專利名稱：生物芯片電穿孔儀及其在全方位單細(xì)胞電穿孔中應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在任何發(fā)展階段的粘附于基質(zhì)的任何細(xì)胞個體的電穿孔的方法和設(shè)備。
背景技術(shù)：
電穿孔是一個被廣泛使用的技術(shù)，其被用于將基因材料導(dǎo)入或者生物分子嵌入細(xì)胞。向細(xì)胞實(shí)施一個電信號使得細(xì)胞膜上的孔開啟，允許細(xì)胞外溶液中的分子進(jìn)入細(xì)胞。
一些電穿孔技術(shù)已被確立。他們被分為兩類(i)細(xì)胞群的電穿孔技術(shù)；(ii)單細(xì)胞的電穿孔技術(shù)。
細(xì)胞群的電穿孔懸濁液中細(xì)胞群的電穿孔(是最多使用的并且代表第一類)常規(guī)是在細(xì)胞從培養(yǎng)基中通過使用酶(例如胰島素)分離之后被執(zhí)行。然后細(xì)胞在電穿孔介質(zhì)中懸浮，在典型的間隔為2或4毫米的兩個大的金屬電極之間使用高電壓(高至1000伏或者更多)。細(xì)胞的懸濁液然后轉(zhuǎn)入一個合適的培養(yǎng)室，在這里細(xì)胞自由沉淀下來并且粘附在基質(zhì)底部，在那里他們被培養(yǎng)。
這一技術(shù)暗含著一些缺點(diǎn)-偶遇每一個細(xì)胞的實(shí)際電壓不能被控制，一些靠近電極細(xì)胞在高電壓應(yīng)用期間死亡，其它細(xì)胞由于他們在電極之間的電場中位置并且電場的局部變化的不均衡性，其被電穿孔成不同深度。
-這一方法僅僅能夠被應(yīng)用于大的細(xì)胞群。
-細(xì)胞必須從粘著的基質(zhì)脫離，這樣細(xì)胞被加壓且在這一階段被毀壞。
單細(xì)胞電穿孔單細(xì)胞電穿孔技術(shù)由羅賓斯基(Rubinsky et al.)等人開發(fā)并且被描述在6300108號美國專利中。
這個技術(shù)使用一個和一個硅微芯片一體的細(xì)胞大小的電穿孔室。細(xì)胞首先被引入室里并且被放置在硅基質(zhì)的開口上，然后它被電穿孔并使得基因結(jié)構(gòu)滲入。
以上技術(shù)有一些缺點(diǎn)-這一系統(tǒng)的建立比較復(fù)雜，此外，大批“單細(xì)胞電穿孔儀”集成進(jìn)入一個微芯片還沒有被實(shí)現(xiàn)并且根據(jù)現(xiàn)在技術(shù)發(fā)展水平將是昂貴的。
-細(xì)胞膜不能廣泛的粘著到基質(zhì)上，因此對于要求所有粘著的細(xì)胞生長和發(fā)展是不可能的(這是大部分類型細(xì)胞的情況)；-細(xì)胞不得不被放置進(jìn)入一個微室；這是一個困難的步驟并且遠(yuǎn)離用于細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)步驟。
從上文中清楚得知需求可以克服上述的那些缺點(diǎn)的電穿孔設(shè)備。

發(fā)明內(nèi)容
申請人現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)一個對于粘附到基質(zhì)任何種類的的細(xì)胞的個別的電穿孔的裝置，以解決所有以上提及的缺點(diǎn)。
因此本發(fā)明的一個目的是提供包括一個波發(fā)生器的、一個包括一列微電極的生物芯片和一個允許傳遞信號給生物芯片的預(yù)選單微電極的控制系統(tǒng)的電穿孔設(shè)備。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是生物芯片，其包括一列安置在在一個固體基質(zhì)上并包含在適合絕緣層的微電極；用以電連接該微電極到一個開關(guān)系統(tǒng)的裝置；一個細(xì)胞培養(yǎng)室，在這里細(xì)胞能夠成長并且通過所述的包裹位于所述固體基質(zhì)上的所述微電極列的所述絕緣層粘附到表面上的該列微電極。
本發(fā)明進(jìn)一步的目標(biāo)是用該設(shè)備進(jìn)行細(xì)胞電穿孔的方法，這個方法進(jìn)一步對至少一個粘附的單細(xì)胞執(zhí)行電穿孔并同時得到被電穿孔的細(xì)胞。
本發(fā)明的這些和其它目標(biāo)以及特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)在下面的詳細(xì)敘述中將被更好的理解。


