專利名稱：華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶，其編碼核酸及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明描述了一種新的多肽——華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶，以及編碼此多肽的多核苷酸序列。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
華支睪吸蟲是人畜共患病，成蟲寄生在肝膽管內(nèi)，成蟲會(huì)破壞膽道上皮和粘膜下血管，并產(chǎn)生分泌排泄抗原，引起膽管和膽管周圍的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致膽管局限性擴(kuò)張和膽管上皮細(xì)胞增生。一些抗原成分還能夠通過膽管上皮細(xì)胞進(jìn)入肝組織，引起炎癥反應(yīng)和肝功能損傷。長(zhǎng)期的嚴(yán)重感染會(huì)導(dǎo)致纖維組織增生和肝細(xì)胞的萎縮變性，甚至引起癌變、腹水和肝硬化。華支睪吸蟲占據(jù)膽管，使得膽汁流出不暢，易合并細(xì)菌感染和出現(xiàn)膽石癥。
華支睪吸蟲病的防治主要依靠綜合防治措施。在流行區(qū)強(qiáng)化對(duì)人群的普查普治，并加強(qiáng)疫苗的研制，以減少傳染源和保護(hù)易感人群。目前，華支睪吸蟲病防治研究的重點(diǎn)集中在診斷和疫苗候選抗原、藥物靶標(biāo)、致病的分子機(jī)理研究。
蘋果酸脫氫酶廣泛存在于細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物中。真核生物的蘋果酸脫氫酶分為兩個(gè)亞型，一個(gè)為熱穩(wěn)定型胞漿中的蘋果酸脫氫酶(cMDH)，另一個(gè)為線粒體中的蘋果酸脫氫酶(mMDH)。兩者均為由36Kda和34Kda兩個(gè)亞基組成的二聚體。cMDH和mMDH在物理、化學(xué)和酶動(dòng)力學(xué)特征完全不同。mMDH具有變構(gòu)效應(yīng)，與線粒體作用可形成多聚酶復(fù)合物。而cMDH缺乏催化的和結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)機(jī)制，僅表現(xiàn)出多量底物抑制效應(yīng)(Trejo F，et al.Gene172(1996)303-308)。
MDH是檸檬酸循環(huán)和天冬氨酸-蘋果酸穿梭的中心組成部分。主要催化蘋果酸鹽氧化為草酰乙酸，同時(shí)將NAD轉(zhuǎn)化為NADH，過量草酰乙酸可抑制其活性。CMDH同樣起此作用，而且參與糖異生和脂肪酸合成。在酸性pH、高壓或蛋白質(zhì)濃度很低時(shí)，二聚體可以解離(ShawS，Biochimica Biophysica Acta 1478(2001)248-256)。
由于蘋果酸脫氫酶廣泛存在于各種生物，且在糖代謝中發(fā)揮重要作用，目前已利用其作為藥物的靶點(diǎn)來治療各種疾病。如利用其抑制劑治療各種腫瘤、脫發(fā)、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、心血管疾病、病毒感染、原蟲病(如利什曼病、瘧疾等)。
Joh等1987年從鼠得到了cMDH全長(zhǎng)cDNA序列，Sanchez等1996年從蘭氏賈第鞭毛蟲基因組中擴(kuò)增并克隆了蘋果酸脫氫酶序列。到目前為止，已有大量生物的MDH基因被擴(kuò)增或克隆。
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，從華支睪吸蟲中分離了編碼華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶DNA，并表達(dá)純化了華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶，并進(jìn)一步揭示了基于此多核苷酸與多肽的應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供分離的新的多肽——華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供編碼該多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供針對(duì)本發(fā)明的多肽——華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的抗體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了抑制本發(fā)明多肽表達(dá)的多核苷酸。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供本發(fā)明的多肽應(yīng)用于篩選華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的抑制劑；或者用于肽指紋圖譜鑒定。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供本發(fā)明的核酸分子作為引物用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)華支睪吸蟲的試劑盒，其含有特異性檢測(cè)華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的引物、抗體或多肽本身。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于預(yù)防華支睪吸蟲病的疫苗，其含有華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶或編碼該酶的多核苷酸的真核表達(dá)載體。
在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明涉及一種分離的多肽，該多肽是華支睪吸蟲源的，它包含具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽、或其保守性變體、生物活性片段或衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。更佳地，該多肽不含信號(hào)肽序列。
在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明還涉及一種分離的多核苷酸，它包含選自下組的一種核苷酸序列或其變體(a)編碼具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸；更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中62-1048位的序列；和(b)具有SEQ ID NO1中1-1134位的序列。
在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明還涉及一種能與本發(fā)明多肽特異性結(jié)合的抗體。
在本發(fā)明的第四方面，提供了抑制本發(fā)明多肽表達(dá)的多核苷酸。
在本發(fā)明的第五方面，提供本發(fā)明的多肽和編碼序列的用途。例如，利用多肽應(yīng)用于篩選華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的抑制劑，所篩選出的抑制劑以安全有效劑量與藥物上可接受的賦型劑組成治療華支睪吸蟲病的藥物組合物；或者用于肽指紋圖譜鑒定。利用編碼序列或其片段作為引物用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列的應(yīng)用。
在本發(fā)明的第六方面，提供了一種檢測(cè)華支睪吸蟲的試劑盒，其含有特異性檢測(cè)華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的引物、抗體或多肽本身。
在本發(fā)明的第七方面，提供一種用于預(yù)防華支睪吸蟲病的疫苗，其含有熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶或編碼該酶的多核苷酸的真核表達(dá)載體。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的，例如，利用本發(fā)明可以涉及一種含有本發(fā)明多核苷酸的載體，特別是表達(dá)載體；一種用該載體遺傳工程化的宿主細(xì)胞，包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞；一種包括培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞和回收表達(dá)產(chǎn)物的制備本發(fā)明多肽的方法。
本說明書和權(quán)利要求書中使用的下列術(shù)語除非特別說明具有如下的含義“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，也可以指基因組或合成的DNA或RNA，它們可以是單鏈或雙鏈的，代表有義鏈或反義鏈。類似地，術(shù)語“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列及其片段或部分。當(dāng)本發(fā)明中的“氨基酸序列”涉及一種天然存在的蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列時(shí)，這種“多肽”或“蛋白質(zhì)”不意味著將氨基酸序列限制為與所述蛋白質(zhì)分子相關(guān)的完整的天然氨基酸。
