專利名稱：皮膚瘢痕形成的減少的制作方法
相關(guān)專利申請(qǐng)的交叉參考本發(fā)明要求2003年11月24日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第60/524,993號(hào)的優(yōu)先權(quán)，對(duì)于所有目的該臨時(shí)申請(qǐng)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
背景技術(shù)：
過(guò)度皮膚瘢痕形成是醫(yī)療需求未能滿足的領(lǐng)域，產(chǎn)生功能、容貌和心理病態(tài)。參見(jiàn)例如Hunt，T.K.，World J Surg 4(3)271-7(1980)；Nicolai，J.P.等，11(1)29-32(1987)。臨床瘢痕管理包括對(duì)瘢痕的持續(xù)身體評(píng)估(包括身體部位)和患者先前瘢痕史二者的考量，所以治療過(guò)程中經(jīng)常調(diào)整臨床方案。增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的公認(rèn)保守治療限于手術(shù)、注射皮質(zhì)類固醇、放療、硅膠薄膜敷貼和壓力療法。參見(jiàn)例如Mustoe，T.A.等，Plast Reconstr Surg，110(2)560-71(2002)。盡管近來(lái)瘢痕管理已試驗(yàn)了供醫(yī)生使用的新療法，但瘢痕治療結(jié)果在很大程度上仍不可預(yù)期。明確地以負(fù)責(zé)增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的生物機(jī)制為目標(biāo)的治療應(yīng)能補(bǔ)充現(xiàn)有療法，并可改善當(dāng)前的瘢痕治療結(jié)果。
皮膚瘢痕形成被說(shuō)成是正常皮膚構(gòu)造和功能的大范圍破壞，其由于傷口修復(fù)而發(fā)生，并由于纖維增生反應(yīng)而演進(jìn)。參見(jiàn)例如Clark，R.A.F.，Wound RepairOverview and General Considerations，載于THEMOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY OF WOUND REPAIR，(R.A.F.Clark編輯)，1988，3-35頁(yè)。瘢痕疙瘩和增生性瘢痕的發(fā)病機(jī)制和生物學(xué)模式尚未完全知曉。瘢痕疙瘩的特征在于生長(zhǎng)超出了原始外傷部位周邊，與家族因素有關(guān)，并很少退化。參見(jiàn)例如Tredget，E.E.，Ann N Y Acad Sci，888165-82(1999)。增生性瘢痕是增生性紅斑狀纖維病變，經(jīng)常隨時(shí)間而經(jīng)歷分解，與組織攣縮相關(guān)。參見(jiàn)例如Tredget，E.E.，Ann N Y Acad Sci，888165-82(1999)。盡管瘢痕疙瘩和增生性瘢痕在遺傳連鎖和免疫學(xué)參數(shù)方面不同，但二者均與成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖和過(guò)量胞外基質(zhì)(ECM)沉積相關(guān)。參見(jiàn)例如Rockwell，W.B.等，Plast Reconstr Surg，84(5)827-37；Tsao，S.S.等，Semin Cutan Med Surg，21(1)46-75(2002)；Nemeth，A.J.，J Dermatol Surg Oncol 19(8)738-46(1993)。
顯然，瘢痕形成仍是在很多情況下難以避免的問(wèn)題。本發(fā)明解決了此問(wèn)題和其它問(wèn)題。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供減少瘢痕形成的方法。在某些實(shí)施方案中，該方法包括給予皮膚含表達(dá)盒的多核苷酸，其中所述表達(dá)盒含有效連接至p21WAF1/Cip1編碼多核苷酸的啟動(dòng)子。在某些實(shí)施方案中，將多核苷酸(任選在載體中)給予對(duì)象皮膚上的傷口。
在某些實(shí)施方案中，DNA作為載體的一部分給予。在某些實(shí)施方案中，載體為病毒載體。在某些實(shí)施方案中，病毒載體為腺病毒載體。在某些實(shí)施方案中，腺病毒載體為復(fù)制缺陷型腺病毒載體。
在某些實(shí)施方案中，和未處理傷口上瘢痕形成相比，給予步驟使傷口處的瘢痕疙瘩或增生性瘢痕形成減少。在某些實(shí)施方案中，腺病毒載體以105-107顆粒數(shù)(PN)/cm2傷口的劑量給予。
在某些實(shí)施方案中，載體在生物相容性的基質(zhì)中給予。在某些實(shí)施方案中，基質(zhì)含膠原、金屬、羥基磷灰石、生物玻璃、鋁酸鹽、生物陶瓷材料、純化的蛋白或胞外基質(zhì)組合物。在某些實(shí)施方案中，基質(zhì)為膠原基質(zhì)。
在某些實(shí)施方案中，皮膚被灼傷。
本發(fā)明還提供含表達(dá)盒和藥物可接受賦形劑的藥物組合物，其中所述組合物適于局部給予，所述表達(dá)盒包含有效連接至p21WAF1/Cip1編碼多核苷酸的啟動(dòng)子。在某些實(shí)施方案中，表達(dá)盒(任選為載體的一部分)在生物相容性基質(zhì)中。
在某些實(shí)施方案中，基質(zhì)包含含表達(dá)盒的病毒載體。在某些實(shí)施方案中，病毒載體為腺病毒載體。在某些實(shí)施方案中，腺病毒載體為復(fù)制缺陷型腺病毒載體。
在某些實(shí)施方案中，基質(zhì)含膠原、金屬、羥基磷灰石、生物玻璃、鋁酸鹽、生物陶瓷材料、純化的蛋白或胞外基質(zhì)組合物。在某些實(shí)施方案中，基質(zhì)為膠原基質(zhì)。
定義本文使用的“p21WAF1/Cip1”指野生型全長(zhǎng)p21WAF1/Cip1蛋白、其活性片段、其活性變體，以及含全長(zhǎng)p21WAF1/Cip1蛋白或其活性片段或其活性變體的融合蛋白，其中融合蛋白保持p21WAF1/Cip1活性。野生型p21WAF1/Cip1蛋白是具有細(xì)胞調(diào)節(jié)功能的164個(gè)氨基酸的蛋白。參見(jiàn)例如美國(guó)專利第5,302,706號(hào)。在科學(xué)文獻(xiàn)中p21WAF1/Cip1還被稱為p21、p21sdi、p21waf1、p21cip1和p21pic1。術(shù)語(yǔ)“p21WAF1/Cip1多核苷酸”指編碼p21WAF1/Cip1的多核苷酸序列，其中所述p21WAF1/Cip1包括例如人野生型蛋白和其它生物的同源序列，以及其任何突變體或截短物，或大致表現(xiàn)出和野生型p21WAF1/Cip1蛋白相同的功能的融合蛋白。
“p21WAF1/Cip1”活性指補(bǔ)充p21WAF1/Cip1突變的能力和用作細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶活性抑制劑(Harper，J.W.等，Cell 75805-816(1993))和/或抑制細(xì)胞周期進(jìn)展的能力。參見(jiàn)例如Harper，J.W.等，出處同上；Xiong，Y.等，Cell 71505-514(1992)。