圖1顯示裝置示意圖；圖2顯示基于發(fā)明的一個生物芯片；俯視圖(圖2b)和橫向剖視圖(圖2a)；
圖3顯示一個基于本發(fā)明的導(dǎo)體類微電極的橫向剖視圖；圖4顯示了基于本發(fā)明的一列金屬氧化物場控晶體管(MOSFET)導(dǎo)體類微電極的俯視圖和橫向剖視圖；圖5顯示了基于本發(fā)明的一列MOSFET導(dǎo)體類微電極的示意圖；圖6顯示基于本發(fā)明的電容類微電極的橫向剖視圖；圖7和圖8顯示了兩個特定電穿孔驅(qū)動信號的波形。參數(shù)值，例如時間和振幅在實(shí)驗(yàn)描述中被給出。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的特征在接下來的描述過程中將變得顯而易見并且從優(yōu)選實(shí)施例中這些將給出的圖示并沒有限制性的意圖。
本發(fā)明通過一種設(shè)備，其包括一個電波形發(fā)生器，一個包含一列微電極的生物芯片和可以將信號傳遞給生物芯片的一個預(yù)選單微電極的控制系統(tǒng)，來克服現(xiàn)存的技術(shù)問題。
優(yōu)選的控制系統(tǒng)包括一個個人電腦，其裝備有一個能夠在波發(fā)生器里設(shè)計(jì)不同波形信號并且通過一個開關(guān)系統(tǒng)使用選取微電極的軟件程序。
圖1給出基于本發(fā)明的設(shè)備的示意圖，其中顯示了一臺個人電腦10，一個開關(guān)系統(tǒng)11，一個信號發(fā)生器12和一個生物芯片13。
個人電腦10裝備有一個軟件程序允許操作者全面控制電穿孔過程，編制送給生物芯片的波形信號的形狀和定時。
用在基于本發(fā)明的設(shè)備中的電波形發(fā)生器12是一個常規(guī)裝置，在市場里可以容易得到；開關(guān)系統(tǒng)11能夠容易被本領(lǐng)域技術(shù)人員設(shè)計(jì)和實(shí)施。
下文將基于優(yōu)選實(shí)施例詳細(xì)描述生物芯片13，其包括一列微電極，一個合適的絕緣層，其中所述絕緣層位于一個固體基質(zhì)上，電連接所述微電極到一個開關(guān)系統(tǒng)的裝置，一個細(xì)胞培養(yǎng)室，在其中細(xì)胞能夠成長并與所述一列微電極連接并且粘附在一個表面上，所述表面通過包在所述固體基質(zhì)上的所述列微電極的所述絕緣層而形成。
基于本發(fā)明，生物芯片的布局作為一個優(yōu)選實(shí)施例在圖2a和2b顯示并且參照兩個圖來描述，在這里提及的標(biāo)號表明兩個視圖的同一或相應(yīng)部分。
在圖2a里，所述生物芯片被架在一個電介質(zhì)托架21上，依次，帶有開口26的細(xì)胞培養(yǎng)室24置于中間，其底表面由絕緣層形成，生物芯片包括尺寸可與被電穿孔的細(xì)胞相比的一列微電極，在固體基質(zhì)上27上。所述微電極列20整合固體基質(zhì)27上的絕緣層上，在固體基質(zhì)上置有帶開口26的細(xì)胞培養(yǎng)室24，所述開口26底部是生物芯片13的上表面，在這里細(xì)胞成長粘著并且與所述微電極列接觸。所述微電極列經(jīng)由導(dǎo)線28電連接到導(dǎo)電墊29，依次，該導(dǎo)電墊通過并被細(xì)胞培養(yǎng)室24外部覆蓋并環(huán)繞開口26的導(dǎo)線接頭23連接到一對外部平行連接頭22。
生物芯片13電連接到開關(guān)系統(tǒng)11(如圖1所示)，其是通過適當(dāng)?shù)姆绞竭B接，例如，一個電纜插接到插頭22接通電源。
在一個本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例里，電解質(zhì)托架21由萬綢乃特(VETRONITE，一種材料名稱)做成。象玻璃或者陶瓷那樣的其它相等材料也不被排除。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例里，生物芯片13的固體基質(zhì)由半導(dǎo)體基質(zhì)構(gòu)成，例如硅基質(zhì)，有合適形式，例如正方形，有合適的橫向尺寸(優(yōu)選為大約10毫米)，并且覆蓋一層絕緣層(優(yōu)選為SiO2)。硅不是這樣一個設(shè)備唯一可能的基質(zhì)，例如，玻璃和其它透明的基質(zhì)也能夠被使用。然而，硅有從微電子技術(shù)工業(yè)得到的很好的統(tǒng)一和可重復(fù)的生產(chǎn)技術(shù)優(yōu)勢，允許精確控制每個設(shè)備參數(shù)。
