專利名稱：一種寬宿主譜產(chǎn)超廣譜β－內(nèi)酰胺酶大腸桿菌噬菌體及其分離獲得方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種寬宿主譜產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌噬菌體及其分離獲得方法，屬于微生物生物工程領域。
背景技術：
隨著人類對抗菌藥物廣泛及不合理應用，耐藥性細菌大量出現(xiàn)，多重耐藥菌的產(chǎn)生及傳播已成為全世界高度關注的問題。人們試圖通過不斷研制新抗菌藥物來對付細菌日益復雜的耐藥性，但一種新的抗菌藥物在臨床應用后，仍將面對細菌耐藥性的產(chǎn)生。
β-內(nèi)酰胺類抗生素是指分子結構中含有β-內(nèi)酰胺環(huán)的一大類抗生素，包括青霉素類、頭孢菌素類及非黃型β-內(nèi)酰胺類。β-內(nèi)酰胺類抗生素通過抑制青霉素結合蛋白(Penicillin binding proteins，PBPs)發(fā)揮治療作用，阻止細菌細胞壁粘肽(Mucopiptide)的合成，阻止粘肽鏈的交叉連結，使細菌無法形成細胞壁，從而導致細菌溶解并死亡。
超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamases，ESBLs)是指由細菌質(zhì)粒介導的能水解氧亞氨基β-內(nèi)酰胺抗生素，能使第三代頭孢菌素(如頭孢他啶、頭孢唑肟、頭孢曲松)和單菌霉素(如氨曲南)失活的一類酶。1983年德國學者knothe首先報道ESBLs以來，許多國家都相繼發(fā)現(xiàn)產(chǎn)ESBL細菌的出現(xiàn)，目前全世界產(chǎn)ESBL細菌在臨床標本中的分離率有增加的趨勢。ESBLs主要由腸桿菌科細菌產(chǎn)生，以大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌為代表，10％-20％的菌株產(chǎn)ESBLs。ESBLs的產(chǎn)生使治療更為困難，使得抗菌藥物的選擇范圍更窄。大大減少抗菌藥物的選擇余地，常導致臨床治療的失敗、感染的復發(fā)，并增加死亡的危險性。
自從1915年英國細菌學家Twort和1917法國細菌學家d′Herelle觀察到噬菌體以來，人們對噬菌體的研究日益深入。噬菌體是一類特異的細菌病毒，有毒性噬菌體和溫和噬菌體兩種類型。毒性噬菌體在宿主菌內(nèi)以復制方式進行增殖，裂解宿主菌。美國、英國、法國、澳大利亞、波蘭、前蘇聯(lián)等國有的科學家一直在研究用裂解性的噬菌體來治療細菌感染。前蘇聯(lián)，噬菌體制劑被長期大量用于軍隊中腹瀉的控制并取得顯著效果。在東歐國家(如波蘭)及法國，噬菌體作為一種治療感染的手段也被長期使用并有成品制劑在市場出售。
近年來，人們已經(jīng)注意到產(chǎn)ESBL細菌的檢出率較高，其產(chǎn)生的耐藥性已成為全球性的臨床治療難題，產(chǎn)ESBL細菌感染導致住院時間延長，費用增加及死亡率增高等。在這種嚴峻的情況下，各國也都采取合理使用抗生素、減少抗生素應用的選擇性及盲目性，加強對細菌耐藥率監(jiān)測，定期通報細菌耐藥情況等措施。但ESBLs由質(zhì)粒介導可在菌株間轉移和傳播，不易控制醫(yī)院交叉感染和院外細菌擴散。ESBLs菌株不但對大部分β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，而且也對氨基糖苷類、氟哇諾酮類和磺胺類耐藥。目前臨床對于產(chǎn)ESBL細菌感染，使用β-內(nèi)酰胺酶抑制劑也可取得一定療效，但腸科桿菌容易對β-內(nèi)酰胺酶抑制劑產(chǎn)生耐藥。對產(chǎn)ESBL細菌耐藥性分析表明，亞胺培南抗菌作用最強，可作為臨床治療產(chǎn)ESBL細菌感染的首選藥，但是一種新的抗菌藥物在臨床應用后，仍不可避免地面對細菌耐藥性的產(chǎn)生。因此，積極面對產(chǎn)ESBL細菌耐藥性這一世界性難題，將噬菌體應用于產(chǎn)ESBL細菌感染的治療中，有著極為廣闊前景
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人經(jīng)過廣泛的研究，分離獲得一種寬宿主譜產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882，它能有效地在體內(nèi)、體外殺滅產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌φ9882。本發(fā)明人在進一步研究中發(fā)現(xiàn)，該噬菌體能在體內(nèi)外裂解多株臨床分離產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌，具有較寬的宿主譜。