術(shù)語(yǔ)“基因”指參與產(chǎn)生多肽鏈的DNA節(jié)段；其包括編碼區(qū)前后的區(qū)域(前導(dǎo)序列和尾隨序列)以及各個(gè)編碼節(jié)段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。
術(shù)語(yǔ)“核酸”指或單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。除非有明確限制，否則該術(shù)語(yǔ)包括含天然核苷酸已知類似物的核酸，該類似物具有與參比核酸相似的結(jié)合特性，并以類似于天然核苷酸的方式代謝。除非另有說(shuō)明，否則特定的核酸序列還默認(rèn)包括其保守修飾的變體(例如簡(jiǎn)并密碼子置換)和互補(bǔ)序列以及明確指出的序列。具體地講，可通過(guò)產(chǎn)生其中一個(gè)或多個(gè)選定(或者全部)密碼子的第三個(gè)位置被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基置換的序列，實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)并密碼子置換(Batzer等，Nucleic Acid Res.195081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.2602605-2608(1985)；和Cassol等(1992)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes 891-98(1994))。
在本文可交互使用的術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白”指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語(yǔ)適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基為對(duì)應(yīng)天然氨基酸的人工化學(xué)模擬物的氨基酸聚合物，以及適用于天然氨基酸聚合物和非天然氨基酸聚合物。本文使用的該術(shù)語(yǔ)包括任何長(zhǎng)度的氨基酸鏈，包括全長(zhǎng)蛋白(即抗原)，其中氨基酸殘基通過(guò)共價(jià)肽鍵相連接。
術(shù)語(yǔ)“氨基酸”指天然和合成氨基酸，以及以類似于天然氨基酸的方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然氨基酸是遺傳密碼編碼的氨基酸，以及之后修飾的氨基酸，例如羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物指具有與天然氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)(即結(jié)合H、羧基、氨基和R基團(tuán)的α碳)的化合物，例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。這種類似物具有修飾的R基團(tuán)(例如正亮氨酸)或修飾的肽骨架，但仍保留和天然氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)?！鞍被崮M物”指所具有結(jié)構(gòu)與氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的化學(xué)化合物，但其以和天然氨基酸類似的方式起作用。
本文以IUPAC-IUB生化命名委員會(huì)推薦的、通常已知的3字母符號(hào)或單字母符號(hào)表示氨基酸。同樣，核苷酸可由其一般公認(rèn)的單字母代碼表示。
“表達(dá)盒”指重組或合成產(chǎn)生的核酸，其具有一系列允許特定核酸在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的特定核酸元件。表達(dá)盒可為質(zhì)粒、病毒或其它核酸的一部分。通常，表達(dá)盒包含有效連接至待轉(zhuǎn)錄核酸的啟動(dòng)子。
“生物相容性基質(zhì)”指在要給予基質(zhì)的宿主對(duì)象中不產(chǎn)生顯著的變態(tài)反應(yīng)或其它副反應(yīng)的基質(zhì)。
術(shù)語(yǔ)“有效連接”指核酸表達(dá)控制序列(例如啟動(dòng)子或一系列轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn))和第二個(gè)核酸序列之間的功能連接，其中表達(dá)控制序列引導(dǎo)對(duì)應(yīng)于第二個(gè)序列的核酸的轉(zhuǎn)錄。
術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”或“調(diào)節(jié)元件”指位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游或下游的區(qū)域或序列決定蔟，其涉及識(shí)別和結(jié)合RNA聚合酶和其它蛋白，以啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄?！敖M成型”啟動(dòng)子是在大部分環(huán)境和發(fā)育條件下有活性的啟動(dòng)子?！罢T導(dǎo)型”啟動(dòng)子是在環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)下有活性的啟動(dòng)子。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A圖示了在rAd-p21WAF1/Cip1處理后初級(jí)人皮膚成纖維細(xì)胞中的增殖作用和I型前膠原蛋白檢測(cè)結(jié)果。該示了初級(jí)人皮膚成纖維細(xì)胞中的p21WAF-1/Cip-1蛋白表達(dá)。用濃度逐漸增加的rAd處理細(xì)胞48小時(shí)，用抗-p21WAF1/Cip1-FITC抗體標(biāo)記，并通過(guò)FACS分析。在直方圖中，線(A，虛線)代表未處理細(xì)胞的染色。線(B)代表用1×107PN/ml rAd-p21WAF1/Cip1處理的細(xì)胞的染色。線(C)代表用1×108PN/mlrAd-p21WAF1/Cip1處理的細(xì)胞的染色。線(D)代表用1×109PN/ml rAd-p21WAF1/Cip1處理的細(xì)胞的染色。直方圖是3個(gè)實(shí)驗(yàn)的代表。
圖1B圖示了給予各種腺病毒載體后的細(xì)胞周期停滯。用濃度逐漸增加的rAd(X-軸)處理細(xì)胞48小時(shí)，用BrdU脈沖標(biāo)記，通過(guò)FACS分析。將數(shù)據(jù)以摻入BrdU的細(xì)胞的百分率繪制在Y軸上(實(shí)心直方圖)。每條代表三孔平行實(shí)驗(yàn)的平均值±1倍標(biāo)準(zhǔn)偏差。1×108PN/ml和1×109PN/ml劑量的rAd-空白和rAd-p21WAF1/Cip1處理組之間的對(duì)比是顯著的(p＜0.05)。