無論如何透明基質(zhì)是優(yōu)選的，允許為了細(xì)胞觀察使用倒置顯微鏡。
兩個大尺寸電極25(大約1平方毫米)，整合到被絕緣層27所覆蓋的固體基質(zhì)中，作為地線參考?？商鎿Q的，上述電極可作為電穿孔電流的冷端，由Ag/AgCl制成的電線，作為參考地電位。
尺寸與將被電穿孔的細(xì)胞相若的微電極列20包含在覆蓋固體基質(zhì)的絕緣層中，由于單獨(dú)連接到開關(guān)系統(tǒng)11，每一個微電極能被分成單獨(dú)的并彼此可分，因此允許非常精確和準(zhǔn)時地控制電穿孔過程。被使用的微電極可為導(dǎo)體和電容類。
圖2b顯示(不按比例)二十個微電極的布局，每一個帶有一個20μm長、20μm寬的活性區(qū)域(在這個區(qū)域把信號傳遞給細(xì)胞)。這個布局在多個激勵點(diǎn)、微電極、以及在被要求用于微電極的外部供給的生物芯片的微電極之間的相互連接之間提供一個相對好的平衡。更高的數(shù)目和密度的微電極也能夠?qū)崿F(xiàn)，這取決于將被電穿孔的細(xì)胞類型。
為了生物芯片上利于細(xì)胞粘著，在細(xì)胞開始培養(yǎng)之前生物芯片細(xì)胞培養(yǎng)室24的上述的開口26的表面被粘性分子覆蓋(例如，多聚賴氨酸)。一些不同的粘著分子能夠被用做覆蓋基質(zhì)允許合適的細(xì)胞粘著以幾十納米的距離在細(xì)胞膜和半導(dǎo)體基質(zhì)之間，這一基質(zhì)被一個包括在培養(yǎng)室開口26中的絕緣層27覆蓋。
微電極具有不同的形狀與尺寸只要它們的尺寸與細(xì)胞尺寸相當(dāng)，通常它們是平的，一般的，被設(shè)計(jì)成使得細(xì)胞膜很好粘著在其表面上(通常，至少10％的細(xì)胞膜必定是與電極接觸)，它們的尺寸范圍從1μm到50μm。該微電極由生物相容導(dǎo)電材料制成能夠傳送必要的電流/電壓、交流/直流電信號給細(xì)胞。
導(dǎo)電微電極由一些材料制成，這些材料在一些生物相容金屬和合金之中選擇并且能是單層或多層。
使用在根據(jù)此發(fā)明的設(shè)備中的生物芯片中的導(dǎo)電微電極的優(yōu)選實(shí)施例被描述在圖3。該微電極為被SiO2絕緣層32覆蓋的硅基質(zhì)31。微電極和它們的連接線38被做成“三明治”，其中包括兩個氮化鈦(TiN)層33和一個鋁層34，并被一個金層37覆蓋。這個方案有一些優(yōu)點(diǎn)，把高熱效應(yīng)預(yù)算和生物相容性的氮化鈦同低電阻的Al結(jié)合在一起。微電極被SiO2絕緣層35分割。沒有被直接暴露于細(xì)胞的芯片部分(包括連接微電極的導(dǎo)線38)被一個氮硅化物(Si3N4)層36覆蓋，它使得僅僅暴露微電極的活性部分。不同的材料(例如，SiO2或者有機(jī)聚合物)也可用于此目的。
在本發(fā)明的其它實(shí)施例中，電容類微電極是通過引入一個薄的絕緣材料來覆蓋微電極本身的活性部分。參見圖6，微電極通過使用一個導(dǎo)電層61(可由金屬和半導(dǎo)體或者以上提到的“三明治”-TiN/Al/TiN，或者其它等同材料或其結(jié)合制成)和一個通過一個電容耦合來管理電穿孔細(xì)胞的薄絕緣層64(典型的薄于25nm)被置在絕緣基質(zhì)60上。微電極被絕緣材料62分離并且通過一個惰性層63覆蓋在不暴露的區(qū)域里。
基于本發(fā)明的進(jìn)一步的生物芯片的微電極的實(shí)施例，該微電極能被使用金屬氧化物半導(dǎo)體(MOS)技術(shù)以便實(shí)現(xiàn)一個較高的電極密度，并且他們的每一個以類似于半導(dǎo)體儲存細(xì)胞的方式定址。
參見圖4，一列MOSFET(金屬氧化物場控晶體管)通過常用的微電子技術(shù)定位于硅基質(zhì)40上，也就是通過植入在一個p-型基質(zhì)40，兩個n-型摻雜的區(qū)域里，41和42，這些分別構(gòu)成了晶體管的漏極和源極。這些MOSFET的門電路43是n+摻雜多硅并且通常所有設(shè)備成一排(字線)。所有的設(shè)備的漏極通過使用一個金屬連接插頭(通常是鎢)和一個金屬線44(位線)連接成一列。所述金屬被絕緣氧化物45包圍。晶體管的源極42通過一個金屬(通常是鎢)連接接頭46連接到一個薄的金層47(其作為一個活性微電極)。沒有暴露的芯片部分被一個惰性層所覆蓋。