蛋白質(zhì)或多核苷酸“變體”是指一種具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸改變的氨基酸序列或編碼它的多核苷酸序列。所述改變可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插入或替換。變體可具有“保守性”改變，其中替換的氨基酸具有與原氨基酸相類似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸。變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。
“生物活性”是指具有天然分子的結(jié)構(gòu)、調(diào)控或生物化學(xué)功能的蛋白質(zhì)。類似地，術(shù)語“免疫學(xué)活性”是指天然的、重組的或合成蛋白質(zhì)及其片段在合適的動(dòng)物或細(xì)胞中誘導(dǎo)特定免疫反應(yīng)以及與特異性抗體結(jié)合的能力。
“抑制物”是指當(dāng)與華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶結(jié)合時(shí)，一種可封閉或調(diào)節(jié)華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的生物學(xué)活性的分子。抑制物可以包括蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物或任何其它可結(jié)合華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的分子。
“調(diào)節(jié)”是指華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的功能發(fā)生改變，包括蛋白質(zhì)活性的升高或降低、結(jié)合特性的改變及華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的任何其它生物學(xué)性質(zhì)、功能或免疫性質(zhì)的改變。
″基本上純″是指基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶。基本上純的華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶在非還原性聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶多肽的純度可用氨基酸序列分析。
“互補(bǔ)的”或“互補(bǔ)”是指在允許的鹽濃度和溫度條件下通過堿基配對(duì)的多核苷酸天然結(jié)合。例如，序列“C-T-G-A”可與互補(bǔ)的序列“G-A-C-T”結(jié)合。兩個(gè)單鏈分子之間的互補(bǔ)可以是部分的或全部的。核酸鏈之間的互補(bǔ)程度對(duì)于核酸鏈之間雜交的效率及強(qiáng)度有明顯影響。
“同源性”是指互補(bǔ)的程度，可以是部分同源或完全同源?！安糠滞础笔侵敢环N部分互補(bǔ)的序列，其至少可部分抑制完全互補(bǔ)的序列與靶核酸的雜交。這種雜交的抑制可通過在嚴(yán)格性程度降低的條件下進(jìn)行雜交(Southern印跡或Northern印跡等)來檢測(cè)?；旧贤吹男蛄谢螂s交探針可競(jìng)爭(zhēng)和抑制完全同源的序列與靶序列在的嚴(yán)格性程度降低的條件下的結(jié)合。這并不意味嚴(yán)格性程度降低的條件允許非特異性結(jié)合，因?yàn)閲?yán)格性程度降低的條件要求兩條序列相互的結(jié)合為特異性或選擇性相互作用。
“反義”是指與特定的DNA或RNA序列互補(bǔ)的核苷酸序列。“反義鏈”是指與“有義鏈”互補(bǔ)的核酸鏈。
“衍生物”是指HFP或編碼其的核酸的化學(xué)修飾物。這種化學(xué)修飾物可以是用烷基、酰基或氨基替換氫原子。核酸衍生物可編碼保留天然分子的主要生物學(xué)特性的多肽。
“抗體”是指完整的抗體分子及其片段，如Fab、F(ab’)2及Fv，其能特異性結(jié)合華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的抗原決定簇。
“分離的”一詞指將物質(zhì)從它原來的環(huán)境(例如，若是自然產(chǎn)生的就指其天然環(huán)境)之中移出。比如說，一個(gè)自然產(chǎn)生的多核苷酸或多肽存在于活動(dòng)物中就是沒有被分離出來，但同樣的多核苷酸或多肽同一些或全部在自然系統(tǒng)中與之共存的物質(zhì)分開就是分離的。這樣的多核苷酸可能是某一載體的一部分，也可能這樣的多核苷酸或多肽是某一組合物的一部分。既然載體或組合物不是它天然環(huán)境的成分，它們?nèi)匀皇欠蛛x的。
如本發(fā)明所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶”是指華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶多肽的純度能用氨基酸序列分析。
在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種新的多肽——華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶，其基本上是由SEQ ID NO2所示的氨基酸序列組成的。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的片段、衍生物和類似物。如本發(fā)明所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明多肽的片段、衍生物或類似物可以是(I)這樣一種，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基(優(yōu)選的是保守氨基酸殘基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遺傳密碼子編碼的；或者(II)這樣一種，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基上的某個(gè)基團(tuán)被其它基團(tuán)取代包含取代基；或者(III)這樣一種，其中成熟多肽與另一種化合物(比如延長(zhǎng)多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；或者(IV)這樣一種，其中附加的氨基酸序列融合進(jìn)成熟多肽而形成的多肽序列(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列)通過本文的闡述，這樣的片段、衍生物和類似物被認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍之內(nèi)。
在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供了分離的多核苷酸，基本由編碼具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽的多核苷酸組成。本發(fā)明的多核苷酸序列包括SEQ ID NO1的核苷酸序列。本發(fā)明的多核苷酸是從華支睪系成蟲的全長(zhǎng)cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)的。它包含的多核苷酸序列全長(zhǎng)為1134個(gè)堿基，其開放讀框(62-1048)編碼了329個(gè)氨基酸。根據(jù)氨基酸序列同源比較發(fā)現(xiàn)，此多肽與人蘋果酸脫氫酶有63％的同源性，可推斷出該蛋白就是華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶。
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡(jiǎn)并的變異體。如本發(fā)明所用，“簡(jiǎn)并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)或多肽，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只有成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”是指包括編碼此多肽的多核苷酸和包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述描述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片斷、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與以上所描述的序列雜交的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時(shí)加用變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在95％以上，更好是97％以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ IDNO2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與以上所描述的序列雜交的核酸片段。如本發(fā)明所用，”核酸片段”的長(zhǎng)度至少含10個(gè)核苷酸，較好是至少20-30個(gè)核苷酸，更好是至少50-60個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段也可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的多核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的編碼華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的特異的多核苷酸序列能用多種方法獲得。例如，用本領(lǐng)域熟知的雜交技術(shù)分離多核苷酸。這些技術(shù)包括但不局限于1)用探針與基因組或cDNA文庫雜交以檢出同源的多核苷酸序列，2)表達(dá)文庫的抗體篩選以檢出具有共同結(jié)構(gòu)特征的克隆的多核苷酸片段，3)表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)技術(shù)分離的多核苷酸片段。