圖1C圖示了給予各種腺病毒載體后的PIP蛋白水平。細(xì)胞與濃度遞增的重組腺病毒(X-軸)溫育48小時(shí)。收集細(xì)胞裂解物，通過(guò)ELISA分析PIP。數(shù)據(jù)以ng PIP/ml總裂解物蛋白(Y軸)作圖。每條代表三孔平行實(shí)驗(yàn)的平均值±1倍標(biāo)準(zhǔn)偏差。3×109PN/ml rAd-p21WAF1/Cip1處理組和所有其它組之間的對(duì)比是顯著的(p＜0.05)。
圖2圖示了大鼠PVA海綿模型的注射日程表。在第0天植入PVA海綿，在海綿植入后4天傳遞rAd-PDGF-B進(jìn)行預(yù)處理。在rAd-PDGF-B預(yù)處理后3天傳遞rAd-p21WAF1/Cip1，5天后收集所有海綿。
圖3圖示了rAd-p21WAF1/Cip1處理對(duì)肉芽組織填充的作用。在植入后12天(rAd-p21WAF1/Cip1處理后5天)收集PVA海綿，并進(jìn)行三色染色。如“材料和方法”所述通過(guò)圖像定量分析評(píng)價(jià)肉芽組織填充的平均百分率。rAd-PDGF-B/rAd-p21WAF1/Cip1對(duì)rAd-PDGF-B/載體和rAd-PDGF-B/rAd-空白接受組之間的對(duì)比是顯著的(分別為p＜0.001和p＝0.05)。但是，在rAd-PDGF-B/rAd-p21WAF1/Cip1對(duì)載體/載體和rAd-空白/rAd-空白接受組之間未觀察到顯著性差異(p＞0.3)。每個(gè)處理組N＝7。
圖4A和圖4B圖示了體內(nèi)rAd-p21WAF1/Cip1處理后的增殖指數(shù)-BrdU和Ki67陽(yáng)性細(xì)胞的平均百分率。用在載體/載體、rAd-PDGF-B/載體、rAd-PDGF-B/rAd-空白和rAd-PDGF-B/rAd-p21WAF1/Cip1處理的海綿中的抗-BrdU和Ki67抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)。rAd-PDGF-B/rAd-p21WAF1/Cip1處理組對(duì)rAd-PDGF-B/載體和rAd-PDGF-B/rAd-空白組之間的對(duì)比是顯著的(*p＜0.01)，以及rAd-PDGF-B/rAd-p21WAF1/Cip1處理組對(duì)rAd-PDGF-B/載體和載體/載體處理組之間的對(duì)比是顯著的(**p＜0.001)。對(duì)于BrdU，計(jì)數(shù)了每個(gè)處理的3塊海綿的9個(gè)區(qū)域。對(duì)于Ki67，計(jì)數(shù)了每個(gè)處理組的4塊海綿。
圖5表明，在兔耳過(guò)多瘢痕形成模型中，在皮內(nèi)給予rAd-p21后，p21表達(dá)抑制瘢痕厚度增加。
發(fā)明詳述I.引言本發(fā)明提供在受傷皮膚中減少和治療瘢痕形成的方法和組合物。本發(fā)明提供向傷口部位傳遞p21WAF1/Cip1和在傷口部位表達(dá)p21WAF1/Cip1減少肉芽組織和成纖維細(xì)胞的出現(xiàn)。不是意圖限制本發(fā)明的范圍，相信p21WAF1/Cip1抑制炎性細(xì)胞(例如嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等)作用，否則該作用應(yīng)在傷口愈合過(guò)程中產(chǎn)生過(guò)多瘢痕形成和細(xì)胞增殖。
本發(fā)明方法包括向傷口部位傳遞含p21WAF1/Cip1或其活性片段的多肽的編碼多核苷酸。在傷口部位表達(dá)p21WAF1/Cip1導(dǎo)致傷口閉和而減少了其它情況下會(huì)出現(xiàn)的瘢痕形成。本發(fā)明特別用于預(yù)防或改善增生性瘢痕形成和瘢痕疙瘩的出現(xiàn)和生長(zhǎng)。
II.傷口本發(fā)明可用于減少皮膚上任何傷口的瘢痕形成。不是意圖限制本發(fā)明的范圍，由例如灼傷、刺、切和/或擦傷產(chǎn)生的皮膚損傷包括可按照本發(fā)明方法治療的傷口。本發(fā)明方法可用于減少手術(shù)(包括整容手術(shù))后的瘢痕形成。
理想地，傷口一出現(xiàn)后就盡快處理傷口。例如，在某些情況下，在傷口出現(xiàn)后72、48、24、18、12、6、3或1小時(shí)處理傷口。對(duì)于手術(shù)瘢痕，本發(fā)明的方法和組合物與手術(shù)同時(shí)給予。但是，可通過(guò)在出現(xiàn)傷口后的長(zhǎng)時(shí)間后處理，實(shí)現(xiàn)抗瘢痕形成作用。一般來(lái)說(shuō)，傷口出現(xiàn)和載體給予之間的時(shí)間越長(zhǎng)，應(yīng)用于傷口的p21WAF1/Cip1載體量越應(yīng)增加。對(duì)于其中基因處于強(qiáng)組成型啟動(dòng)子(例如本文例舉的巨細(xì)胞病毒立即早期(“CMV”)啟動(dòng)子)控制下的復(fù)制缺陷型腺病毒載體，劑量通常約為1×105PN/cm2-1×109PN/cm2、1×105PN/cm2-1×108PN/cm2或1×105PN/cm2-1×107PN/cm2。典型劑量為約5×106PN/cm2。以上參考劑量在傷口出現(xiàn)后立即(即在1天內(nèi))給予傷口部位。如果腺病毒載體明顯較晚(例如傷口出現(xiàn)后1周)應(yīng)用，則為了實(shí)現(xiàn)相似的作用，可能必須將載體劑量增加約10-100倍。據(jù)WAF1ELISA試劑盒(由Oncogene Research Products，San Diego，CA商購(gòu)，目錄號(hào)#QIA18)測(cè)定，組織中p21WAF1/Cip1的典型有效濃度約為50-150單位活性，目標(biāo)濃度約為80-100單位活性。
通常，本發(fā)明方法抑制或減少瘢痕形成，但不抑制傷口閉合。p21WAF1/Cip1如果以足量表達(dá)，則可抑制傷口閉合。例如，含p21WAF1/Cip1多核苷酸的2×1011PN/cm2腺病毒載體足以在動(dòng)物模型中延遲上皮再形成。另外，以此劑量可觀察到對(duì)傷口抗張強(qiáng)度的作用。因此，理想的是使用足量的含p21WAF1/Cip1多核苷酸的載體抑制或減少瘢痕形成，同時(shí)不給予太多載體，以至于延遲上皮再形成或明顯降低抗張強(qiáng)度。
III.基因傳遞為引入編碼p21的多核苷酸序列，可將含啟動(dòng)子(其有效連接至p21多核苷酸)的裸質(zhì)粒摻入到傷口處的細(xì)胞中?；蛘撸瑢21WAF1/Cip1多核苷酸摻入到病毒或非病毒傳遞系統(tǒng)中，然后導(dǎo)入傷口中。
