專利名稱：用擴(kuò)張床吸附技術(shù)及親和層析技術(shù)制備胰激肽釋放酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用擴(kuò)張床吸附技術(shù)及親和層析技術(shù)制備胰激肽釋放酶的方法。
背景技術(shù)：
胰激肽釋放酶(Pancreatic Kallikrein)，又稱胰激肽原酶(PancreaticKininogenase)或血管舒緩素(Kallidinogenase)，是絲氨酸蛋白酶家族的一個亞類。胰激肽釋放酶能水解激肽原產(chǎn)生活性物質(zhì)激肽，激肽能介導(dǎo)廣泛的生理生化反應(yīng)，包括擴(kuò)張毛細(xì)血管、增加血管的通透性、改善微循環(huán)、調(diào)整血壓等，臨床上，胰激肽釋放酶除應(yīng)用于治療高血壓、心腦血管疾病、糖尿病、男性不育癥疾病之外，還應(yīng)用于治療絞痛、血管痙攣、肢端感覺異常、凍瘡、燙傷等癥，而且在新興保健品、抗衰老化妝品行業(yè)中也越來越受到關(guān)注。
胰激肽釋放酶可以從哺乳動物胰臟、胰酶粉及胰激肽釋放酶粗品中提取純化而得。傳統(tǒng)的分離純化方法有凝膠過濾、親和層析、離子交換法等。文獻(xiàn)報道，從豬胰中分離純化胰激肽釋放酶的一般工藝路線為將豬胰臟絞碎，提取，活化，過濾，沉淀，丙酮脫脂脫水得到胰激肽釋放酶粗品，粗品再用緩沖液提取，離心，所得上清上層析柱，經(jīng)洗滌、洗脫、透析脫鹽、冷凍干燥等步驟后，獲得胰激肽釋放酶成品。很明顯，傳統(tǒng)工藝的前期處理過于繁瑣，成為優(yōu)化胰激肽釋放酶分離純化過程的瓶頸，影響該技術(shù)走向產(chǎn)業(yè)化。酶或其他蛋白的制備過程可分為目標(biāo)產(chǎn)物捕獲、中期純化和精制三個階段，其中，目標(biāo)產(chǎn)物捕獲階段最為關(guān)鍵。通常將組織提取液離心除去固體顆粒，獲得目標(biāo)產(chǎn)物的清液，再經(jīng)超濾濃縮得濃縮液，進(jìn)行下步的層析分離。但當(dāng)組織提取液中含有大量高粘度固體顆粒時，離心效率大大降低，影響隨后的層析分離效果。擴(kuò)張床吸附(Expanded Bed Adsorption，EBA)技術(shù)是九十年代發(fā)展的一種蛋白質(zhì)分離純化的新技術(shù)，能直接從組織提取液中捕獲目標(biāo)產(chǎn)物，集固液分離、濃縮和初純化于一體，減少了操作步驟，縮短了操作時間，節(jié)約了生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用擴(kuò)張床吸附技術(shù)及親和層析技術(shù)制備胰激肽釋放酶的方法，從豬胰腺中提取純化胰激肽釋放酶，簡化生產(chǎn)工藝步驟，提高生產(chǎn)效率。
本發(fā)明是這樣來實(shí)現(xiàn)的，首先用擴(kuò)張床吸附技術(shù)直接純化豬胰提取液，再用親和層析技術(shù)進(jìn)一步純化制得高純度胰激肽釋放酶。
利用擴(kuò)張床吸附技術(shù)直接純化豬胰提取液的工藝步驟為(1)將豬胰臟除盡脂肪組織及結(jié)締組織，切成小塊絞碎，然后在pH5-8的NaAc-HAc緩沖液中攪拌提取2-4小時，提取溫度為4℃，將提取液過濾，上清備擴(kuò)張床吸附層析使用；(2)用0.01M-0.05M，pH5-8的緩沖液平衡吸附層析柱后，將過濾所得上清上擴(kuò)張床吸附柱；(3)吸附結(jié)束后，用甘油溶液洗滌3-4個柱床，至洗滌液在OD280無吸收峰；(4)用低濃度液為0.01M-0.05M，pH5-8，高濃度液為0.01M-0.05M-1.0M NaCl，pH5-8的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫體積為10-20個柱床。