本發(fā)明的DNA片段序列也能用下列方法獲得1)從基因組DNA分離雙鏈DNA序列；2)化學(xué)合成DNA序列以獲得所述多肽的雙鏈DNA。
上述提到的方法中，分離基因組DNA最不常用。DNA序列的直接化學(xué)合成是經(jīng)常選用的方法。更經(jīng)常選用的方法是cDNA序列的分離。分離感興趣的cDNA的標(biāo)準(zhǔn)方法是從高表達(dá)該基因的供體細(xì)胞分離mRNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，形成質(zhì)粒或噬菌體全長(zhǎng)cDNA文庫。提取mRNA的方法已有多種成熟的技術(shù)，試劑盒也可從商業(yè)途徑獲得(Qiagene)。而構(gòu)建cDNA文庫也是通常的方法(Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。當(dāng)結(jié)合使用聚合酶反應(yīng)技術(shù)時(shí)，即使極少的表達(dá)產(chǎn)物也能克隆。
可用常規(guī)方法從這些cDNA文庫中篩選本發(fā)明的基因。這些方法包括(但不限于)(1)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(2)標(biāo)志基因功能的出現(xiàn)或喪失；(3)測(cè)定華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的轉(zhuǎn)錄本的水平；(4)通過免疫學(xué)技術(shù)或測(cè)定生物學(xué)活性，來檢測(cè)基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物。上述方法可單用，也可多種方法聯(lián)合應(yīng)用。
在第(1)種方法中，雜交所用的探針是與本發(fā)明的多核苷酸的任何一部分同源，其長(zhǎng)度至少10個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸。此外，探針的長(zhǎng)度通常在2000個(gè)核苷酸之內(nèi)，較佳的為1000個(gè)核苷酸之內(nèi)。此處所用的探針通常是在本發(fā)明的基因序列信息的基礎(chǔ)上化學(xué)合成的DNA序列。本發(fā)明的基因本身或者片段當(dāng)然可以用作探針。DNA探針的標(biāo)記可用放射性同位素，熒光素或酶(如堿性磷酸酶)等。
在第(4)種方法中，檢測(cè)華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物可用免疫學(xué)技術(shù)如Western印跡法，放射免疫沉淀法，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長(zhǎng)的cDNA時(shí)，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴(kuò)增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的多核苷酸序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成。可用常規(guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本發(fā)明的基因，或者各種DNA片段等的多核苷酸序列可用常規(guī)方法如雙脫氧鏈終止法測(cè)定。這類多核苷酸序列測(cè)定也可用商業(yè)測(cè)序試劑盒等。為了獲得全長(zhǎng)的cDNA序列，測(cè)序需反復(fù)進(jìn)行。有時(shí)需要測(cè)定多個(gè)克隆的cDNA序列，才能拼接成全長(zhǎng)的cDNA序列。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或直接用華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
本發(fā)明中，編碼華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的多核苷酸序列可插入到載體中，以構(gòu)成含有本發(fā)明所述多核苷酸的重組載體。術(shù)語“載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體；在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體和在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的來源于桿狀病毒的載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用于構(gòu)建重組表達(dá)載體。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起始點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯調(diào)控元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含編碼華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控元件的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動(dòng)子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動(dòng)子；λ噬菌體的PL啟動(dòng)子；真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子等。在載體中插入增強(qiáng)子序列將會(huì)使其在高等真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA表達(dá)的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對(duì)，作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄?？膳e的例子包括在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的100到270個(gè)堿基對(duì)的SV40增強(qiáng)子、在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子等。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性等。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體/轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等)和選擇性標(biāo)記基因。
本發(fā)明中，編碼華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的多核苷酸或含有該多核苷酸的重組載體可轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主細(xì)胞，以構(gòu)成含有該多核苷酸或重組載體的基因工程化宿主細(xì)胞。術(shù)語“宿主細(xì)胞”指原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；細(xì)菌細(xì)胞如鼠傷寒沙門氏菌；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞如果蠅S2或Sf9；動(dòng)物細(xì)胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤細(xì)胞等。
用本發(fā)明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知?？晒┻x擇的是用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，或者常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)，利用本發(fā)明的多核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼 華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