1.非病毒傳遞系統(tǒng)能夠引導(dǎo)傷口中的p21WAF1/Cip1多核苷酸表達(dá)的非病毒傳遞系統(tǒng)包括表達(dá)質(zhì)粒。表達(dá)質(zhì)粒是自主復(fù)制的、染色體外環(huán)狀DNA分子，不同于正常基因組，在能夠影響靶細(xì)胞中的DNA序列表達(dá)的非選擇性條件下不是細(xì)胞存活所必需的。質(zhì)粒在細(xì)菌中自主復(fù)制，以利于細(xì)菌生產(chǎn)，但含細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶基因的這種質(zhì)粒不一定在靶細(xì)胞中復(fù)制以獲得治療效果。轉(zhuǎn)基因也可處于組織特異性啟動(dòng)子區(qū)控制之下，以使轉(zhuǎn)基因僅在特定細(xì)胞類型(例如炎性細(xì)胞，包括例如嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，以及成纖維細(xì)胞和角化細(xì)胞)中表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易鑒別可用于實(shí)施本發(fā)明的各種表達(dá)質(zhì)粒。
表達(dá)質(zhì)粒還可含啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或其它有助于p21多核苷酸表達(dá)的序列。盡管人們可使用組成型啟動(dòng)子(如CMV)，但也可使用在靶細(xì)胞中有特異性活性的啟動(dòng)子，如pFascin啟動(dòng)子(Sudowe等，Molecular Therapy 8(4)(2003))和角蛋白-12啟動(dòng)子(Ikawa等，Molecular Therapy 8(4)666(2003))。響應(yīng)化學(xué)刺激或其它刺激而在某些條件下起作用的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子也可用于有效控制p21WAF1/Cip1表達(dá)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例在科學(xué)文獻(xiàn)中是已知的。參見(jiàn)例如Yoshida和Hamada，Biochem.Biophys.Res.Comm.230426-430(1997)；Iida等，J.Virol.70(9)6054-6059(1996)；Hwang等，J. Virol 71(9)7128-7131；Lee等，Mol.Cell.Biol.17(9)5097-5105(1997)；和Dreher等，J.Biol.Chem.272(46)29364-29371(1997)。輻射誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例包括EGR-1啟動(dòng)子。參見(jiàn)例如Boothman等，(1994)138卷，附頁(yè)S68-S71。
可包含另外的基因，例如編碼藥物抗性的基因，以允許選擇和篩選存在的重組載體。例如，這些另外的基因可包括例如編碼新霉素抗性、多藥物抗性、胸苷激酶、β-半乳糖苷酶、二氫葉酸還原酶(DHFR)和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因。
含p21WAF1/Cip1多核苷酸的表達(dá)質(zhì)?？赡一胫|(zhì)體中。脂質(zhì)體包括乳濁液、泡沫、膠束、不溶性單層、液晶、磷脂分散劑、薄片層等。使用脂質(zhì)體載體將DNA序列傳遞至靶細(xì)胞在本領(lǐng)域眾所周知?？衫酶鞣N方法制備脂質(zhì)體，如例如Szoka等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467(1980)；美國(guó)專利第4,394,448號(hào)、第4,235,871號(hào)、第4,501,728號(hào)、第4,837,028號(hào)和第5,019,369號(hào)所述。用于實(shí)施本發(fā)明的脂質(zhì)體可由一種或多種標(biāo)準(zhǔn)成囊泡脂質(zhì)形成，其通常包括中性和帶負(fù)電荷的磷脂和固醇(例如膽固醇)。
這種成囊泡脂質(zhì)的實(shí)例包括DC-chol、DOGS、DOTMA、DOPE、DOSPA、DMRIE、DOPC、DOTAP、DORIE、DMRIE-HP、n-亞精胺膽固醇氨基甲酸酯和其它如美國(guó)專利第5,650,096號(hào)公開(kāi)的陽(yáng)離子脂質(zhì)。脂質(zhì)的選擇一般受以下因素指導(dǎo)例如脂質(zhì)體大小、酸不穩(wěn)定性和血流中的脂質(zhì)體穩(wěn)定性?？蓪⑵渌M分加入到脂質(zhì)體制劑中，以增加血清半衰期，例如美國(guó)專利第5,013,556號(hào)和第5,213,804號(hào)所描述的聚乙二醇包被(所謂的“PEG化”)。
為了利于將治療基因傳遞入特定組織或器官，可有利地將利于細(xì)胞靶向的元件摻入到非病毒傳遞系統(tǒng)中。
2.病毒傳遞系統(tǒng)在其它情況下，通過(guò)病毒傳遞系統(tǒng)傳遞DNA序列，其中p21WAF1/Cip1多核苷酸摻入到能夠感染靶細(xì)胞的病毒基因組中，且p21WAF1/Cip1多核苷酸有效連接至表達(dá)和控制序列，使得該多核苷酸在合適的條件下于靶細(xì)胞中表達(dá)。用于實(shí)施本發(fā)明的載體還可來(lái)源于病毒基因組。可使用的載體包括重組修飾的包膜或非包膜DNA和RNA病毒，優(yōu)選選自桿狀病毒科、細(xì)小病毒科、小核糖核酸病毒科、皰疹病毒科、痘病毒科或腺病毒科。還可使用利用了各個(gè)親代載體特性的優(yōu)勢(shì)元件的嵌合載體。參見(jiàn)例如Feng等，Nature Biotechnology15866-870(1997)。可通過(guò)重組DNA技術(shù)修飾這種病毒基因組，以包含p21WAF1/Cip1多核苷酸，并可將其工程改造為復(fù)制缺陷型、條件復(fù)制型或增殖型。通常，載體為復(fù)制缺陷型或條件復(fù)制型。示例性載體來(lái)源于腺病毒、腺相關(guān)病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組。在某些實(shí)施方案中，載體為來(lái)源于人腺病毒基因組的非復(fù)制型載體。轉(zhuǎn)基因也可處于組織特異性啟動(dòng)子區(qū)控制之下，使得轉(zhuǎn)基因僅在特定細(xì)胞類型中表達(dá)。