由n-類區(qū)域轉(zhuǎn)化p-類區(qū)域，由p摻雜轉(zhuǎn)化n摻雜，它可能使得pMOSFET代替上述的nMOSFET，并有類似的整合效果。
由于這項(xiàng)技術(shù)，在兩個微電極之間的最小距離能達(dá)到1微米，以此方式得到高空間分辯率電穿孔單細(xì)胞。
參見圖5，一列微電極的示意圖如其所示。微電極50被連接到MOSFET源極51，其漏極52連接到字線53，門電路54連接到位線55。如果一個MOSFET的門電路保持在一個高于閥值電壓VTH的電壓VG，漏極保持在VD，并且源極保持開啟，后者終端的電壓是VD-VTH。這個機(jī)理可被用作通過控制字線電壓53和位線電壓55(其限定了在列中位置)來控制連接到一個選定的MOSFET的源極51的微電極50的電壓。
基于本發(fā)明的電穿孔設(shè)備不要求特定的粘著分子，并且從細(xì)胞涂層(plated)、定位和培養(yǎng)這些過程中獨(dú)立出來。
根據(jù)此發(fā)明的設(shè)備使得實(shí)施電穿孔技術(shù)有以下的優(yōu)點(diǎn)-在粘著細(xì)胞上電穿孔；-在的同一培養(yǎng)環(huán)境內(nèi)的不同單細(xì)胞上電穿孔；-為每個標(biāo)靶細(xì)胞任意選擇電穿孔時間；-每個標(biāo)靶細(xì)胞的電穿孔程度(即，孔的數(shù)量、尺寸和持續(xù)時間)通過經(jīng)由個體細(xì)胞/微電極的電耦合控制穿膜電壓來控制；，-如果細(xì)胞足夠大以覆蓋不同的微電極，在同一細(xì)胞的不同部位使用不同的微電極進(jìn)行電穿孔。
由于它的特征，根據(jù)此發(fā)明的方法對于高處理量的不能透細(xì)胞膜的分子篩選格外有用。藥物、基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)能被在相同晶片的一些單細(xì)胞單獨(dú)測試。不同分子定時傳遞和結(jié)合可被設(shè)置給每一個標(biāo)靶細(xì)胞。
根據(jù)此發(fā)明，這一方法能被用在一個基礎(chǔ)研究里(例如，基因功能的篩選)和在新藥的“發(fā)現(xiàn)”的階段中。試驗(yàn)產(chǎn)量的大規(guī)模增加和試驗(yàn)費(fèi)用的減少被期待。由于高效和控制細(xì)胞電穿孔，它不被排除這一技術(shù)甚在從來自轉(zhuǎn)移的細(xì)胞的藥物的“生產(chǎn)”過程和基因治療中將變得有用。
使用前述設(shè)備進(jìn)行電穿孔的方法包括以下步驟-當(dāng)?shù)竭_(dá)粘著階段時培養(yǎng)細(xì)胞-在培養(yǎng)基中添加至少一個將被電穿孔到所述細(xì)胞里的至少一個單細(xì)胞中的化合物-選定至少一個單細(xì)胞和至少一個選定的單細(xì)胞粘著其上的微電極-產(chǎn)生至少一個適合將至少一個所述的化合物的電穿孔到所述至少一個單細(xì)胞的電信號，將所述電信號傳到被選定單細(xì)胞粘著的所述微電極上。
在下文中，四個試驗(yàn)使用基于本發(fā)明的設(shè)備來實(shí)現(xiàn)這一方法被描述在如下的例子中。
例1由寡核苷酸轉(zhuǎn)染Cos-7細(xì)胞本實(shí)驗(yàn)的目的是用雙鏈DNA寡核甘酸轉(zhuǎn)染標(biāo)靶細(xì)胞。
標(biāo)有熒光標(biāo)簽的寡核苷酸被使用并且在電穿孔后滲透進(jìn)入標(biāo)靶細(xì)胞之后由于細(xì)胞內(nèi)熒光的存在而被檢測到。
Cos-7細(xì)胞通過使用一個常規(guī)的培養(yǎng)基保持培養(yǎng)。保持培養(yǎng)兩天之后，其被胰蛋白酶化，懸浮在培養(yǎng)基里，并且以芯片表面密度大約35,000細(xì)胞/cm2涂層在基于本發(fā)明的生物芯片細(xì)胞培養(yǎng)室。
在涂層之前，芯片表面被仔細(xì)清洗，漂洗，干燥并且用紫外線消毒。生物芯片隨后通過在20μg/ml的水℃攝氏度，5％CO2的環(huán)境下培養(yǎng)。