在步驟(2)中，根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在步驟(3)中，重組多肽可包被于細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲波處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供了用多肽，及其片段、衍生物作為抗原以生產(chǎn)抗體的方法。這些抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。本發(fā)明還提供了針對(duì)華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶抗原決定簇的抗體。這些抗體包括(但不限于)多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和Fab表達(dá)文庫產(chǎn)生的片段。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶直接注射免疫動(dòng)物(如家兔，小鼠，大鼠等)的方法得到，多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。制備華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的單克隆抗體的技術(shù)包括但不限于雜交瘤技術(shù)，三瘤技術(shù)，人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，EBV-雜交瘤技術(shù)等。將人恒定區(qū)和非人源的可變區(qū)結(jié)合的嵌合抗體可用已有的技術(shù)生產(chǎn)。而已有的生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)也可用于生產(chǎn)抗華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的單鏈抗體。
抗華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測(cè)活檢標(biāo)本中的華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶在蟲體中的分布和分泌排泄。
與華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶結(jié)合的單克隆抗體也可用放射性同位素標(biāo)記，注入體內(nèi)可跟蹤其位置和分布。本發(fā)明中的抗體可用于預(yù)防或阻斷華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶引起的病理改變。
在本發(fā)明的第四方面，抑制華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶mRNA的寡核苷酸(包括反義RNA、反義DNA、干擾RNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機(jī)制是核酶分子與互補(bǔ)的靶RNA特異性雜交后進(jìn)行核酸內(nèi)切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術(shù)獲得，如固相磷酸酰胺化學(xué)合成法合成寡核苷酸的技術(shù)已廣泛應(yīng)用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動(dòng)子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對(duì)其進(jìn)行修飾，如增加兩側(cè)的序列長(zhǎng)度，核糖核苷之間的連接應(yīng)用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。干擾RNA(iRNA)是一類能在體內(nèi)特異降解靶基因mRNA從而使該基因沉默的一小段雙鏈RNA分子，其序列一般是mRNA 5’下游70bp以后的一段互補(bǔ)序列。通過將該段序列及其反向序列同時(shí)克隆到同一個(gè)真核表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)染華支睪蟲體或組織細(xì)胞，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄出來的RNA形成dsRNA，能特異降解靶基因的iRNA。mRNA沉默技術(shù)可用于治療由于華支睪吸蟲谷胱苷肽硫轉(zhuǎn)移酶的無表達(dá)或異常/無活性表達(dá)所致的細(xì)胞增殖、發(fā)育或代謝異常，從而確認(rèn)基因(蛋白質(zhì)的生理功能)。
在本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明的多肽的抑制劑可直接用于華支睪吸蟲病的治療。
具體就本發(fā)明的新的華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶而言，該蛋白是華支睪吸蟲糖類代謝的重要酶，可以作為一個(gè)潛在的藥物靶標(biāo)，用于篩選治療華支睪吸蟲病的藥物。
本發(fā)明也提供了篩選化合物以鑒定阻遏華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶活性的藥劑的方法，蘋果酸脫氫酶的抑制劑能有效干擾華支睪吸蟲能量代謝，導(dǎo)致其代謝紊亂而死亡，因此，它可以作為一個(gè)重要的藥物靶標(biāo)。華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的拮抗劑包括篩選出的抗體、化合物、受體缺失物和類似物等。華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的拮抗劑可以與華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶結(jié)合并消除其功能，或是抑制蘋果酸脫氫酶產(chǎn)生，或是與蘋果酸脫氫酶的活性位點(diǎn)結(jié)合使該多肽不能發(fā)揮生物學(xué)功能。
在篩選作為抑制劑的化合物時(shí)，可以將華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶加入生物分析測(cè)定中，通過測(cè)定化合物對(duì)華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶和其底物之間相互作用的影響來確定化合物是否是抑制劑。能與華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶結(jié)合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機(jī)多肽庫而獲得。篩選時(shí)，一般應(yīng)對(duì)華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶分子進(jìn)行標(biāo)記。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測(cè)華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的，包括酶比活性的測(cè)定和免疫學(xué)測(cè)定。
本發(fā)明的多肽還可用作肽譜分析，例如，多肽可用物理的、化學(xué)或酶進(jìn)行特異性切割，并進(jìn)行一維或二維或三維的凝膠電泳分析，更好的是進(jìn)行質(zhì)譜分析。
編碼華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的多核苷酸也可用于多種治療目的。重組的基因治療載體可設(shè)計(jì)用于表達(dá)變異的華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶，以抑制內(nèi)源性的華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶活性。例如，一種變異的華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶可以是縮短的、缺失了催化中心的華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶，雖可與下游的底物結(jié)合，但缺乏蘋果酸脫氫酶活性?；蛘吒鶕?jù)該基因的多核苷酸序列設(shè)計(jì)一段小的反義核酸，干擾該基因的轉(zhuǎn)錄過程和轉(zhuǎn)錄后的翻譯過程，同樣可起到華支睪吸蟲蛋白質(zhì)代謝和其它生理功能的作用。這種抑制內(nèi)源性重組蘋果酸脫氫酶活性的質(zhì)粒，可以以適當(dāng)?shù)膭┬秃头绞竭M(jìn)入肝膽道中，被華支睪吸蟲所吞食，進(jìn)入其合胞體中而起作用。
編碼華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的多核苷酸可用于華支睪吸蟲病的診斷。編碼華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的多核苷酸可用于檢測(cè)華支睪吸蟲的存在和蘋果酸脫氫酶的表達(dá)水平。如根據(jù)該多核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)從糞便標(biāo)本的蟲卵中提取核酸模板進(jìn)行基因擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增的多核苷酸片段的大小是否符合預(yù)定值來確定華支睪吸蟲的感染。該技術(shù)高度敏感特異，能夠克服常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法容易發(fā)生的漏檢和誤檢。基因檢測(cè)的方法不僅可以檢測(cè)是否存在華支睪吸蟲的感染，而且還能對(duì)華支睪吸蟲進(jìn)行分型，確定其亞種或株。編碼華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的DNA序列還可用于對(duì)活檢標(biāo)本進(jìn)行雜交以判斷華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的表達(dá)狀況。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(Microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測(cè)華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