在其它情況下，為確保p21WAF1/Cip1多核苷酸有效傳遞至特定組織或器官，可有利地將利于細(xì)胞靶向的元件摻入到病毒傳遞系統(tǒng)中?？赏ㄟ^(guò)加入允許受體介導(dǎo)胞吞進(jìn)入特定細(xì)胞的受體的配體或特異性抗體，修飾用于包裝本發(fā)明構(gòu)建物的病毒包膜(例如WO 93/20221、WO 93/14188、WO 94/06923)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的DNA構(gòu)建物連接至病毒蛋白，例如腺病毒顆粒，以利于胞吞作用。參見(jiàn)例如Curiel等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.888850-8854(1991)。通過(guò)修飾病毒包膜蛋白，在來(lái)源于具有特征性廣譜感染性的病毒的載體中，也可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞類型特異性或細(xì)胞類型靶向。例如，通過(guò)選擇性修飾病毒基因組頭節(jié)區(qū)(konb)和尾絲編碼序列，以實(shí)現(xiàn)與獨(dú)特細(xì)胞表面受體具有特異性相互作用的修飾頭節(jié)區(qū)和尾絲結(jié)構(gòu)域的表達(dá)，從而用腺病毒載體實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞靶向。此修飾的實(shí)例描述于Wickham等，J.Virol.71(11)8221-8229(1997)(將RGD肽摻入到腺病毒尾絲蛋白中)；Arnberg等，Virology 227239-244(1997)(修飾腺病毒尾絲基因，以實(shí)現(xiàn)眼和生殖道的定向)；Harris和Lemoine TIG 12(10)400-405(1996)；Stevenson等，J.Virol.71(6)4782-4790(1997)；Michael等，Gene Therapy 2660-668(1995)(將胃泌素釋放肽片段摻入到腺病毒尾絲蛋白中)；和Ohno等，Nature Biotechnology 15763-767(1997)(將A蛋白-IgG結(jié)合域摻入到Sindbis病毒中)；和美國(guó)專利第5,721,126號(hào)和第5,559,099號(hào)。通過(guò)綴合抗體或抗體片段至包膜蛋白，已獲得其它細(xì)胞特異性靶向方法。參見(jiàn)例如Michael等，J.Biol.Chem.2686866-6869(1993)，Watkins等，Gene Therapy 41004-1012(1997)；Douglas等，Nature Biotechnology141574-1578(1996)?；蛘?，可將特定部分綴合至病毒表面，以實(shí)現(xiàn)靶向。參見(jiàn)例如Nilson等，GeneTherapy 3280-286(1996)(將EGF綴合至逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白)。
條件復(fù)制型病毒載體用于在特定細(xì)胞類型中實(shí)現(xiàn)選擇性表達(dá)，同時(shí)避免不適當(dāng)?shù)膹V譜感染。條件復(fù)制型載體的實(shí)例描述于Bischoff等，Science 274373-376(1996)；Pennisi，E.，Science 274342-343(1996)；Russell，S.J.Eur.J.of Cancer 30A(8)1165-1171(1994)。
在某些情況下，特別是在使用條件復(fù)制型或增殖型載體時(shí)，除了p21WAF1/Cip1多核苷酸以外，可能還需要在病毒載體中包含自殺基因。自殺基因是一種核酸序列，其表達(dá)使細(xì)胞易被外部因素殺死或在細(xì)胞中產(chǎn)生毒性環(huán)境。自殺基因的一個(gè)廣為人知的實(shí)例是胸苷激酶(TK)基因(參見(jiàn)例如美國(guó)專利第5,631,236號(hào)和美國(guó)專利第5,601,818號(hào))，其中表達(dá)TK基因產(chǎn)物的細(xì)胞容易通過(guò)給予更昔洛韋而被選擇性殺死。這提供了針對(duì)病毒載體傳遞系統(tǒng)的“安全閥”，以防止由自發(fā)產(chǎn)生廣譜感染性的完全增殖型病毒載體所引起的大范圍感染。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，載體來(lái)源于腺病毒科屬。特別優(yōu)選的載體來(lái)源于人腺病毒2型或5型。這種載體由于在E1a和/或E1b編碼區(qū)有修飾和缺失，所以通常是復(fù)制缺陷型的。優(yōu)選實(shí)現(xiàn)特定表達(dá)特征或利于重復(fù)給予或降低免疫應(yīng)答的其它病毒基因組修飾。
在某些實(shí)施方案中，重組腺病毒載體的E4編碼區(qū)完全或部分缺失，任選保留(或缺失)E4 ORF6和ORF 6/7。已表明E3編碼序列不是必需的，其可由腺病毒載體中缺失，但優(yōu)選保留。在某些實(shí)施方案中，修飾E3的啟動(dòng)子操作子區(qū)，以增加E3表達(dá)，獲得對(duì)治療性載體更有利的免疫學(xué)特性。在某些實(shí)施方案中，使用的載體是人腺病毒5型載體，其含處于巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子區(qū)控制之下的p21WAF1/Cip1多核苷酸，以及具有在CMV啟動(dòng)子控制之下的E3、缺失E4編碼區(qū)同時(shí)保留E4 ORF6和ORF6/7的三部分前導(dǎo)序列。
在某些實(shí)施方案中，腺病毒表達(dá)載體含部分或全部缺失的蛋白IX。參見(jiàn)例如美國(guó)專利公開(kāi)第2003/0091534號(hào)。其它腺病毒載體包括描述于例如美國(guó)專利公開(kāi)第2003/0192066號(hào)和第2003/0157688號(hào)的載體。
IV.藥物制劑本發(fā)明進(jìn)一步提供用于給予的在病毒或非病毒傳遞系統(tǒng)中含p21WAF1/Cip1多核苷酸的藥物制劑。配制本發(fā)明組合物，以本領(lǐng)域已知的、可接受用于給予哺乳動(dòng)物對(duì)象(優(yōu)選人)的方式給予。具體地說(shuō)，傳遞系統(tǒng)可配制成局部給予。
本發(fā)明的組合物可以局部制劑或聚合基質(zhì)、水溶膠基質(zhì)、聚合植入體或允許緩慢或持續(xù)釋放組合物的包囊制劑給予。任何含p21WAF1/Cip1編碼DNA的生物相容性基質(zhì)材料都可按照本發(fā)明配制和使用。
本發(fā)明的活化基因的基質(zhì)可來(lái)源于任何生物相容性材料。這種材料可包括但不限于配制成支持細(xì)胞粘附和生長(zhǎng)的支架、粉末或凝膠的生物可降解或非生物可降解材料?；|(zhì)可來(lái)源于合成聚合物或天然蛋白，例如膠原蛋白、其它胞外基質(zhì)蛋白或其它結(jié)構(gòu)大分子。
可用于本發(fā)明的組合物、裝置和方法的基質(zhì)類型實(shí)際上沒(méi)有限制，可包括生物基質(zhì)和合成基質(zhì)?；|(zhì)具有通常與“生物相容性”相關(guān)的所有特征，因?yàn)槠涫窃诮o予哺乳動(dòng)物宿主時(shí)不產(chǎn)生副反應(yīng)、變態(tài)反應(yīng)或其它不適當(dāng)反應(yīng)的形式。這種基質(zhì)可由天然或合成材料形成。基質(zhì)通常為生物可降解的?；|(zhì)可采用海綿、植入體、管、Telfa墊、Band-Aid牌膠帶、繃帶、襯墊、凍干組分、凝膠、敷片、人工皮膚、粉末或納米顆粒的形式。另外，基質(zhì)可設(shè)計(jì)成允許持續(xù)釋放和/或提供細(xì)胞可遷移至其中并被轉(zhuǎn)導(dǎo)的框架，以及提供利于愈合的結(jié)構(gòu)框架。