87-113堿基對的雙鏈DNA寡核苷酸和包含標(biāo)有一個熒光染料(不是NED就是FAM)的殘基隨后被合成。寡核苷酸在合成期間被溶解在水里最后濃縮到大約40ng/μl。在電穿孔之前寡核苷酸溶液以1∶1被稀釋在HBS 2X中。在移除培養(yǎng)基后，在電穿孔之前培養(yǎng)室有大約60μl的寡核苷酸溶液。
與一個單微電極接觸的個體細(xì)胞的成長通過顯微鏡觀察被確認(rèn)。在用控制系統(tǒng)選擇與一個單細(xì)胞接觸的微電極之后，一個適當(dāng)?shù)碾姶┛仔盘柋粋魉筒⑶彝瑯拥牟僮髟诿恳粋€標(biāo)靶細(xì)胞中被重復(fù)。
被一臺個人電腦驅(qū)動的波形發(fā)生器產(chǎn)生傳遞給基于本發(fā)明的生物芯片的電信號。該信號通過一個50Ω的同軸電纜傳到一個開關(guān)系統(tǒng)，其使得傳遞信號給一個基于本發(fā)明的生物芯片的預(yù)選單電極。外部平行的接頭通過一個印刷電路與生物芯片連接。參考地電壓通過連接前述的開關(guān)接地到一個Ag/AgCl電極(浸在電解液中且培養(yǎng)的細(xì)胞位于該處)來實(shí)現(xiàn)。
電穿孔信號的波形在圖7被顯示。5列(train)25正方形脈沖(1ms持續(xù)時間，10μs升/落時間)在500ms的時間間隔重復(fù)，這是被發(fā)現(xiàn)適合于成功的Cos-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
在電穿孔后，細(xì)胞用標(biāo)準(zhǔn)生理鹽水清洗并由熒光顯微鏡觀察。成功轉(zhuǎn)染的標(biāo)靶細(xì)胞通過細(xì)胞熒光性的存在被探測到。在轉(zhuǎn)染之后通過細(xì)胞形的觀測監(jiān)測細(xì)胞存活24小時。
大約80％的標(biāo)靶細(xì)胞被成功轉(zhuǎn)染并且在6-10v振幅脈沖和1-10μs的升/落時間條件下有很好的細(xì)胞存活比例(50-80％)。
從細(xì)胞內(nèi)熒光的強(qiáng)度判定的轉(zhuǎn)染程度，與振幅成正比并與上升時間成反比。相反的，細(xì)胞存活隨著電壓幅度而減少，隨著上升時間而增加。在列之間的時間間隔是至關(guān)重要的大于500ms的時間間隔，轉(zhuǎn)染不會發(fā)生。時間間隔小于500ms細(xì)胞存活大大的減少。以此做為最好的方案以便得到最高百分比的轉(zhuǎn)染和細(xì)胞存活，我們常規(guī)使用9v的振幅和10μs的上升時間。
例2由DNA質(zhì)體媒介轉(zhuǎn)染Cos-7細(xì)胞基于本發(fā)明的方法的另一個實(shí)施實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)是由DNA質(zhì)體媒介轉(zhuǎn)染單個標(biāo)靶細(xì)胞。
使用基于本發(fā)明的設(shè)備，單個Cos-7標(biāo)靶細(xì)胞由質(zhì)體媒介轉(zhuǎn)染編碼得到GFP(綠色熒光蛋白)。GFP在細(xì)胞質(zhì)里的合成被一個熒光顯微鏡觀測并且將能顯示出成功的轉(zhuǎn)染。
在研究基因功能的一些實(shí)驗(yàn)室里質(zhì)體媒介的轉(zhuǎn)染是一個常規(guī)技術(shù)。
Cos-7標(biāo)靶細(xì)胞和與前述實(shí)驗(yàn)中完全相同。
包含5kB GFP編碼基因的DNA質(zhì)體媒介被使用。在擴(kuò)增和提純后這一DNA被溶解為50μg/ml水溶液。電穿孔前DNA溶液1∶1被稀釋在HBS 2x中。在移除培養(yǎng)基后，在電穿孔之前培養(yǎng)室有大約60μl的DNA溶液(25μg/ml)。
標(biāo)靶細(xì)胞如同前述實(shí)驗(yàn)一樣被選擇。電穿孔信號的波形的使用與前述的實(shí)驗(yàn)相同除了每列脈沖的量被提高到50。在48小時后被轉(zhuǎn)染的標(biāo)靶細(xì)胞在進(jìn)行復(fù)制周期分裂成兩個細(xì)胞表達(dá)GFP。
典型的胞質(zhì)型GPF表達(dá)在兩個細(xì)胞里可見。這兩個細(xì)胞，由于復(fù)制和固有的細(xì)胞自動性，已經(jīng)從被原母細(xì)胞單獨(dú)覆蓋的微電極中稍微移出。
例3用熒光素電穿孔大鼠海馬神經(jīng)元第三個實(shí)驗(yàn)使用基于本發(fā)明的設(shè)備用熒光素電穿孔大鼠海馬神經(jīng)元。