本發(fā)明的序列對(duì)染色體鑒定也是有價(jià)值的。該序列會(huì)特異性地針對(duì)某條華支睪染色體具體位置且并可以與其雜交。目前，需要鑒定染色體上的各基因的具體位點(diǎn)?，F(xiàn)在，只有很少的基于實(shí)際序列數(shù)據(jù)(重復(fù)多態(tài)性)的染色體標(biāo)記物可用于標(biāo)記染色體位置。根據(jù)本發(fā)明，為了將這些序列與疾病相關(guān)基因相關(guān)聯(lián)，其重要的第一步就是將這些DNA序列定位于染色體上。
簡(jiǎn)而言之，根據(jù)cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-35bp)，可以將序列定位于染色體上。然后，將這些引物用于PCR篩選含各條華支睪染色體的體細(xì)胞雜合細(xì)胞。只有那些含有相應(yīng)于引物的人基因的雜合細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)增的片段。
體細(xì)胞雜合細(xì)胞的PCR定位法，是將DNA定位到具體染色體的快捷方法。使用本發(fā)明的寡核苷酸引物，通過類似方法，可利用一組來自特定染色體的片段或大量基因組克隆而實(shí)現(xiàn)亞定位?？捎糜谌旧w定位的其它類似策略包括原位雜交、用標(biāo)記的流式分選的染色體預(yù)篩選和雜交預(yù)選，從而構(gòu)建染色體特異的cDNA庫。
將cDNA克隆與中期染色體進(jìn)行熒光原位雜交(FISH)，可以在一個(gè)步驟中精確地進(jìn)行染色體定位。一旦序列被定位到準(zhǔn)確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。
在本發(fā)明的第六方面，華支睪吸蟲病的診斷除了除了常規(guī)的病原生物學(xué)檢查，主要的方式是使用免疫學(xué)診斷試劑盒。主要有兩類酶聯(lián)免疫試劑盒(ELISA)和快速免疫膠體金試劑盒(ICT)。華支睪吸蟲病的診斷即可通過檢測(cè)血清或尿液中的循環(huán)抗原判斷現(xiàn)癥感染，也可通過檢測(cè)血清或唾液中的特異性抗體來快速篩查。由于華支睪吸蟲主要是寄生在組織外，所產(chǎn)生的抗原成分絕大部分隨著膽汁排入腸道，只有感染度高，蟲體對(duì)膽管阻塞嚴(yán)重，引起膽管上皮嚴(yán)重破損時(shí)，其分泌排泄物才能進(jìn)入肝臟和外周血中。進(jìn)入外周血中的循環(huán)抗原大部分被抗體所中和，只有少量游離的循環(huán)抗原可被檢測(cè)到。因此，檢測(cè)循環(huán)抗原的方法雖然能反映現(xiàn)癥感染，但是敏感性較低。目前，臨床用于輔助診斷的主要是抗體檢測(cè)試劑盒。檢測(cè)抗體的方法分為兩種，一是用標(biāo)記二抗作為檢測(cè)試劑與被包被在反應(yīng)板或反應(yīng)膜上的抗原所捕獲得抗體相結(jié)合，一種是用標(biāo)記的抗原作為檢測(cè)試劑。二抗作為檢測(cè)試劑，一般只能檢測(cè)一種抗體，而且非特異性結(jié)合比較高；標(biāo)記抗原作為檢測(cè)試劑，能檢測(cè)多種抗體，特異性更高。
本發(fā)明可以利用純化的華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶制備ELISA檢測(cè)試劑盒，也可以利用純化的華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶制備膠體金免疫層析檢測(cè)試劑盒。
在本發(fā)明的第七方面，華支睪吸蟲是組織外寄生蟲，免疫系統(tǒng)難以直接與其作用。它產(chǎn)生的抗原刺激機(jī)體粘膜系統(tǒng)產(chǎn)生粘膜免疫反應(yīng)是其主要的保護(hù)性反應(yīng)。粘膜免疫產(chǎn)生的分泌型IgA，可以阻止分泌排泄抗原通過膽管上皮進(jìn)入肝細(xì)胞，從而降低這些抗原成分對(duì)機(jī)體的毒害作用，而不是直接對(duì)蟲體起到攻擊殺傷的作用。因此，華支睪吸蟲的疫苗以口服型疫苗為主，將重組熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶蛋白與卵磷脂1∶10混合，加入10倍的生理鹽水溶液，超聲震蕩，制成脂質(zhì)體，裝入緩釋膠囊，制成口服型重組蛋白疫苗。
圖1為分離的華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖(SDS-PAGE)，36.5kDa為蛋白質(zhì)的分子量，箭頭所指為分離出的蛋白條帶。
圖2為膠體金免疫層析模式圖標(biāo)號(hào)1測(cè)試線 2質(zhì)控線 3玻璃纖維片具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的克隆用異硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取華支睪吸蟲成蟲總RNA。用Quik mRNA Isolation Kit(Qiegene公司產(chǎn)品)從總RNA中分離poly(A)mRNA。2ug poly(A)mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA。用Smart cDNA克隆試劑盒(購自Clontech)將cDNA片段定向插入到pBSK(+)載體(Clontech公司產(chǎn)品)的多克隆位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)化DH5α，細(xì)菌形成cDNA文庫。用Dye terminate cycle reactionsequencing kit(Perkin-Elmer公司產(chǎn)品)和ABI 377自動(dòng)測(cè)序儀(Perkin-Elmer公司)測(cè)定所有克隆的5’和3’末端的序列。將測(cè)定的cDNA序列與已有的公共DNA序列數(shù)據(jù)庫(Genebank)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)克隆2H05的cDNA序列為新的DNA。通過合成一系列引物對(duì)該克隆所含的插入cDNA片段進(jìn)行雙向測(cè)定。結(jié)果表明，2H05克隆所含的全長(zhǎng)cDNA為1152bp(如SeqID NO1所示)，從第62bp至1051bp有一個(gè)990bp的開放閱讀框架(ORF)，編碼一個(gè)新的蛋白質(zhì)(如Seq ID NO2所示)。我們將此克隆命名為pBS-c002h05，編碼的蛋白質(zhì)命名為華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶。
實(shí)施例2cDNA克隆的同源檢索將本發(fā)明的華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的序列及其編碼的蛋白序列，用Blast程序(Basiclocal Alignment search tool)[Altschul，SF et al.J.Mol.Biol.1990；215403-10]，在Genbank、Swissport等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源檢索。與本發(fā)明的多肽同源性最高的基因是一種已知的人蘋果酸脫氫酶，在Genbank的準(zhǔn)入號(hào)為AAH01484.1，兩者相同性為62％；相似性為80％。
實(shí)施例3用RT-PCR方法克隆編碼華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的基因用華支睪成蟲總RNA為模板，以oligo-dT為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，用Qiagene的試劑盒純化后，用下列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增Primer1 5’-GGGGACACACGAGGTCAGTCGAGC-3’ (SEQID NO3)Primer2 5’-TGCTAATAAAAGGCATCATATTATAA-3’ (SEQ ID NO4)Primer1為位于SEQ ID NO1的5’端的第1bp開始的正向序列；Primer2為SEQ ID NO1的中的3’端反向序列。
擴(kuò)增反應(yīng)的條件在50μl的反應(yīng)體積中含有50mmol/LKCl，10mmol/LTris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/LMgCl2，200μmol/L dNTP，10pmol引物，1U的Taq DNA聚合酶(Clontech公司產(chǎn)品)。在PE9600型DNA熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer公司)上按下列條件反應(yīng)25個(gè)周期94℃ 30sec；53℃ 30sec；72℃ 2min。在RT-PCR時(shí)同時(shí)設(shè)β-actin為陽性對(duì)照和模板空白為陰性對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物用QIAGEN公司的試劑盒純化，用TA克隆試劑盒連接到pCR載體上(Invitrogen公司產(chǎn)品)。DNA序列分析結(jié)果表明PCR產(chǎn)物的DNA序列與SEQ ID NO1所示的1-1134bp完全相同。