可使用的生物可降解聚合物在本領(lǐng)域眾所周知，包括(以舉例和非限制性方式)聚酯，例如聚乙交酯、聚交酯和聚乳酸聚乙醇酸共聚物(“PLGA”)(Langer and Folkman，Nature 263797-800(1976)；聚醚，例如聚己酸內(nèi)酯(“PCL”)；聚酐；聚氰基丙烯酸烷基酯，例如氰基丙烯酸正丁酯和氰基丙烯酸異丙酯；聚丙烯酰胺；聚(原酸酯)；聚膦腈；多肽；聚氨甲酸乙酯；以及這些聚合物的混合物。還可使用聚乙二醇(PEG)、環(huán)糊精和衍化環(huán)糊精以及膠原蛋白的聚合物(無(wú)論是天然來(lái)源還是重組來(lái)源獲得)。
一種控制基質(zhì)釋放核酸的方法包括控制聚合物分子量以及基質(zhì)化學(xué)組成。例如，對(duì)于PLGA基質(zhì)，乳酸/乙醇酸的組成比率影響釋放周期。一般來(lái)說(shuō)，較高的乳酸/乙醇酸比率，例如75/25，將提供較長(zhǎng)期的核酸可控持續(xù)釋放，而較低的乳酸/乙醇酸比率將提供更迅速的核酸釋放。
另一種合適材料的具體實(shí)例是纖維膠原蛋白，其可由組織提取和部分純化，然后除菌，接著凍干?；|(zhì)還可由腱或皮膚膠原蛋白制備，其可由各種商業(yè)來(lái)源獲得，例如Sigma and CollagenCorporation。膠原蛋白基質(zhì)還可如美國(guó)專利第4,394,370號(hào)和第4,975,527號(hào)所述制備。
另外，可使用由膠原蛋白和葡糖胺聚糖(GAG)制備的網(wǎng)架(如美國(guó)專利第4,505,266號(hào)或美國(guó)專利第4,485,097號(hào)中所述)實(shí)施本發(fā)明。膠原蛋白/GAG基質(zhì)可有效地用作修復(fù)細(xì)胞可遷移入其中的支持體或“支架”結(jié)構(gòu)。膠原蛋白基質(zhì)，例如美國(guó)專利第4,485,097號(hào)公開(kāi)的膠原蛋白基質(zhì)，也可用作基質(zhì)材料。
在將基質(zhì)應(yīng)用至傷口部位之前，可去除損傷的皮膚或衍生的組織。本發(fā)明的基質(zhì)可含可改善傷口愈合以及使炎癥、感染和/或過(guò)度增殖反應(yīng)最小化的其它因子或化合物。這些物質(zhì)的實(shí)例包括硝酸銀和抗生素。
V.載體當(dāng)傳遞系統(tǒng)被配制成溶液或懸浮液時(shí)，傳遞系統(tǒng)在可接受的載體中，優(yōu)選在水性載體中?？墒褂酶鞣N水性載體，例如水、緩沖水溶液、0.9％鹽水、0.3％甘氨酸、透明質(zhì)酸等。這些組合物可通過(guò)常規(guī)的眾所周知的滅菌技術(shù)滅菌，或可除菌過(guò)濾。獲得的水溶液可照原樣包裝使用，或凍干，凍干制劑在給予前與無(wú)菌溶液混合。
根據(jù)近似生理狀態(tài)的要求，組合物可含藥物可接受的輔助物質(zhì)，例如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、潤(rùn)濕劑等，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、山梨聚糖單月桂酸酯、油酸三乙醇胺等。
在藥物制劑中的本發(fā)明組合物的濃度可廣泛變化，即由少于約0.01％(體積)、通常在或至少約2％(體積)直至多達(dá)20％-50％(體積)或以上，并按照選定的具體給予方式，主要根據(jù)液體體積、粘度等選擇。
VII.傳遞增強(qiáng)劑本發(fā)明的藥物制劑可任選包含一種或多種傳遞增強(qiáng)劑。術(shù)語(yǔ)“傳遞增強(qiáng)劑”包括利于核酸或蛋白分子向靶細(xì)胞轉(zhuǎn)移的物質(zhì)。這種傳遞增強(qiáng)劑的實(shí)例包括去污劑、醇、二醇、表面活性劑、膽汁鹽、肝素拮抗劑、環(huán)加氧酶抑制劑、高滲鹽溶液和乙酸鹽。醇包括例如美國(guó)專利第5,789,244號(hào)描述的脂族醇，如乙醇、N-丙醇、異丙醇、丁醇、乙酰乙醇(acetyl alcobol)，其全部教導(dǎo)通過(guò)引用整體結(jié)合到本文中。二醇包括甘油、丙二醇、聚乙二醇和其它低分子量二醇，例如甘油和硫代甘油。
乙酸鹽如乙酸、葡糖酸和乙酸鈉，是另外的傳遞增強(qiáng)劑實(shí)例。
表面活性劑的實(shí)例是十二烷基硫酸鈉(SDS)和溶血卵磷脂、聚山梨醇酯80、壬基苯氧基聚氧乙烯、溶血磷脂酰膽堿、聚乙二醇400、聚山梨醇酯80、聚氧乙烯醚、聚乙二醇醚表面活性劑和DMSO?？墒褂媚懼}(例如牛磺膽酸鹽、?；敲撗跄懰徕c、脫氧膽酸鹽、鵝脫氧膽酸鹽、甘氨膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸)和其它收斂劑(例如硝酸銀)。還可使用肝素拮抗劑，例如季胺鹽，如硫酸魚精蛋白?？墒褂铆h(huán)氧酶抑制劑，例如水楊酸鈉、水楊酸和非甾族抗炎藥物(NSAIDS)，例如吲哚美辛、萘普生、雙氯芬酸。
SYN3是一種增強(qiáng)基因傳遞的表面活性劑樣分子，描述于美國(guó)專利第6,392,069號(hào)，對(duì)于所有目的其全部教導(dǎo)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。另外的化合物還描述于美國(guó)專利說(shuō)明書第2003/0170216號(hào)，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
如美國(guó)專利第6,165,779號(hào)(其全部教導(dǎo)通過(guò)引用結(jié)合到本文中)所述，使用去污劑也可增強(qiáng)基因傳遞。去污劑包括陰離子、陽(yáng)離子、兩性離子和非離子去污劑。示例性去污劑包括但不限于?；悄懰猁}、脫氧膽酸鹽、?；敲撗跄懰猁}、鯨蠟基苯基偶氮二氨基吡啶、苯扎氯銨、ZWITTERGENTTM3-14去污劑、CHAPS(3-{(3-膽胺基丙基)二甲基銨}-1-丙磺酸鹽水合物，Aldrich)、Big CHAP、脫氧Big CHAP、TRITONTM-X-100去污劑、C12E8、辛基-B-D-葡糖吡喃糖苷、PLURONICTM-F68去污劑、TWEENTM20去污劑和TWEENTM80去污劑(CALBIOCHEMTMBiochemicals)。
傳遞增強(qiáng)劑的濃度取決于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種因素，例如使用的具體傳遞增強(qiáng)劑、緩沖液、pH、靶組織或器官以及給予方式。傳遞增強(qiáng)劑的濃度為1％-50％(體積/體積)，優(yōu)選為10％-40％(體積/體積)，最優(yōu)選為15％-30％(體積/體積)。
磷酸緩沖鹽水(PBS)是這些化合物的一種可能增溶劑。但是，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，可能需要某些其它的賦形劑和添加物，以實(shí)現(xiàn)這些物質(zhì)在各種藥物制劑中的溶解度特性。例如，可以合適的濃度加入眾所周知的增溶劑，例如去污劑、脂肪酸酯、表面活性劑，以利于化合物在各種待使用溶劑中的溶解。當(dāng)溶劑為PBS時(shí)，優(yōu)選的增溶劑為濃度約0.15％的Tween 80。
這些傳遞增強(qiáng)劑可單獨(dú)使用、相互聯(lián)合使用或與其它傳遞增強(qiáng)劑組合使用。