神經(jīng)元是從18天孕期的Wistar大鼠的海馬中分離的(Banker andCowan，1977)。他們被預(yù)先涂層兩次以去掉神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞并且懸浮在帶有g(shù)lutamax I的DMEM里(no.61965026，Gibco，Eggenstein，德國)補(bǔ)充以10％(vol)胎牛血清(10106078，Gibco)和1％(vol)青霉素(15140114，Gibco)(Brewer etal.，1993；Vassanelli and Fromherz，1998)。最終濃縮為350000細(xì)胞/ml。
芯片表面仔細(xì)涂上一層1％的液體盤子清潔劑溶液，用超純水沖洗(Millipore，Bedford，MA)，干燥，并且用紫外線消毒。通過吸附作用浸在20ug/ml水溶液達(dá)1小時后芯片涂上一層多聚賴氨酸(分子重量＞300,000；Sigma，Heidelberg，Germany)，烘干。我們在培養(yǎng)室中施加350μl的細(xì)胞懸濁液。在含有g(shù)lutamax I的Leibovitz-15的培養(yǎng)基(100μl)(31415029，Gibco)補(bǔ)充加入5％胎牛血清。細(xì)胞密度是100,000cm2。芯片保持在37℃和10％CO2下2小時。然后移除培養(yǎng)基，隨之細(xì)胞被培養(yǎng)在無血清介質(zhì)里(Brewer etal.，1993；Evans etal.，1998；Vassanelli andFromherz，1998)使用450μl的neurobasal介質(zhì)(Gibco，21103049其補(bǔ)充有2％(vol)B27介質(zhì)(17504036，Gibco)和1％(vol)glutamax I(35050038，Gibco)達(dá)4-7天。
對保持培養(yǎng)最少6天-最多12天的神經(jīng)元實(shí)施電穿孔。
熒光素在標(biāo)準(zhǔn)生理鹽水(10μM)里溶解并在電穿孔前且應(yīng)用在培養(yǎng)室。在用生理鹽水清洗兩次之后細(xì)胞在熒光顯微鏡下被觀測到。
單鼠海馬神經(jīng)元的電穿孔通過應(yīng)用三角電壓列的微電極被獲得，每個三角波振幅為4v的并且單個三角持續(xù)時間相當(dāng)于1ms且上升時間等同于下降時間(圖8)。
還要注意，相對于Cos-7細(xì)胞和許多其它細(xì)胞列，神經(jīng)元是可興奮細(xì)胞在電穿孔期間它們的不需要的電活動刺激將被限制。我們減少不需要的刺激(i)通過減少每列脈沖的量(相對于Cos-7細(xì)胞使用的25或50脈沖，采用10脈沖)，(ii)通過增加列與列之間的間隔(5s代替500ms)和(iii)通過使用三角電壓。
例4電穿孔期間細(xì)胞電生理活性(Cos-7和鼠海馬神經(jīng)元)。
一個標(biāo)靶細(xì)胞與一個夾片電極連接。在確定整個細(xì)胞構(gòu)造之后，細(xì)胞的內(nèi)電位被監(jiān)控。施加適當(dāng)?shù)碾姶┛仔盘柦o相應(yīng)的微電極導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)電壓瞬變升至0mV(細(xì)胞電位是負(fù)的，在-70mV左右)。由于電穿孔的形狀和隨之而來的與接地的外部電解質(zhì)的電聯(lián)系，這一瞬變逐漸緩慢減少，細(xì)胞在1-2分鐘完全恢復(fù)了靜止電位。這是可能的所需重新封孔時間?？椎慕Y(jié)構(gòu)也通過熒光素(少量熒光素染色)從外部電解液進(jìn)入細(xì)胞的滲透作用被顯示。
根據(jù)此發(fā)明被設(shè)備實(shí)施的電穿孔，和適當(dāng)?shù)碾姶┛仔盘?，能夠在整個夾片記錄期(典型地20-30min)被重復(fù)而沒有任何細(xì)胞何電生理信號被破壞。
像期待的那樣，細(xì)胞內(nèi)的電壓振幅瞬時通過電穿孔被引起并且根據(jù)所用的電穿孔信號恢復(fù)靜止電位的時間是多變的。