實(shí)施例4Northern印跡法分析華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶基因的表達(dá)用一步法提取總RNA[Anal.Biochem 1987，162，156-159]。該法包括酸性硫氰酸胍苯酚-氯仿抽提。即用4M異硫氰酸胍-25mM檸檬酸鈉，0.2M乙酸鈉(pH4.0)對(duì)組織進(jìn)行勻漿，加入1倍體積的苯酚和1/5體積的氯仿-異戊醇(49∶1)，混合后離心。吸出水相層，加入異丙醇(0.8體積)并將混合物離心得到RNA沉淀。將得到的RNA沉淀用70％乙醇洗滌，干燥并溶于水中。用20μgRNA，在含20mM 3-(N-嗎啉代)丙磺酸(pH7.0)-5mM乙酸鈉-1mM EDTA-2.2M甲醛的1.2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用α-32P dATP通過隨機(jī)引物法制備32P-標(biāo)記的DNA探針。所用的DNA探針為圖1所示的PCR擴(kuò)增的華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶編碼區(qū)序列(80bp至1069bp)。將32P-標(biāo)記的探針(約2×106cpm/ml)與轉(zhuǎn)移了RNA的硝酸纖維素膜在一溶液中于42℃雜交過夜，該溶液包含50％甲酰胺-25mM KH2PO4(pH7.4)-5×SSC-5×Denhardt’s溶液和200μg/ml鮭精DNA。雜交之后，將濾膜在1×SSC-0.1％SDS中于55℃洗30min。然后，用Phosphor Imager進(jìn)行分析和定量。
實(shí)施例5重組華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的體外表達(dá)、分離和純化根據(jù)SEQ ID NO1和圖1所示的編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)出一對(duì)特異性擴(kuò)增引物，序列如下Primer3 5’-AATGATATCATGGCTGAGGCTCCTATTCGTGTGCT-3’ (Seq ID No5)Primer4 5’-TATAAGCTTCTAGGTGCTCAGAGCCATTTCGCGTT-3’ (Seq ID No6)此兩段引物的5’端分別含EcoRV和HindIII酶切位點(diǎn)，其后分別為目的基因5’端和3’端的編碼序列，EcoRV和HindIII酶切位點(diǎn)相應(yīng)于表達(dá)載體質(zhì)粒pET-30a(+)(Novagen公司產(chǎn)品，Cat.No.69865.3)上的選擇性內(nèi)切酶位點(diǎn)。以含有全長(zhǎng)目的基因的pBS-CS2H05質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為總體積50μl中含pBS-CS2H05質(zhì)粒10pg、引物Primer-3和Primer-4分別為10pmol、Advantage polymerase Mix(Clontech公司產(chǎn)品)1μl。循環(huán)參數(shù)94℃ 20s，62℃ 30s，68℃ 2min，共25個(gè)循環(huán)。用HindIII和EcoRV分別對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-30a(+)進(jìn)行雙酶切，分別回收大片段，并用T4連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化用氯化鈣法大腸桿細(xì)菌DH5α，在含卡那霉素(終濃度30μg/ml)的LB平板培養(yǎng)過夜后，用菌落PCR方法篩選陽性克隆，并進(jìn)行測(cè)序。挑選序列正確的陽性克隆(pET-CS2H05)用氯化鈣法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)plySs(Novagen公司產(chǎn)品)。在含卡那霉素(終濃度30μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，宿主菌BL21(pET-CS2H05)在37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入IPTG至終濃度1mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)5小時(shí)。離心收集菌體，經(jīng)超聲波破菌，離心收集上清，用能與6個(gè)組氨酸(6His-Tag)結(jié)合的親和層析柱His.Bind Quick Cartridge(Novagen公司產(chǎn)品)進(jìn)行層析，得到了純化的目的蛋白華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶。經(jīng)SDS-PAGE電泳，在36.5kDa處得到一單一的條帶(圖1)。將該條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上用Edams水解法進(jìn)行N-端氨基酸序列分析，結(jié)果N-端15個(gè)氨基酸與SEQ ID NO2所示的N-端15個(gè)氨基酸殘基完全相同。
實(shí)施例6 華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的物理化學(xué)性質(zhì)將親和層析純化的華支睪吸蟲華支睪吸蟲腺苷酸結(jié)合蛋白α亞單位，用Throbin酶切除載體序列后，經(jīng)SDS-PAGE電泳，和標(biāo)準(zhǔn)分子量曲線，測(cè)得其分子量約為36.5kDa；該蛋白含有39個(gè)酸性氨基酸殘基和42個(gè)堿性氨基酸殘基，利用Amerham等電聚焦電泳儀，經(jīng)pH3-10和pH7-10梯度固定膠的等電聚焦電泳，測(cè)得其等電點(diǎn)為8.57。重組蛋白的半衰期在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)為30小時(shí)，在酵母細(xì)胞內(nèi)超過20小時(shí)，在大腸桿菌內(nèi)超過10小時(shí)，蛋白分子在水溶液環(huán)境中，呈球狀，易溶于水，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
實(shí)施例7 抗華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶抗體的產(chǎn)生用經(jīng)親和層析純化的華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶加上完全弗氏佐劑免疫家兔，15天后再用該蛋白加不完全弗氏佐劑加強(qiáng)免疫一次。采用經(jīng)15μg/ml重組華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶包被的滴定板做ELISA測(cè)定兔血清中抗體的滴度。用蛋白A-Sepharose從抗體陽性的家兔血清中分離總IgG。將多肽結(jié)合于溴化氰活化的Sepharose4B柱上，用親和層析法從總IgG中分離抗多肽抗體。免疫沉淀法證明純化的抗體可特異性地與華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶結(jié)合，該抗體是多克隆抗體，其瓊脂糖凝膠雙擴(kuò)試驗(yàn)的效價(jià)在1∶32以上。
實(shí)施例8本發(fā)明的多核苷酸片段用作雜交探針的應(yīng)用從本發(fā)明的多核苷酸中挑選出合適的寡核苷酸片段用作雜交探針有多方面的用途，如用該探針可與不同來源的正常組織或病理組織的基因組或cDNA文庫雜交以鑒定其是否含有本發(fā)明的多核苷酸序列和檢出同源的多核苷酸序列，進(jìn)一步還可用該探針檢測(cè)本發(fā)明的多核苷酸序列或其同源的多核苷酸序列在正常組織或病理組織細(xì)胞中的表達(dá)是否異常。從本發(fā)明的多核苷酸SEQ ID NO1中選擇寡核苷酸片段用作雜交探針，應(yīng)遵循以下原則和需要考慮的幾個(gè)方面探針大小優(yōu)選范圍為18-50個(gè)核苷酸；GC含量為30％-70％，超過則非特異性雜交增加；探針內(nèi)部應(yīng)無互補(bǔ)區(qū)域；符合以上條件的可作為初選探針，然后進(jìn)一步作計(jì)算機(jī)序列分析，包括將該初選探針分別與其來源序列區(qū)域(即SEQ ID NO1)和其它已知的基因組序列及其互補(bǔ)區(qū)進(jìn)行同源性比較，若與非靶分子區(qū)域的同源性大于85％或者有超過15個(gè)連續(xù)堿基完全相同，則該初選探針一般就不應(yīng)該使用；此外，再根據(jù)已設(shè)計(jì)好的探針片段或其互補(bǔ)片段的替換突變序列作為第二探針。
探針1(probe1)，屬于第一類探針，與SEQ ID NO1的基因片段完全同源或互補(bǔ)(40Nt)5’-caaagatattgtggtaacggttgaggccaaggacgcattc-3’ (Seq ID No7)探針2(probe2)，屬于第二類探針，相當(dāng)于SEQ ID NO1的基因片段或其互補(bǔ)片段的替換突變序列(40Nt)5’-caaagatattgtggtaacagttgaggccaaggacgcattc-3’ (Seq ID No8)核酸探針通常采用濾膜雜交方法，包括斑點(diǎn)印跡法、Southern印跡法、Northern印跡法和復(fù)印方法等，它們都是將待測(cè)的多核苷酸樣品固定在濾膜上后使用基本相同的步驟雜交。