實(shí)施例實(shí)施例1我們證實(shí)，rAd-p21WAF1/Cip1可有效減弱人初級(jí)成纖維細(xì)胞增殖和I型前膠原蛋白沉積。另外，我們還證實(shí)rAd-p21WAF1/Cip1在大鼠PAV海綿傷口愈合模型中減弱肉芽組織和ECM沉積。我們的成果提示，外源性表達(dá)p21WAF1/Cip1是調(diào)節(jié)過(guò)多瘢痕形成的一個(gè)治療選擇。
方法和材料重組腺病毒載體構(gòu)建和純化。先前已描述了含人p21WAF-1/Cip-1的重組腺病毒(Perkins，T.W.等，Arch Ophthalmol.120(7)941-9(2002))。簡(jiǎn)而言之，使用Wills等，Hum Gene Ther.5(9)1079-88(1994)描述的方法，將在組成型巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子(CMV)控制之下的p21WAF-1/Cip-1編碼區(qū)克隆入E1/部分E3缺失的重組腺病毒中。以和rAd-p21WAF1/Cip1相似的方式構(gòu)建rAd-空白對(duì)照腺病毒載體，例外之處是轉(zhuǎn)基因沒(méi)有被工程改造為表達(dá)盒。rAd-PDGF-B是E1/部分E3缺失、含克隆在E1-缺失位點(diǎn)的CMV-PDGF-B表達(dá)盒的腺病毒載體。PDGF-B cDNA由人胎盤cDNA文庫(kù)(Clonetech，Palo Alto，CA)經(jīng)PCR擴(kuò)增，通過(guò)序列比對(duì)證實(shí)其與Genbank克隆M12738 100％同源。將該cDNA克隆入含CMV啟動(dòng)子和E1BpIXpoly-A表達(dá)盒的腺病毒E1轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中。利用Chartier等的方法在大腸桿菌菌株BJ5183中進(jìn)行同源重組，產(chǎn)生感染性病毒DNA，隨后將其轉(zhuǎn)染入人腎293細(xì)胞中，以產(chǎn)生和增殖病毒(Chartier，C.等，J Virol，70(7)4805-10(1996))。病毒顆粒通過(guò)柱層析純化(Shabram，P.W.等，Hum Gene Ther.8(4)453-65(1997))，定量，并以基于FDA指引(Guidance for Human Somatic CellTherapy and Gene Therapy，Center for Biologics Evaluation and Research，March 1998)的顆粒數(shù)(PN)給藥。
細(xì)胞。正常成人皮膚成纖維細(xì)胞得自Cambrex Bio Science(Rutherford，NJ)，并保持在推薦的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。用傳代數(shù)≤4的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
腺病毒感染和溴脫氧尿苷脈沖標(biāo)記細(xì)胞。通過(guò)在無(wú)牛血清白蛋白(FBS)的培養(yǎng)基中平板接種兩天，使細(xì)胞同步在G0/G1期，隨后用在無(wú)FBS培養(yǎng)基中的各種劑量(1×108-3×109PN/ml)的rAd-p21WAF1/Cip1或rAd-空白處理細(xì)胞。24小時(shí)后，去除培養(yǎng)基，加入含20％FBS的培養(yǎng)基，以使細(xì)胞解除G0/G1停滯。在解除后24小時(shí)，用10μM溴脫氧尿苷(BrdU；Boeheringer-Mannheim，Indianapolis，IN)脈沖標(biāo)記細(xì)胞4小時(shí)，收集細(xì)胞，通過(guò)固定在70％乙醇中，接著用0.08％胃蛋白酶于37℃消化30分鐘，進(jìn)行雙變量BrdU/DNA流式細(xì)胞分析。以1500RPM離心細(xì)胞，重懸浮在2N HCl中，于37℃溫育20分鐘。加入1M硼酸鈉，以IFA/Tween 20(0.01M HEPES、0.005％疊氮化鈉、0.5％Tween 20、5％FBS、0.15M NaCl)洗滌細(xì)胞，并與無(wú)Tween 20、1∶10稀釋的抗-BrdU抗體(Becton-Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)溫育30分鐘。最后，以IFA/Tween 20洗滌細(xì)胞，在IFA/Tween 20/RNA酶中于37℃溫育15分鐘，用碘化丙錠(50μg/ml)染色，通過(guò)FACS can型流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson)，使用CellQuest(Becton Dickinson)軟件，用FL-1通道分析。
酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定檢測(cè)人I型前膠原蛋白C-肽(PIP)。將細(xì)胞平板接種在含10％FBS的完全培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)至融合，用在無(wú)FBS培養(yǎng)基中的腺病毒構(gòu)建物感染24小時(shí)。然后洗滌細(xì)胞，在無(wú)FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，然后進(jìn)行PIP分析。按照生產(chǎn)商的說(shuō)明，通過(guò)對(duì)具有1×106細(xì)胞的細(xì)胞裂解物進(jìn)行ELISA(TaKaRa Bio Inc.，Japan)，評(píng)價(jià)PIP的檢測(cè)。
通過(guò)FACS檢測(cè)p21WAF-1/Cip-1。于4℃將細(xì)胞在75％乙醇/PBS中固定30分鐘，于37℃用0.1％BSA/PBS封閉非特異性抗體結(jié)合30分鐘。將與FITC(Ab-1，Oncogene，San Diego，CA)綴合的2μg/ml抗-p21WAF-1/Cip-1抗體和細(xì)胞于室溫溫育60分鐘。用0.1％BSA洗滌細(xì)胞，重懸浮在PBS中，通過(guò)FACS用FL-1通道分析。
PVA海綿模型。按照國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物照顧及使用指引(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)，進(jìn)行動(dòng)物照顧和實(shí)驗(yàn)，并獲得了適當(dāng)審查委員會(huì)的批準(zhǔn)。用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉重350-400g的雄性Sprague-Dawley大鼠(Harlan，Indianapolis，IN)，在各個(gè)大鼠的腹部表面制造6個(gè)全層5mm直線切口。將單個(gè)無(wú)菌聚乙烯醇(PVA)海綿(3級(jí)12.7mm×3mm；M-PACT，Eudora，KS)皮下植入各個(gè)切口中，用縫合夾密封。海綿植入后4天，將配制在200μl膠原蛋白溶液(Cohesion Technologies，Palo Alto，CA)中的1×109PNrAd-PDGF-B或rAd-空白或200μl載體對(duì)照注射入各個(gè)海綿的內(nèi)部。首次注射后3天，向各個(gè)海綿中注射配制在100μl vPBS(PBS，3％蔗糖(體積/體積))中的1×109、1×1010或5×1010PN rAd-p21WAF1/Cip1。在第2次注射后5天，使動(dòng)物安樂(lè)死，收集各個(gè)海綿的中央部分，固定在4％多聚甲醛中，石蠟包埋，制成6μm厚度切片。對(duì)于增殖指數(shù)研究，在安樂(lè)死前24小時(shí)，將50mg/kg BrdU(Calbiochem-Novabiochem Corp.，San Diego，CA)腹膜內(nèi)注射入大鼠中。