因而，本發(fā)明的一種寬宿主譜產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882，它能夠在體內(nèi)、體外有效地殺滅臨床分離的產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌。
本發(fā)明的第二個目的是公開分離獲得本發(fā)明的噬菌體的分離方法。
本發(fā)明的第三個目的是證實了寬噬噬菌體作為一種治療性物質(zhì)應用臨床抗產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌感染治療的優(yōu)越性及可行性，在臨床抗產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌感染治療開發(fā)和應用中可以成為有效的生物制劑。
根據(jù)本發(fā)明，寬宿主譜產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882在培養(yǎng)皿上可以形成較大的透亮空斑，并且對所收集的30株產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌臨床分離株中的11株有裂解作用，裂解率為36.67％，其所能裂解的臨床分離株如下產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌9716、9719、9539、9853、9854、9860、9882、9730、9739、9914、1068。采用本發(fā)明的噬菌體用于小鼠菌血癥的治療，在MOI≥0.0001(multiple of infection，感染復數(shù))時可以治愈全部小鼠。即使在延遲3小時治療的情況下(此時小鼠已經(jīng)出現(xiàn)明顯的全身感染癥狀如無活力、卷毛、弓背、眼周膿性滲出物聚集等)仍有20％的療效。體內(nèi)、體外實驗均證明本發(fā)明的噬菌體為一種有效的抗感染物質(zhì)，具有臨床應用的潛在藥學價值。
分離獲得本發(fā)明的噬菌體的過程如下取同濟醫(yī)院污水處理中心處理前污水1L，加NaCl58g，10,000×g離心10min。取上清，加PEG-8000至終濃度為10％(w/v)，置4 ℃冰箱過夜后在4℃，10，000×g離心20min。用5ml SM Buffer重懸沉淀。等體積氯仿抽提一次。300μl處理后的污水與200μl過夜培養(yǎng)的產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌φ9882，37℃孵育20min，與3ml熔化頂層瓊脂在于50℃混勻，鋪平皿，冷卻后倒置于37℃過夜培養(yǎng)。次日在培養(yǎng)皿上發(fā)現(xiàn)數(shù)個大小不等透亮空斑。用tip頭取下其中最大的空斑，溶于2mlLB培養(yǎng)液中，按1∶100的比例向該培養(yǎng)液中加入過夜培養(yǎng)的產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌φ9882，37℃，250轉振搖4.5～5小時。12000轉離心5分鐘，取80％上清4℃保存。取此上清再與產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌φ9882于固體培養(yǎng)基上共培養(yǎng)，用tip挑取較大噬斑。如此反復3次，即可得到大小均一的噬斑。取出噬斑，按上述方法進行小量擴增，得到液態(tài)的噬菌體擴增液。將過夜培養(yǎng)的宿主菌按1∶100稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)至早期對數(shù)生長期。加入前述濃縮噬菌體10μl，繼續(xù)培養(yǎng)5h，加入1/10體積的氯仿，繼續(xù)振搖10分鐘后，分別加入DNase I及RNase A至終濃度均為1μg/ml，室溫放置30分鐘，離心除去細菌碎片。加1/6體積的PEG/NaCl，4℃過夜。次日，4℃，12,000×g離心20min。用1ml SM Buffer重懸沉淀。加入1/6體積PEG/NaCl再次沉淀，冰上孵育1h，4℃，12,000×g離心20min。用200μl SMBuffer重懸沉淀，即得到擴增的噬菌體，經(jīng)過反復擴增可以達到所需的滴度。
本發(fā)明的一種寬宿主譜產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882已于2005年5月16日在中國典型微生物保藏中心(中國武漢市，武漢大學，布達佩斯條約保藏單位)保藏，并收到保藏登記號CCTCC NOM205044。
本發(fā)明一種寬宿主譜產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882(CCTCC NOM205044)，其具有相對較寬宿主譜。
本發(fā)明分離獲得的寬宿主譜產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882的方法。