與以下具體實(shí)驗(yàn)步驟有關(guān)的其它未列出的常用試劑及其配制方法請(qǐng)參考文獻(xiàn)DNAPROBES G.H.Keller；M.M.Manak；Stockton Press，1989(USA)以及更常用的分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)書籍如《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(1998年第二版)[美]薩姆布魯克等著，科學(xué)出版社。
步驟1)將新鮮或新鮮解凍的華支睪吸蟲用冷勻漿緩沖液(0.25mol/L蔗糖；25mmol/LTris-HCl，pH7.5；25mmol/LnaCl；25mmol/L MgCl2)懸浮沉淀(大約10ml/g)，4℃用電動(dòng)勻漿器以全速勻漿組織懸液，直至組織被完全破碎。用苯酚抽提法組織中的DNA，然后用乙醇沉淀。必須除去RNA污染時(shí)，可將RNA酶A加到DNA溶液中，終濃度為100ug/ml，37℃保溫30分鐘消化RNA，然后再重新抽提DNA。樣膜的制備2)取4×2張適當(dāng)大小的硝酸纖維素膜(NC膜)，用鉛筆在其上輕輕標(biāo)出點(diǎn)樣位置及樣號(hào)，每一探針需兩張NC膜，以便在后面的實(shí)驗(yàn)步驟中分別用高強(qiáng)度條件和強(qiáng)度條件洗膜。吸取及對(duì)照各15微升，點(diǎn)于樣膜上，在室溫中晾干。置于浸潤(rùn)有0.1mol/LNaOH，1.5mol/LNaCl的濾紙上5分鐘(兩次)，晾干置于浸潤(rùn)有0.5mol/L Tris-HCl(pH7.0)，3mol/LNaCl的濾紙上5分鐘(兩次)，晾干。夾于干凈濾紙中，以鋁箔包好，60-80℃真空干燥2小時(shí)。
3)探針用磷酸激酶標(biāo)記32P后過Sephadex G-50柱，用液體閃爍儀監(jiān)測(cè)同位素量，合并第一峰的收集液后即為所需制備的32P-Probe(第二峰為游離γ-32P-dATP)。
4)預(yù)雜交將樣膜置于塑料袋中，加入3-10mg預(yù)雜交液(10×Denhardt’s；6×SSC，0.1mg/ml CT DNA(小牛胸腺DNA)。)，封好袋口后，68℃水浴搖2小時(shí)。
5)雜交將塑料袋剪去一角，加入制備好的探針，封好袋口后，42℃水浴搖過夜。
6)洗膜高強(qiáng)度洗膜
取出已雜交好的樣膜；2×SSC，0.1％SDS中，40℃洗15分鐘(2次)；0.1×SSC，0.1％SDS中，40℃洗15分鐘(2次)；0.1×SSC，0.1％SDS中，55℃洗30分鐘(2次)，室溫晾干。
低強(qiáng)度洗膜取出已雜交好的樣膜；2×SSC，0.1％SDS中，37℃洗15分鐘(2次)；0.1×SSC，0.1％SDS中，37℃洗15分鐘(2次)；0.1×SSC，0.1％SDS中，40℃洗15分鐘(2次)，室溫晾干。
7)X-光自顯影-70℃，X-光自顯影(壓片時(shí)間根據(jù)雜交斑放射性強(qiáng)弱而定)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用低強(qiáng)度洗膜條件所進(jìn)行的雜交實(shí)驗(yàn)，以上四個(gè)探針雜交斑放射性強(qiáng)弱沒有明顯區(qū)別；而采用低強(qiáng)度洗膜條件所進(jìn)行的雜交實(shí)驗(yàn)，探針1的雜交斑放射性強(qiáng)度明顯強(qiáng)于其它三個(gè)探針雜交斑的放射性強(qiáng)度。因而可用探針1定性和定量地分析本發(fā)明的多核苷酸在不同組織中的存在和差異表達(dá)。
實(shí)施例9制備診斷試劑盒ELISA檢測(cè)試劑盒的制備將純化的華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶用碳酸鹽包被緩沖液((pH9.6)配成0.1mg/ml，96孔酶標(biāo)般的每孔加50ul，4℃過夜，倒掉包被液后，用含10％脫脂奶粉的PBS-Tween20溶液100ul封閉孔壁多余的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，4℃封閉過夜后倒掉封閉液。在酶標(biāo)板反應(yīng)孔中加入待測(cè)血清50ul，輕搖5分鐘后，靜置37℃濕盒中30～60分鐘，用PBS-Tween20洗滌液反復(fù)震蕩洗滌3次，每次3分鐘；再加辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人IgG(1∶1000稀釋液50ul)，重復(fù)上述結(jié)合和洗滌過程，然后加底物和顯色劑顯色，當(dāng)出現(xiàn)顯色明顯時(shí)，加入2％硫酸溶液終止反應(yīng)。肉眼觀察或用酶標(biāo)儀測(cè)定反應(yīng)結(jié)果。
膠體金免疫層析檢測(cè)試劑盒的制備常見的免疫層析系統(tǒng)有浸條式(dipstick)、卡片式和盒式三種。它們具有圖2所示的相同的基本原理和構(gòu)造由層析系統(tǒng)(層析膜和一個(gè)或兩個(gè)吸收層相連)固相免疫反應(yīng)系統(tǒng)(抗原或抗體呈線狀包被在層析膜特定的位置上作為測(cè)試線或質(zhì)控線)，樣品和膠體金標(biāo)記試劑從一端加入，在膜的毛細(xì)管作用下，沿膜表面向另一端移動(dòng)，并被吸收層吸收。樣品中的待測(cè)成分與膠體金檢測(cè)試劑在層析過程中與結(jié)合在膜上的捕獲試劑發(fā)生免疫結(jié)合反應(yīng)，而停留在包被線(包括測(cè)試線1和質(zhì)控線2)上，顯示出一條紅色的反應(yīng)線。當(dāng)樣品中不含待測(cè)成分，則在測(cè)試線1處不顯色，而作為陽性對(duì)照的質(zhì)控線2則顯紅色。浸條式檢測(cè)試劑盒將測(cè)試條下端先后加入待測(cè)樣品液和標(biāo)記的膠體金溶液中；卡片式和盒式檢測(cè)試劑盒中，標(biāo)記的膠體金以干燥的固體形式保存在一端的玻璃纖維片3上，卡片式只需將待測(cè)溶液和緩沖液直接滴加到玻璃纖維片上，合上卡片，幾分鐘后即可蓋面的觀察窗判斷結(jié)果；盒式將檢測(cè)條裝入小塑料盒中，放膠體金的一端對(duì)應(yīng)圓形的加樣孔，樣品和緩沖液從加樣孔加入，幾分鐘后從長(zhǎng)方形的觀察窗中判斷結(jié)果。在本檢測(cè)試劑盒中，層析膜為孔徑8μm的混合纖維素膜，純化的華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶包被在吸收層的遠(yuǎn)端作為檢測(cè)線，華支睪病人的陽性血清包被在吸收層的近端作為質(zhì)控線，標(biāo)記華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的膠體金溶液滴加到玻璃纖維片后干燥，放置在層析膜的另一端。
膠體金的制備及標(biāo)記將氯金酸鹽用去離子的超純水配成0.01％的濃度，煮沸后，迅速加入1％的檸檬酸三鈉溶液，(每100ml加2ml)，不離火迅速振搖混勻，一直煮到溶液顏色變?yōu)槠咸丫萍t色后撤火，用超純水補(bǔ)足原有體積。制備的膠體金的平均粒徑約20nm。將制備好的膠體金溶液用0.25mol/L的碳酸鉀溶液調(diào)pH 9.0，在攪拌情況下按15μg/mL的量加入純化的熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶，反應(yīng)10分鐘，15000g的離心力離心30分鐘，沉淀用原體積1/10的PBS(pH7.5)重新懸浮。
實(shí)施例10制備疫苗華支睪吸蟲是組織外寄生蟲，免疫系統(tǒng)難以直接與其作用。它產(chǎn)生的抗原刺激機(jī)體粘膜系統(tǒng)產(chǎn)生粘膜免疫反應(yīng)是其主要的保護(hù)性反應(yīng)。粘膜免疫產(chǎn)生的分泌型IgA，可以阻止分泌排泄抗原通過膽管上皮進(jìn)入肝細(xì)胞，從而降低這些抗原成分對(duì)機(jī)體的毒害作用，而不是直接對(duì)蟲體起到攻擊殺傷的作用。因此，華支睪吸蟲的疫苗以口服型疫苗為主，將重組熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶蛋白與卵磷脂1∶10混合，加入10倍的生理鹽水溶液，超聲震蕩，制成脂質(zhì)體，裝入緩釋膠囊，制成口服型重組蛋白疫苗。
序列表<110>中山大學(xué)<120>華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶，其編碼核酸及其應(yīng)用<130>cs002h05<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1134<212>DNA<213>Clonorchis sinensis<400>1ggggacacac gaggtcagtc gagcccgcgc attccgatct gctctttcgg ctctcgctgt 60gatggctgag gctcctattc gtgtgctgat aaccggtgct gctggccaaa ttgggtatgc120gctggccgga atggttgctc gtggggacat gtttggccac cataaagtta tcttacacct180ctttgatatt ccgccaatgt taacttccct tggcggcctg cgtatggaac ttgaagactg240tgcctttgaa acgctcaaag atattgtggt aacggttgag gccaaggacg cattcaaaga300tatcgacgtt gcattgctgg ttggggcgat gccaagaaaa gaaggcatgg agcggaaaga360tcttctgaaa gcaaatgtta acattttcaa ggaacagggc aaagctcttg accagtttgc420aaagaagacc gtcaaagttt tggttgtcgg aaaccctgcg aatacaaatt