專利名稱：一種新型棘阿米巴原蟲及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物領(lǐng)域，涉及新的棘阿米巴原蟲株及其共培養(yǎng)分離胞內(nèi)菌的用途。
背景技術(shù)：
自由生活阿米巴是水體環(huán)境中重要的單細(xì)胞生物，以腐生食物為食，在控制環(huán)境微生物生態(tài)平衡中具有重要作用，主要包括棘阿米巴屬、耐格里屬、哈氏原蟲屬等。自由生活阿米巴可引起人類原發(fā)性阿米巴性腦炎、肉芽腫性腦炎、角膜炎、耳、鼻、皮膚和內(nèi)臟器官的感染等疾病。目前最重要的是發(fā)現(xiàn)越來越多的革蘭氏陰性菌能在自由生活阿米巴內(nèi)生存和繁殖，因此，環(huán)境阿米巴還可攜帶許多病原體，起到病原體的貯存宿主和傳播媒介的作用。
更重要的是由于有許多病原菌不能在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，只能在阿米巴原蟲中增殖，所以利用阿米巴原蟲來共培養(yǎng)分離某些臨床標(biāo)本，是目前分離難以人工培養(yǎng)的某些細(xì)菌和分離新發(fā)現(xiàn)的某些菌種有利的工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新型棘阿米巴原蟲株，所述原蟲株能通過阿米巴混合培養(yǎng)方法分離培養(yǎng)臨床胞內(nèi)菌如嗜肺軍團(tuán)菌、肺炎衣原體，以及其它臨床不明原因呼吸道感染的病原體分離培養(yǎng)。
本發(fā)明采用環(huán)境水體標(biāo)本經(jīng)過濾富集、無營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)、無菌化培養(yǎng)、克隆化培養(yǎng)獲得，從阿米巴滋養(yǎng)體、包囊結(jié)構(gòu)初步形態(tài)學(xué)上定為棘阿米巴，經(jīng)特異性PCR診斷及其18S rDNA基因序列擴(kuò)增測(cè)序，證實(shí)為一種新型棘阿米巴，具有序列1的序列，分類命名為棘阿米巴屬Acanthamoeba sp.(Acanthamoeba fdjd01)，保藏號(hào)CGMCCNo.1313，保藏日期2005年1月31日。
本發(fā)明提供的棘阿米巴原蟲屬國(guó)內(nèi)首次得到環(huán)境棘阿米巴原蟲分離株的核酸序列信息及其功能，補(bǔ)充了我國(guó)阿米巴原蟲保存，提供了我國(guó)原蟲學(xué)有價(jià)值的生物信息，本發(fā)明原蟲株可作為分離臨床胞內(nèi)菌如軍團(tuán)菌、副衣原體等不能用常規(guī)方法分離培養(yǎng)的病原體的分離工具。
本發(fā)明通過下述方法與步驟進(jìn)行1.阿米巴原蟲的分離克隆化培養(yǎng)(1)標(biāo)本的采集和預(yù)處理用滅菌試劑瓶取水塘表面水樣，用滅菌針式超濾器加濾膜過濾，取出濾膜，蓋于涂有滅活的E.coli的無營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NNA)培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)。顯微鏡下觀察平板上吞噬空斑及蟲體活動(dòng)。
(2)原蟲無菌化培養(yǎng)標(biāo)記上述培養(yǎng)陽性蟲體集落，切塊，將含有蟲株的瓊脂塊倒置另培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)若干次，擺脫雜菌后無菌化。
(3)蟲株克隆化無菌條件，挑取含有單個(gè)滋養(yǎng)體或包囊，接入新的培養(yǎng)基或培養(yǎng)瓶中，進(jìn)行擴(kuò)大化培養(yǎng)，獲取無菌克隆化的蟲株。
(4)蟲株液體培養(yǎng)將克隆化的原蟲株接種入含有PYG712培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，30℃培養(yǎng)，相差顯微鏡觀察。并獲取原蟲的純培養(yǎng)產(chǎn)物。
2.蟲株的鑒定(1)形態(tài)學(xué)鑒定，(2)阿米巴特異性PCR分子診斷，(3)18sDNA測(cè)定。
本發(fā)明采用的環(huán)境阿米巴分離方法參考Page的分離方法。(PageFC.A new key to freshwater and soil gymnamoeba.Freshwater biologicalassocistion，Ambleside，Cumbria.UK.122pp)本發(fā)明方法中原蟲的形態(tài)學(xué)鑒定參考(Page FC.Redifinition of the genus Acanthamoeba with descriptions ofthree species，J.PROTOZOOL.1967，14，709-724；Pussard M，Pons R.Morphologie de la paroi kystique et taxonomie dugenre Acanthamoeba(protozoa，Amoebida).