用親和層析技術(shù)純化胰激肽釋放酶工藝步驟如下(1)將偶聯(lián)了胍基類配基的親和層析材料裝柱，用0.05M-0.5M，pH5.5-8.5的緩沖液平衡；(2)將經(jīng)擴(kuò)張床吸附層析初純化的胰激肽釋放酶洗脫液超濾濃縮后上上述平衡好的親和層析柱；(3)吸附后，用0.05M-0.5M，pH5.5-8.5的緩沖液洗滌3-5個柱床，至洗滌液在OD280無吸收峰；(4)用低濃度液為0.05M-0.5M，pH5.5-8.5，高濃度液為0.05M-0.5M-1.0MNaCl，pH5.5-8.5的洗脫液，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫體積為10-20個柱床。
本發(fā)明利用擴(kuò)張床吸附技術(shù)，并與親和層析技術(shù)結(jié)合，從豬胰腺中提取胰激肽釋放酶。所得胰激肽釋放酶單位效價＞800KU/mg，比活超過1400KU/mg.p，活性回收率＞90％。本工藝簡化了生產(chǎn)步驟，提高了生產(chǎn)效率，改進(jìn)了產(chǎn)品品質(zhì)，適宜于工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式
以下是本發(fā)明的一個具體實(shí)施例1、提取取新鮮或冷凍豬胰臟5kg，將脂肪組織及結(jié)締組織等雜物剔除，切塊，然后進(jìn)行絞碎，加入3(L/kg)倍量，pH6.0的NaAc-HAc緩沖液(Ca2+濃度為5％)，同時向提取液中加適量EDTA螯合重金屬離子，4℃條件下緩慢攪拌(70-100rpm)3小時后，靜置，過濾，所得濾液18L，即為豬胰激肽釋放酶粗提液，取樣測定蛋白質(zhì)濃度為48.80mg/ml，胰激肽釋放酶效價為24.89KU/ml；2、擴(kuò)張床吸附純化選用吸附柱(10cm×50cm)，裝Streamline-DEAE 1000ml，用0.01M PB，pH6.0平衡液平衡柱子后，將豬胰激肽釋放酶粗提液18L上樣吸附。吸附結(jié)束后，用甘油溶液有效地將未吸附的雜蛋白洗出，而且對床層的穩(wěn)定性無影響，洗滌3-4個柱床，至洗滌液在OD280無吸收峰，然后照固定床模式進(jìn)行梯度洗脫，低濃度液為0.01M PB，pH6.0，高濃度液為0.01M PB-1.0MNaCl，pH6.0，洗脫總體積為20L，收集洗脫液5L進(jìn)行超濾濃縮，以備親和層析使用；3、親和層析純化將胍基類小分子偶聯(lián)到固相化載體如Sepharose、葡聚糖、纖維素等，本發(fā)明采用pAB-Sepharose膠100ml裝柱(4.2cm×7.5cm)，用0.1M PB，pH7.0的緩沖液平衡層析柱，將超濾濃縮的擴(kuò)張床洗脫液上樣。吸附后，用0.1M PB，pH7.0洗滌3-5個柱床，至洗滌液在OD280無吸收峰，然后用低濃度液為0.1M PB，pH7.0，高濃度液為0.1M PB-1.0MNaCl，pH7.0進(jìn)行梯度洗脫，洗脫總體積為2L，收集洗脫液；4、超濾濃縮與冷凍干燥采用截留分子量為10KD的超濾膜超濾濃縮后，進(jìn)行冷凍干燥得激肽釋放酶產(chǎn)品。
提取純化過程中的各項指標(biāo)如表1所示。