本發(fā)明寬宿主譜產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882的宿主細胞是產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌φ9882，它可作用一種治療性物質(zhì)用來制備有效的生物制劑。
本發(fā)明一種寬宿主譜產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882，其具有體內(nèi)抗感染效應。
本發(fā)明所采用的培養(yǎng)基具有以下組成LB培養(yǎng)基1％tryptone、0.5％Yeast extract和1％NaCl。固體瓊脂1％tryptone、0.5％Yeastextract和1％NaCl及1.5％Agar。頂層瓊脂1％tryptone、0.5％Yeastextract和1％NaCl及0.7％Agarose。SM Buffer由0.1M NaCl，0.01MMgSO4·7H2O，0.05M Tris-HCl(pH7.5)和0.01％gelatin(明膠)配制而成。PEG/NaCl由20％PEG-8000和2.5MNaCl配制而成。
本發(fā)明的一種寬宿主譜產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882(CCTCC NOM205044)具有以下微生物學特征1、形態(tài)學特性磷鎢酸負染色電子顯微鏡觀察，電鏡超微結構顯示，此噬菌體為直徑70nm微球形顆粒，棱角不明顯，可見100nm長尾軸(如圖1)。
2、培養(yǎng)學特性本發(fā)明的噬菌體株在宿主菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌φ9882的固體培養(yǎng)基上可以形成透亮空斑，空斑直徑2-3mm，周圍無暈環(huán)。
3、生物學特性本發(fā)明的噬菌體株可以快速的吸附于宿主菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌φ9882上，在5分鐘內(nèi)的吸附率達到98％(如圖2)。該噬菌體的一步生長曲線(如圖3)，從中可以看出該噬菌體感染宿主菌的潛伏期為30-40分鐘，平均裂解量為110。潛伏期短，裂解量大，說明該寬噬噬菌體具有很強的裂解效應。
本發(fā)明的一種寬宿主譜產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882，能同時裂解臨床分離的11株產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶株大腸桿菌，其寬噬率為36.67％，滴度為8.1×1018pfu/ml。同時寬宿主譜產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882不能裂解金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌，甲型溶血性鏈球菌和乙型溶血性鏈球菌等其它菌屬的菌株。
本發(fā)明人已經(jīng)證實，分離獲得的寬宿主譜產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882在動物實驗(BlAB/c小鼠，雌性，體重為20.0±0.5g)中可以有效地治療產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌φ9853的感染。本發(fā)明的一種寬宿主譜產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882能治療小鼠產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌感染，且對易感宿主菌感染有明顯的治療效果。
本發(fā)明通過借助下列實施例將更詳細說明本發(fā)明。以下實施例僅是說明性的，應當指出，本發(fā)明并不受這些實施例的限制。

圖1φ9882的電鏡照片，該噬菌體呈正多面體的頭部結構，直徑70nm，有尾軸機構。尾軸長100nm。
圖2噬菌體φ9882的吸收曲線，在5分鐘內(nèi)的吸附率達到98％(如圖2)。
圖3噬菌體φ9882的一步生長曲線，該噬菌體感染宿主菌的潛伏期為30-40分鐘，平均裂解量為110。潛伏期短，裂解量大，說明該噬菌體具有很強的裂解效應。
圖4寬噬噬菌體的篩選以產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌φ9561為宿主菌制成均勻的菌苔，然后在培養(yǎng)皿的背部劃分20個小方格，在格內(nèi)滴加噬菌體，具有裂解性的噬菌體則可以形成透亮的空斑。
圖5產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌φ9853感染小鼠最小致死量的確定，3×107-1×108CFU的菌液均可以導致全部小鼠死亡，而1×107-2×107CFU的菌液不會引起全部小鼠死亡。因此，3×107CFU為引起小鼠死亡的最小致死量。