Protistologiica，1977，13，557-598)所述的PCR引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成，18s rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物由博亞公司提純并測(cè)序。
本發(fā)明不僅對(duì)我國(guó)原蟲保存是一種補(bǔ)充，同時(shí)提供了我國(guó)阿米巴原蟲方面提供有價(jià)值的生物信息，并且此原蟲已經(jīng)實(shí)驗(yàn)室證實(shí)，嗜肺軍團(tuán)菌、副衣原體BN9、霍亂弧菌0139以能在滋養(yǎng)體內(nèi)生存繁殖。證實(shí)本發(fā)明棘阿米巴原蟲可能是許多胞內(nèi)菌的重要的環(huán)境貯存宿主和傳播媒介。更重要的是本發(fā)明原蟲可為通過混合培養(yǎng)方法分離臨床呼吸系統(tǒng)不明原因感染體的有用工具。


圖1棘阿米巴原蟲的滋養(yǎng)體。
圖2棘阿米巴原蟲的包囊。
圖3特異性引物下PCR產(chǎn)物電泳照片圖4副衣原體在此原蟲內(nèi)生存繁殖。
圖5霍亂弧菌0139在此原蟲內(nèi)生存圖6嗜肺軍團(tuán)菌在此原蟲內(nèi)生存繁殖具體實(shí)施方式
實(shí)施例11、阿米巴原蟲的分離克隆化培養(yǎng)(1)標(biāo)本的采集和預(yù)處理用滅菌試劑瓶取水塘表面水樣500ml，用滅菌針式超濾器加孔徑約為4.5um的濾膜過濾，過濾后在無菌條件下取出濾膜，翻轉(zhuǎn)后蓋于涂有滅活的E.coli的無營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NNA)培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)。每天相差顯微鏡下觀察平板上是否存在吞噬空斑及蟲體活動(dòng)，7天未見生長(zhǎng)者為陰性。
(2)原蟲無菌化培養(yǎng)將培養(yǎng)陽性，有遷移遠(yuǎn)離接種中心的蟲體集落，進(jìn)行標(biāo)記，采用切塊方法，將切下含有蟲株的瓊脂塊倒置于另一，30℃培養(yǎng)，相隔數(shù)天后，繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)若干次后，達(dá)到擺脫雜菌后無菌化的目的。
(3)蟲株克隆化無菌的條件下，在倒置顯微鏡下，用無菌解部針，挑取含有單個(gè)滋養(yǎng)體或包囊，接入新的培養(yǎng)基或培養(yǎng)瓶中，進(jìn)行擴(kuò)大化培養(yǎng)，獲取無菌克隆化的蟲株。
(4)蟲株液體培養(yǎng)將克隆化的原蟲株接種入5ml的含有PYG712培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，30℃培養(yǎng)，相差顯微鏡觀察。并獲取原蟲的純培養(yǎng)產(chǎn)物。
2.蟲株的鑒定(1)形態(tài)學(xué)鑒定在相差顯微鏡下對(duì)阿米巴滋養(yǎng)體和囊胞的形態(tài)的特征初步鑒定。
(2)阿米巴特異性PCR分子診斷，采用特異性棘阿米巴引物擴(kuò)增相關(guān)片斷。
3)18s DNA測(cè)定用化學(xué)裂解法提取原蟲DNA；經(jīng)PCR循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物提純后在ABI3730型DNA序列自動(dòng)分析儀上測(cè)序并進(jìn)行分析。
結(jié)果顯示1.經(jīng)阿米巴原蟲的環(huán)境分離步驟，所獲得的自由生活阿米巴，能在NNA及PYG712培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。具有典型的滋養(yǎng)體、包囊的生活周期，滋養(yǎng)體表現(xiàn)出典型的棘狀結(jié)構(gòu)，無鞭毛期，滋養(yǎng)體的形態(tài)表現(xiàn)為大滋養(yǎng)體，呈不定型，直徑大小30-60um，包囊呈圓形，含有雙層殼，內(nèi)殼膜呈紋狀，直徑約為20um。