表1擴(kuò)張床吸附和親和層析純化激肽釋放酶的效果 本發(fā)明在豬胰激肽釋放酶的工業(yè)化生產(chǎn)中率先使用擴(kuò)張床吸附技術(shù)處理豬胰粗提液，采用胍基類親和層析純化胰激肽釋放酶，產(chǎn)品的質(zhì)量指標(biāo)及活性回收率達(dá)到國內(nèi)領(lǐng)先水平。擴(kuò)張床吸附技術(shù)是一種具有集成化優(yōu)勢的分離純化技術(shù)，在蛋白質(zhì)分離純化過程中有十分廣闊的應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.一種用擴(kuò)張床吸附技術(shù)及親和層析技術(shù)制備胰激肽釋放酶的方法，其特征在于首先用擴(kuò)張床吸附技術(shù)直接初純化豬胰提取液，再用親和層析技術(shù)進(jìn)一步純化制得高純度胰激肽釋放酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用擴(kuò)張床吸附技術(shù)及親和層析技術(shù)制備胰激肽釋放酶的方法，其特征在于擴(kuò)張床吸附技術(shù)純化豬胰提取液的工藝步驟為1)將豬胰臟除盡脂肪組織及結(jié)締組織，切成小塊絞碎，然后在pH5-8的NaAc-HAc緩沖液中攪拌提取2-4小時，提取溫度為4℃，將提取液過濾，上清備擴(kuò)張床吸附層析使用；2)用0.01M-0.05M，pH5-8的緩沖液平衡吸附層析柱后，將過濾所得上清上擴(kuò)張床吸附柱；3)吸附結(jié)束后，用甘油溶液洗滌3-4個柱床，至洗滌液在OD280無吸收峰；4)用低濃度液為0.01M-0.05M，pH5-8，高濃度液為0.01M-0.05M-1.0M NaCl，pH5-8的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫體積為10-20個柱床。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用擴(kuò)張吸附技術(shù)及親和層析技術(shù)制備胰激肽釋放酶的方法，其特征在于親和層析技術(shù)純化胰激肽釋放酶的工藝步驟如下(1)將偶聯(lián)了胍基類配基的親和層析材料裝柱，用0.05M-0.5M，pH5.5-8.5的緩沖液平衡；(2)將經(jīng)擴(kuò)張床吸附層析初純化的胰激肽釋放酶洗脫液超濾濃縮后上上述平衡好的親和層析柱；(3)吸附后，用0.05M-0.5M，pH5.5-8.5的緩沖液洗滌3-5個柱床，至洗滌液在OD280無吸收峰；(4)用低濃度液為0.05M-0.5M，pH5.5-8.5，高濃度液為0.05M-0.5M-1.0MNaCl，pH5.5-8.5的洗脫液，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫體積為10-20個柱床。
全文摘要
一種利用擴(kuò)張床吸附技術(shù)及親和層析技術(shù)制備胰激肽釋放酶的方法，其特征在于首先用擴(kuò)張床吸附技術(shù)直接初純化豬胰提取液，再用親和層析技術(shù)進(jìn)一步純化制得高純度胰激肽釋放酶。本發(fā)明利用擴(kuò)張床吸附技術(shù)，并與親和層析技術(shù)結(jié)合，從豬胰腺中提取胰激肽釋放酶，所得胰激肽釋放酶單位效價＞800KU/mg，比活超過1400KU/mg.p，活性回收率＞90％。本工藝簡化了生產(chǎn)步驟，提高了生產(chǎn)效率，改進(jìn)了產(chǎn)品品質(zhì)，適宜于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12N9/76GK1800379SQ20051002008
公開日2006年7月12日 申請日期2005年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月16日
發(fā)明者張萬山, 楊華英, 姜春華, 張志武, 曾英, 劉蘭花, 朱月華, 李菊根, 楊益輝, 付三枚 申請人:南昌市萬華生化制品有限公司