根據(jù)此發(fā)明在此描述的結(jié)果證明設(shè)備和方法科研使得用各種化合物單獨(dú)電穿孔各種細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。對于實(shí)施例的進(jìn)一步修改和補(bǔ)充對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是可見的，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.用于電穿孔的設(shè)備，包括一個波發(fā)生器，一個包括一列微電極的生物芯片和一個允許將信號傳遞給生物芯片預(yù)選的單微電極的控制系統(tǒng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于所述控制系統(tǒng)裝備包括裝配可編程設(shè)計(jì)不同波形信號的軟件程序的個人電腦和控制波發(fā)生器輸出的開關(guān)系統(tǒng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的裝置，其特征在于所述生物芯片包括尺寸與被電穿孔的細(xì)胞相當(dāng)?shù)奈㈦姌O列并且每一個所述微電極被彼此分開使得極其精確和準(zhǔn)時控制電穿孔過程。
4.生物芯片，包括一列微電極，其包含在位于固體基質(zhì)上的適當(dāng)絕緣層上，電連接所述微電極到開關(guān)系統(tǒng)的裝置；細(xì)胞培養(yǎng)室，在其中細(xì)胞能夠生長并在所述固體基質(zhì)上的包含所述微電極列的所述絕緣層所形成表面上的粘著接觸所述微電極。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物芯片，包含做為固體基質(zhì)的半導(dǎo)體基質(zhì)，其覆蓋有絕緣層(27)，所述絕緣層包含一列尺寸與被電穿孔的細(xì)胞相當(dāng)?shù)膯为?dú)驅(qū)動的微電極(20)，依次安裝有開口(26)的細(xì)胞培養(yǎng)室(24)在一電介質(zhì)材料制成的托架(21)上，所述微電極(20)經(jīng)由導(dǎo)線(28)被電連接到導(dǎo)電墊(29)上，所述導(dǎo)電墊經(jīng)由被細(xì)胞培養(yǎng)室(24)的外部覆蓋并環(huán)繞開口(26)的導(dǎo)線接頭(23)電連接到兩個外部平行接頭(22)，所述有開口(26)的細(xì)胞培養(yǎng)室(24)被安裝在覆蓋有絕緣層(27)的所述半導(dǎo)體基質(zhì)的頂部，這些都附著在電介質(zhì)托架(21)上。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生物芯片，進(jìn)一步包括兩個電極(25)，其整合在覆蓋有絕緣層(27)的半導(dǎo)體基質(zhì)上，并且做為參考地電位。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述生物芯片，其中覆蓋有絕緣層(27)的半導(dǎo)體基質(zhì)是優(yōu)選覆蓋有SiO2絕緣層的硅基質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求4和5所述的生物芯片，其中這些固體基質(zhì)是透明的。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生物芯片，其中電介質(zhì)托架是萬綢乃特材料，玻璃或者陶瓷的。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生物芯，其中微電極列(20)有至少細(xì)胞膜10％大的一個表面，優(yōu)選直徑范圍為1μm-50μm。
11.根據(jù)權(quán)利要求4-10所述的生物芯片，其中微電極為導(dǎo)體類或電容類。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的微電極，由在覆蓋有優(yōu)選為SiO2的絕緣層(32)的硅基底(31)上的導(dǎo)體微電極構(gòu)成，所述微電極及其連接導(dǎo)線(38)由雙氮化鈦層(33)和一個鋁層層疊制得，并有金層覆蓋在其活性表面。