圖6最小致死量的精確時相性分析，MLD的菌液經(jīng)腹腔注射于10只小鼠，小鼠在8～14小時內(nèi)死亡。
圖7不同劑量噬菌體治療效果，噬菌體劑量在MOI≥0.0001的情況下全部小鼠均可存活并最終痊愈。
圖8噬菌體延遲治療效果，在延遲40分鐘內(nèi)的情況下，全部瀕死的小鼠均可治愈。而在延遲治療1小時以上時，由于此時小鼠的狀態(tài)較差，已出現(xiàn)明顯的感染癥狀如卷毛、弓背、眼周滲出物聚集等，噬菌體的效果有所下降，但仍具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
具體實施方式實施例1取同濟醫(yī)院污水處理中心污水1L，加NaCl58g，10,000×g離心10min。取上清，加PEG-8000至終濃度為10％(w/v)，置4℃冰箱過夜后在4℃，10,000×g離心20min。用5ml SM Buffer重懸沉淀。等體積氯仿抽提一次。300μl處理后的污水與200μl過夜培養(yǎng)的宿主菌混合，37℃孵育20min，與3ml熔化頂層瓊脂在于50℃混勻，鋪平皿，冷卻后倒置于37℃過夜培養(yǎng)。用tip頭取下其中最大的空斑，溶于2mlLB培養(yǎng)液中，按1∶100的比例向該培養(yǎng)液中加入過夜培養(yǎng)的產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌φ9882，37℃，250轉振搖4.5～5小時。12000轉離心5分鐘，取80％上清4℃保存。取此上清再與產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌φ9882于固體培養(yǎng)基上共培養(yǎng)，用tip挑取較大噬斑。如此反復3次，即可得到大小均一的噬斑。取此噬斑按前述方法液體擴增，得到濃縮噬菌體液。
實施例2將過夜培養(yǎng)的宿主菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌φ9882按1∶100稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)至早期對數(shù)生長期。加入實施例1中的濃縮噬菌體10μl，繼續(xù)培養(yǎng)5h，加入1/10體積的氯仿，繼續(xù)振搖10分鐘后，分別加入DNase I及RNase A至終濃度均為1μg/ml，室溫放置30分鐘，離心除去細菌碎片。加1/6體積的PEG/NaCl，4℃過夜。次日，4℃，12,000×g離心20min。用1ml SM Buffer重懸沉淀。加入1/6體積PEG/NaCl再次沉淀，冰上孵育1h，4℃，12,000×g離心20min。用200μl SM Buffer重懸沉淀，即得到擴增的噬菌體，經(jīng)過反復擴增可以達到所需的滴度。
實施例3用30株稀釋的產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌在LB培養(yǎng)基上制成均勻的菌苔。在該培養(yǎng)基背面劃分16-20個方格并作標記，然后在相應的方格內(nèi)滴加噬菌體φ9882液，待液滴干燥后倒置于37℃孵育12-16h，觀察結果(圖4)?？梢姦?882在其中的11個菌株上形成噬斑，具體如下1、取100ul過夜生長的細菌培養(yǎng)物，接入10ml培養(yǎng)基的三角燒瓶中，
1、取100ul過夜生長的細菌培養(yǎng)物，接入10ml培養(yǎng)基的三角燒瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)2-2.5小時后，經(jīng)鏡檢計數(shù)，細胞可達到108/ml以上，用培養(yǎng)基稀釋，配制成5×107/ml。
2、實驗前一天測定噬菌體效價，按此稀釋配制成5×109PFU/ml。
3、將上述二者在37度水浴中平衡，按MOI＝10將1ml噬菌體液加入9ml3細菌懸液，混合均勻，放回水浴中保溫或振蕩保溫。
4、按一定時間間隔(1-5min)取樣，稀釋1000倍，放在冰中，終止吸附。
5、取稀釋樣品1ml，在Ep管中離心3min或4000rpm離心5min，沉降細菌和吸附噬菌體的細胞。
6、經(jīng)適當稀釋(10-100倍)后，按雙層瓊脂法測定上清液中的游離噬菌體，培養(yǎng)后記錄。
實施例41、稀釋噬菌體液至5×107PFU/ml。
2、將菌液稀釋成5×107CFU/ml。
3、取20支Ep管，每管加入900ulLB液。
4、取20支Ep管，每管加入200ul菌液。
5、取20支試管，每管加入3ml熔化的頂層膠，在50度水浴箱中保溫。
6、將上述噬菌體液，菌液置37度溫育。
7、取0.1ml噬菌體液加入0.9ml的細菌懸液中，吸附5分鐘。