gcttaatgat480gagcaagaac gcaccgtcga ttccgcaaga aaacttcacg gccttatcac gtcttgattt540caatcgtgca aagtcacaga ttgcgctccg tcttggtgtg ccagtctcgg ccgttaaaaa600ttgcatcatt tgggggaacc acagcaacac ccagttcgct gatgttgcac atgcgaaggt660tatgttgcct ggcggtgaga aatccgtata tgaagctgtt aaagacgatt catggatccg720taacgaatat ctcagcacta ttcagaagcg tggtgcggcg attatttccg ccagaaaact780cagtagtgcg atgtccgctg ctaaagcaat agtggaccat atgcatgact ggtggtttgg840gacgaagccg ggagaatggg taacaatgtc tgtgattagc gatggatctt acggggcccc900tctggatatc atgttcagct ttcctgttga gataaaggat aaaaagtgga agatagtcaa960aaatctttca atggatgact gggctaagtc gaagttcaaa ataaccgcag atgaactagt 1020tgaagaacgc gaaatggctc tgagcaccta gataagcatt aatccggtca cgttatcctg 1080cactagttgt gttccttgta accattgatt ataatatgat gccttttatt agca 1134
<210>2<211>329<212>PRT<213>Clonorchis sinensis<400>2Met Ala Glu Ala Pro Ile Arg Val Leu Ile Thr Gly Ala Ala Gly Gln1 510 15Ile Gly Tyr Ala Leu Ala Gly Met Val Ala Arg Gly Asp Met Phe Gly20 25 30His His Lys Val Ile Leu His Leu Phe Asp Ile Pro Pro Met Leu Thr35 40 45Ser Leu Gly Gly Leu Arg Met Glu Leu Glu Asp Cys Ala Phe Glu Thr50 55 60Leu Lys Asp Ile Val Val Thr Val Glu Ala Lys Asp Ala Phe Lys Asp65 70 75 80Ile Asp Val Ala Leu Leu Val Gly Ala Met Pro Arg Lys Glu Gly Met85 90 95Glu Arg Lys Asp Leu Leu Lys Ala Asn Val Asn Ile Phe Lys Glu Gln100 105 110Gly Lys Ala Leu Asp Gln Phe Ala Lys Lys Thr Val Lys Val Leu Val115 120 125Val Gly Asn Pro Ala Asn Thr Asn Cys Leu Met Met Ser Lys Asn Ala130 135 140Pro Ser Ile Pro Gln Glu Asn Phe Thr Ala Leu Ser Arg Leu Asp Phe145 150 155 160Asn Arg Ala Lys Ser Gln Ile Ala Leu Arg Leu Gly Val Pro Val Ser165 170 175Ala Val Lys Asn Cys Ile Ile Trp Gly Asn His Ser Asn Thr Gln Phe180 185 190Ala Asp Val Ala His Ala Lys Val Met Leu Pro Gly Gly Glu Lys Ser195 200 205Val Tyr Glu Ala Val Lys Asp Asp Ser Trp Ile Arg Asn Glu Tyr Leu
210 215 220Ser Thr Ile Gln Lys Arg Gly Ala Ala Ile Ile Ser Ala Arg Lys Leu225 230 235 240Ser Ser Ala Met Ser Ala Ala Lys Ala Ile Val Asp His Met His Asp245 250 255Trp Trp Phe Gly Thr Lys Pro Gly Glu Trp Val Thr Met Ser Val Ile260 265 270Ser Asp Gly Ser Tyr Gly Ala Pro Leu Asp Ile Met Phe Ser Phe Pro275 280 285Val Glu Ile Lys Asp Lys Lys Trp Lys Ile Val Lys Asn Leu Ser Met290 295 300Asp Asp Trp Ala Lys Ser Lys Phe Lys Ile Thr Ala Asp Glu Leu Val305 310 315 320Glu Glu Arg Glu Met Ala Leu Ser Thr325<210>3<211>24<212>DNA<213>Clonorchis sinensis<400>3ggggacacac gaggtcagtc gagc24<210>4<211>26<212>DNA<213>Clonorchis sinensis<400>4tgctaataaa aggcatcata ttataa 26<210>5<211>35
<212>DNA<213>Clonorchis sinensis<400>5aatgatatca tggctgaggc tcctattcgt gtgct35<210>6<211>35<212>DNA<213>Clonorchis sinensis<400>6tataagcttc taggtgctca gagccatttc gcgtt35<210>7<211>40<212>DNA<213>Clonorchis sinensis<400>7caaagatatt gtggtaacgg ttgaggccaa ggacgcattc 40<210>8<211>40<212>DNA<213>Clonorchis sinensis<400>8caaagatatt gtggtaacag ttgaggccaa ggacgcattc 40
權(quán)利要求
1.一種分離的多肽-華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶，其特征在于它包含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽、或其多肽的活性片段、類似物或衍生物。
2.一種分離的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含選自下組中的一種(a)編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽或其片段、類似物、衍生物的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
3.如權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸的序列包含有SEQ ID NO1中62-1048位的序列或SEQ ID NO1中1-1134位的序列。
4.一種能與多肽結(jié)合的抗體，其特征在于所述抗體是能與所述華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶特異性結(jié)合的抗體。
5.一類調(diào)節(jié)多肽表達(dá)的多核苷酸，其特征在于它們是抑制所述華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的表達(dá)的多核苷酸，且具有SEQ ID NO1所示的多核苷酸序列或其片段的反義序列或者與其序列一致的寡聚雙鏈RNA。
6.如權(quán)利要求1所述多肽的應(yīng)用，其特征在于它應(yīng)用于篩選華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的抑制劑；或者用于肽指紋圖譜鑒定。
7.如權(quán)利要求2-3中的任一權(quán)利要求所述的多核苷酸的應(yīng)用，其特征在于它作為引物用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列。
8.一種檢測(cè)華支睪吸蟲的試劑盒，其特征在于它含有特異性檢測(cè)華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的引物、權(quán)利要求4所述的抗體、權(quán)利要求1所述的多肽任一或其組合。
9.一種用于預(yù)防華支睪吸蟲病的疫苗，其特征在于其含有權(quán)利要求1所述的多肽或含有權(quán)利要求2或3所述的多核苷酸的真核表達(dá)載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種編碼華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的新的基因，基因編碼的多肽，多肽的抗體。本發(fā)明還公開了此多肽用于篩選華支睪吸蟲熱穩(wěn)定型胞漿蘋果酸脫氫酶的抑制劑，多核苷酸作為引物或者作為探針的應(yīng)用，尤其公開了此多肽與多核苷酸作為診斷試劑盒、疫苗的用途。
文檔編號(hào)C12N15/53GK1670198SQ20051002400
公開日2005年9月21日 申請(qǐng)日期2005年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月22日
發(fā)明者余新炳, 徐勁, 吳忠道, 鄭南才, 楊光 申請(qǐng)人:中山大學(xué)