2.分離阿米巴原蟲經(jīng)棘阿米巴特異性引物引導(dǎo)的PCR成功擴(kuò)增出220bp目標(biāo)條帶，PCR結(jié)果確診為棘阿米巴原蟲株。
3.分離的阿米巴原蟲經(jīng)阿米巴通用引物引導(dǎo)的PCR成功擴(kuò)增出458bp目標(biāo)條帶，分別位于18s rDNA內(nèi)的目的片段，純化測(cè)序。通過GenBank的blastp程序進(jìn)行相近基因的檢索比對(duì)，此株阿米巴原蟲與其它棘阿米巴原蟲的18s rDNA序列有90-96％同源性。
序列1<110>復(fù)旦大學(xué)<120>一種新型棘阿米巴原蟲及其用途<213>Acanthamoeba sp<221>18s rDNA<222>458GTGTA GGAGC CTGCG GCTTa aTTTG ACTCA ACACG GGGAAACTCA CCAGG TCCAG ACACA ATAAG GATTG ACAGA TTGATAGCTC TTTCT TGATC TTGTG GTTGG TGGTG CATGG CCGTTCTTAG TTGGT GGAGT GATTT GTCTG GTTAA TTCCG ATAACGAACG AGACC TTAAC CTGCT AAATA GACCA GCCGG CTTTGGCTAG CTGCT GTCTT CTTAG AGGGA CTATC AGCGT TTAGCTGATG GAAGT TTGAG GCAAT AACAG GTCTG TGATG CCCTTAGATG TTCTG GGCCG CACGC GCGCT ACACT GACAG AGCCAGCGAG TCTAC CACCT TTGCC GGAAG GCATG GGTAA TCTTGTGAAA CTCTG TCGTG ATGGG GATAG AACAT TGCAA TTATTGTTCT TCAAC GAGGA ATACC TAGTA AGCGT GATTC ATCAGCTCGC gTTGA ATTAC GTA
權(quán)利要求
1.一種新型棘阿米巴原蟲，其特征是具有典型的滋養(yǎng)體、包囊的生活周期，滋養(yǎng)體具有典型棘狀結(jié)構(gòu)，無鞭毛期，其形態(tài)表現(xiàn)為大滋養(yǎng)體，呈不定型，直徑為30-60um，包囊呈圓形，含有雙層殼，內(nèi)殼膜呈紋狀，直徑約為20um，能在NNA及PYG712培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，具有序列1的序列，與其它棘阿米巴原蟲的18s rDNA序列有90-96％同源性，命名為Acanthamoeba fdjd01，保藏號(hào)CGMCC No.1313，保藏日期2005年1月31日。
2.按權(quán)利要求1所述的新型棘阿米巴原蟲在混合培養(yǎng)分離臨床胞內(nèi)菌的用途。
3.按權(quán)利要求2所述的用途，其中所述的胞內(nèi)菌是嗜肺軍團(tuán)菌或肺炎衣原體或其它臨床不明原因呼吸道感染的病原體。
全文摘要
本發(fā)明屬微生物原蟲領(lǐng)域，具體涉及一種棘阿米巴蟲及其用途。本發(fā)明通過環(huán)境自由生活阿米巴分離方法從池塘水環(huán)境中分離出新的棘阿米巴原蟲，經(jīng)形態(tài)學(xué)、PCR分子診斷及18S rDNA序列分析證實(shí)為新的棘阿米巴株，命名為Acanthamoeba fdjd01，保藏號(hào)保藏號(hào)CGMCC No.1313，保藏日期2005年1月31日。CGMCC No.。本發(fā)明原蟲提供了境棘阿米巴原蟲分離株的核酸序列等生物信息及其功能，補(bǔ)充了我國(guó)阿米巴原蟲保存，本發(fā)明原蟲株可作為分離臨床胞內(nèi)菌如軍團(tuán)菌、副衣原體等不能用常規(guī)方法分離培養(yǎng)的病原體的分離工具。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1683512SQ20051002384
公開日2005年10月19日 申請(qǐng)日期2005年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月5日
發(fā)明者李勤學(xué), 姜慶五 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)