8、取0.1ml混合液加至9.9ml冰TSBM液，混合均勻后各取1ml至9、取0.1ml重懸液加至9.9mlLB液，37℃振蕩培養(yǎng)，期間分別于第0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100分鐘取0.1ml共培養(yǎng)液與200ul菌液混合，5分鐘后鋪平皿，分別置于37℃培養(yǎng)。由上述各點的噬斑數(shù)-時間作曲線(圖3)，可得該噬菌體潛伏期為30-40min，裂解量為112。
實施例5建立全身感染模型培養(yǎng)過夜的產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌φ9853按1∶100的比例稀釋于100ml LB中，繼續(xù)培養(yǎng)至早期對數(shù)生長期(OD600值約為0.5)，4℃，8000g離心5分鐘，棄上清，將沉淀以等體積滅菌生理鹽水重懸，再次離心，沉淀溶解于5ml生理鹽水中。用生理鹽水系列稀釋的產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌φ9853菌液經(jīng)腹腔(intraperitoneal，i.p)注射于11組小鼠，導致一組(如無特殊說明，均為5只/組)小鼠全部死亡的最小劑量為最小致死量(minimal lethal dose，MLD)。系列稀釋的菌液注射于小鼠后，3×107-1×108CFU的菌液均可以導致全部小鼠死亡，而1×107-2×107CFU的菌液不會引起全部小鼠死亡(如圖5)。因此，3×107CFU為引起小鼠死亡的最小致死量。MLD的產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌φ9853菌液經(jīng)腹腔注射于10只小鼠，小鼠在8～14小時內(nèi)死亡(如圖6)。
實施例6不同噬菌體劑量對療效的影響取9組小鼠，用MLD劑量的菌液經(jīng)一側腹腔注射，立即經(jīng)另一側腹腔注射不同劑量的噬菌體φ9882制劑(LB稀釋)，其中一組i.p注射LB培養(yǎng)液作為對照。觀測小鼠的健康狀態(tài)20天以上。如圖7，噬菌體劑量在MOI≥0.0001的情況下全部小鼠均可存活并最終痊愈。MOI＝0和MOI≥0.0001情況下小鼠生存率存在顯著的統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。
實施例7延遲治療效果監(jiān)測取7組小鼠，均用MLD劑量的菌液感染，并分別于注射后第0，20，40，60，180，360分鐘以500μl較高滴度的噬菌體9882液(MOI＝200)i.p注射，觀測20天以上。每組小鼠均設置相應的對照組(即i.p注射等量的LB培養(yǎng)液)。如圖8，在延遲40分鐘內(nèi)的情況下，全部小鼠均可免于死亡。而在延遲治療1小時以上時，由于此時小鼠的狀態(tài)較差，已出現(xiàn)明顯的感染癥狀如卷毛、弓背、眼周滲出物聚集等，噬菌體的效果有所下降，但仍具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
權利要求
1.一種寬宿主譜產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882(CCTCC NOM205044)，其具有相對較寬宿主譜。
2.分離獲得到權利要求1所述的寬宿主譜產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882的方法。
3.根據(jù)權利要求2所述方法，寬宿主譜產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882的宿主細胞是產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌φ9882，它可作用一種治療性物質(zhì)用來制備有效的生物制劑。
4.一種寬宿主譜產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌噬菌體φ9882，其具有體內(nèi)抗感染效應。
全文摘要
一種寬宿主譜產(chǎn)超廣譜β－內(nèi)酰胺酶大腸桿菌噬菌體及其分離獲得方法，本發(fā)明涉及一種寬宿主譜產(chǎn)超廣譜β－內(nèi)酰胺酶(extended－spectrum beta－lactamases，ESBLs)大腸桿菌噬菌體及其分離獲得方法。噬菌體是一類特異的細菌病毒，裂解性噬菌體能使宿主菌裂解、死亡。噬菌體具有嚴格宿主特異性，宿主譜特異性發(fā)生突變的寬噬噬菌體能裂解其宿主菌和易感宿主菌，可以利用這一特性治療超廣譜β－內(nèi)酰胺酶大腸桿菌感染，將寬噬噬菌體制成臨床抗細菌感染的生物制劑。
文檔編號C12N7/01GK1699560SQ20051001892
公開日2005年11月23日 申請日期2005年6月16日 優(yōu)先權日2005年6月16日
發(fā)明者王晶, 胡俊波, 徐敏超, 胡北 申請人:華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院