板的數(shù)量和活化狀態(tài)。EDTA-K2是血小板活化的強抑制劑，其抗凝的血漿sCD154直接反映體內循環(huán)sCD154的基準水平。血清sCD154除了體內循環(huán)sCD154外，還包括在外周血自然凝固的過程中活化的血小板釋放出的sCD154。由此提示，活化的血小板釋放的sCD154是血清sCD154的主要來源(參見圖6)。
B.再生障礙性貧血和原發(fā)性血小板減少性紫癜患者血清及血漿sCD154含量的測定標本(蘇州大學附屬第一醫(yī)院提供)分別得自20例再生障礙性貧血(AA)患者(其中男性7例，女性13例，年齡8-39歲)和30例原發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)患者(其中男性9例，女性21例，年齡17-52歲)。血清和血漿標本采集方法同上，外周血小板計數(shù)分別為21-46×109/L、18-39×109/L。AA和ITP為血液系統(tǒng)疾病，外周血血小板減少是其顯著特征。實驗發(fā)現(xiàn)，反映體內循環(huán)sCD154基準水平的AA患者血漿sCD154(2.72±0.86ng/ml)、ITP患者血漿sCD154(2.56±0.95ng/ml)與健康成年人血漿sCD154(2.98±1.13ng/ml)三者之間無統(tǒng)計學上的顯著性差異(P＞0.05)。AA患者血清sCD154含量為3.61±1.26ng/ml，ITP患者血清sCD154含量是3.25±1.05ng/ml，兩者之間雖無顯著性差異(P＞0.05)，但均明顯低于健康成年人血清sCD154水平(9.56±4.71ng/ml)(參見圖7)。此外，AA和ITP患者的血清與血漿sCD154含量相近，并與其外周血較低的血小板數(shù)量相關，進一步證明血小板活化釋放的sCD154是血清sCD154的主要來源。
C.類風濕性關節(jié)炎患者血清及血漿sCD154含量的測定標本(蘇州大學附屬第一醫(yī)院提供)分別得自50例類風濕性關節(jié)炎(RA)患者(其中男性18例，女性32例，年齡33-69歲)。血清和血漿標本采集方法同上，外周血小板計數(shù)為69-361×109/L。與健康成年人血漿sCD154(2.98±1.13ng/ml)比較，類風濕性關節(jié)炎患者具有較高的血漿sCD154基準水平(4.47±2.56ng/ml)，兩者之間差異顯著(P＜0.05)。而類風濕性關節(jié)炎患者的血清sCD154含量(16.46±7.51ng/ml)亦明顯高于健康成年人血清sCD154水平(9.56±4.71ng/ml)。由此，我們推測類風濕性關節(jié)炎患者較高的循環(huán)sCD154基準水平，可能與其外周血及病變組織CD4+T細胞的CD154異常表達相關。CD4+T細胞表達的CD154通過蛋白質水解作用形成的sCD154可能是導致患者血漿sCD154升高的主要原因(參見圖8)。
序列表<110>蘇州大學生物技術研究所<120>抗人CD154單克隆抗體及其應用<140>
<141>
<160>6<210>1<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。
<400>1GAGCTGAATT CATGATCGAA ACAACC<210>2<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。
<400>2GAGCTGGATC CTCAGAGTTT GAGTAAGCCA AAGG
權利要求
1.分別由保藏編號為CGMCC No.1162和CGMCC No.1163的雜交瘤細胞產生并分泌的抗人可溶性CD154單克隆抗體1B1和4F1。
2.基于根據(jù)權利要求1的單克隆抗體的可溶性CD154檢測試劑盒及其在自身免疫病診斷和血小板功能鑒定中的組合應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗人CD154單克隆抗體1B1和4F1，其制備方法以及基于這些單克隆抗體配對制備的可溶性人CD154酶聯(lián)檢測試劑盒。本發(fā)明進一步涉及使用所說的試劑盒定性和定量檢測人生物學樣品中存在的可溶性人CD154，借以診斷自身免疫性疾病和鑒定血小板活化程度。
文檔編號C12N5/16GK1844147SQ20051003873
公開日2006年10月11日 申請日期2005年4月7日 優(yōu)先權日2005年4月7日
發(fā)明者張學光, 樊一筍, 施勤 申請人:蘇州大學