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的微電極，其中微電極通過使用金屬氧化物半導(dǎo)體技術(shù)被實(shí)現(xiàn)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的微電極，包括硅p-型基質(zhì)(40)，在其中兩個n-摻雜的區(qū)域里，漏極(41)和源極(42)由常規(guī)微電極工藝植入，這些電極的門電路(43)實(shí)現(xiàn)在n+摻雜多硅并且通常所有設(shè)備成一排，即字線，和成一列的所有設(shè)備的漏極(41)經(jīng)由金屬連接插頭連接在一起，一個金屬線44和晶體管的源極(42)經(jīng)由通常是鎢的金屬連接接頭(46)連接到作為一個活性電極的金層47。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的微電極，由一個絕緣基底(60)、金屬(61)和薄絕緣層(64)組成的電容性微電極構(gòu)成，所述微電極將被絕緣材料(62)分隔并有惰性層(63)覆蓋非暴露區(qū)域。
16.電穿孔方法，其特征在于使用根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的設(shè)備。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于對至少一個單粘著細(xì)胞進(jìn)行電穿孔。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于所述設(shè)備包括根據(jù)權(quán)利要求4-10所述的生物芯片。
19.根據(jù)權(quán)利要求16-18所述的方法，其特征在于所述生物芯片包括根據(jù)權(quán)利要求11-15所述的微電極。
20.根據(jù)權(quán)利要求16-19所述的方法，其特征在于所述波發(fā)生器向電極發(fā)送不同振幅和持續(xù)時間的脈沖列。
21.根據(jù)權(quán)利要求16-20所述的方法，其特征在于所述波發(fā)生器送5列25個脈沖至微電極，所述脈沖為1ms持續(xù)期，在500ms時間間隔重復(fù)。
22.根據(jù)權(quán)利要求16-20所述的方法，其特征在于多列包括10脈沖的三角電壓被應(yīng)用在電極上，列之間時間間隔為5s。
23.根據(jù)前述任何一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于包括如下步驟-當(dāng)?shù)竭_(dá)粘著階段時培養(yǎng)細(xì)胞-在培養(yǎng)基中添加至少一個將被電穿孔到所述細(xì)胞里的至少一個單細(xì)胞中的化合物-選定至少一個單細(xì)胞和至少一個選定的單細(xì)胞粘著其上的微電極-產(chǎn)生至少一個適合將至少一個所述的化合物的電穿孔到所述至少一個單細(xì)胞的電信號，將所述電信號傳到被選定單細(xì)胞粘著的所述微電極上。
24.被電穿孔細(xì)胞，其特征在于其由根據(jù)權(quán)利要求16-23所述方法獲得。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的被電穿孔細(xì)胞，其中電穿孔介質(zhì)是藥物、基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)。
全文摘要
將基因材料導(dǎo)入或者生物分子嵌入細(xì)胞在為了實(shí)驗(yàn)和應(yīng)用目都增加吸引力的程序，因此電穿孔是一個被廣泛使用的技術(shù)，但是單粘附細(xì)胞的電穿孔仍然很弱，本申請描述為一個用于處于任何發(fā)展階段的粘附于基質(zhì)的任何細(xì)胞的電穿孔設(shè)備，其中電信號被驅(qū)動并應(yīng)用在一個在培養(yǎng)中的單粘附的細(xì)胞以便獲得其電擊穿。用發(fā)明的設(shè)備來電擊一個單粘附細(xì)胞的方法也被描述。
文檔編號C12N15/87GK1906305SQ200480041083
公開日2007年1月31日 申請日期2004年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月29日
發(fā)明者斯泰方諾·瓦薩納利, 喬治·塞勒瑞, 莫羅·博格, 萊昂納多·班迪拉 申請人:拜歐斯拉伯(股份)責(zé)任有限公司