免疫組化。對(duì)于p21WAF1/Cip1蛋白檢測(cè)，將6μm的PVA海綿石蠟切片浸入-20℃乙醇/乙酸(2∶1)中10分鐘，接著在高pH緩沖液(Dako，Carpinteria，CA)中用蒸汽進(jìn)行20分鐘抗原修復(fù)。通過(guò)與3％(體積/體積)H2O2溫育猝滅內(nèi)源過(guò)氧化物酶。在20％(體積/體積)山羊血清中封閉載玻片，然后與小鼠單克隆抗人p21WAF-1/Cip-1(1∶100，BD-PharMingen，San Diego，CA)抗體溫育1小時(shí)。在用PBS洗滌(3×5分鐘)后，將載玻片與生物素化山羊抗小鼠IgG二抗(1∶200，Zymed，SanFrancisco，CA)溫育30分鐘。用PBS淋洗載玻片(3×5分鐘)，將載玻片與鏈霉抗生物素蛋白/HRP綴合物(Dako)溫育10分鐘，并用AEC顯色原(chromagen)/底物(Dako)顯色，接著進(jìn)行蘇木精復(fù)染。對(duì)于BrdU檢測(cè)，使用來(lái)自Zymed的BrdU染色試劑盒和Vectastain Elite ABC試劑盒(Vector Labs，Burlingame，CA)的組合方案和試劑。簡(jiǎn)言之，將組織切片放置在唾液酸化的玻璃載玻片上，以50％功率微波加熱5分鐘。切片在預(yù)熱的檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中蒸汽加熱20分鐘，淋洗，用3％H2O2(體積/體積)猝滅內(nèi)源過(guò)氧化物酶10分鐘。接著實(shí)施Zymed試劑盒方案，包括與生物素化小鼠抗BrdU一抗溫育。隨后，載玻片用PBS淋洗，與Vectastain Elite ABC試劑溫育30分鐘，再淋洗，用Vector Nova紅顯色原/底物(Vector Labs)顯色5-15分鐘。對(duì)于Ki67檢測(cè)，以最大功率微波加熱在10mM檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中的石蠟組織切片，用PBS洗滌(3×5分鐘)，用20％(體積/體積)山羊血清封閉30分鐘。切片與小鼠抗人Ki67(1∶100；PharMingen)一抗溫育1小時(shí)，用PBS淋洗(3×5分鐘)，與1∶200稀釋度的生物素化山羊抗小鼠IgG(PharMingen)反應(yīng)30分鐘。按照試劑盒說(shuō)明書，使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB；Vector Labs)顯色檢測(cè)Ki67陽(yáng)性細(xì)胞，接著用蘇木精復(fù)染。
圖象定量分析。為評(píng)價(jià)肉芽組織填充的程度，使用Masson三色染色法處理PVA海綿的組織學(xué)切片。用由Nikon E600顯微鏡和4xPlan-Fluor物鏡(Nikon USA，Melville，NY)獲取的已校準(zhǔn)數(shù)碼照片，使用Image Pro PlusTM軟件(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助定量分析。分析由以下組成定量海綿內(nèi)部的肉芽組織面積，用其除以內(nèi)部整個(gè)海綿面積，乘以100，得到肉芽組織填充百分率。樣品數(shù)量由每個(gè)處理組平均6塊海綿組成。對(duì)于體內(nèi)增殖指數(shù)，用40x或4x顯微鏡物鏡獲取BrdU和Ki67免疫組化切片的數(shù)碼影象，將其輸入Adobe Photoshop 5.0軟件(Adobe Systems Inc.，San Jose，CA)。記錄每個(gè)所觀測(cè)視野的陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)(紅色或褐色)和總細(xì)胞計(jì)數(shù)(紫色細(xì)胞核)。對(duì)于BrdU，計(jì)數(shù)每個(gè)組的每個(gè)組織切片的3個(gè)400X視野(最少1500個(gè)細(xì)胞)。對(duì)于Ki67，評(píng)價(jià)每組的3個(gè)完整組織切片(最少13,000個(gè)細(xì)胞/切片)。核染色的BrdU或Ki67被認(rèn)為是陽(yáng)性的，與染色強(qiáng)度無(wú)關(guān)。通過(guò)將紅色或褐色細(xì)胞群計(jì)數(shù)除以紅色或褐色+紫色細(xì)胞群計(jì)數(shù)，并乘以100，計(jì)算增殖指數(shù)百分率。
統(tǒng)計(jì)分析。標(biāo)出的數(shù)據(jù)以算術(shù)平均值±SD或±SEM提供。使用不成對(duì)student t-檢驗(yàn)(StatView，SAS Institute Inc，Cary，NC)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。p≤0.05時(shí)差異被認(rèn)為是顯著的。
結(jié)果人皮膚成纖維細(xì)胞表達(dá)外源p21WAF-1/Cip-1蛋白，并響應(yīng)rAd-p21WAF1/Cip1表現(xiàn)出細(xì)胞周期停滯用劑量逐漸增加的rAd-p21WAF1/Cip1或rAd-空白處理人初級(jí)皮膚成纖維細(xì)胞48小時(shí)，評(píng)價(jià)其中p21WAF-1/Cip-1基因的表達(dá)。根據(jù)FACS分析測(cè)定，響應(yīng)rAd-p21WAF1/Cip1而不是rAd-空白，p21WAF-1/Cip-1表達(dá)以劑量依賴性方式增加(圖1A)。響應(yīng)1×108PN/ml，p21WAF1/Cip1表達(dá)超過(guò)未處理細(xì)胞，由4.1±1.0(未處理)增加至6.0±0.2(p＝0.005)。響應(yīng)最高劑量1×109PN rAd-p21WAF1/Cip1/ml，表達(dá)超過(guò)未處理細(xì)胞，由4.1±1.0增加至35.1±1.5(p＝0.001)。因此，p21WAF-1/Cip-1可以以劑量依賴性方式在初級(jí)皮膚成纖維細(xì)胞中有效表達(dá)。
接著，我們進(jìn)行體外劑量反應(yīng)研究，以確定外源p21WAF-1/Cip-1表達(dá)是否可在人皮膚成纖維細(xì)胞中誘發(fā)細(xì)胞周期停滯。根據(jù)BrdU摻入和FACS分析的檢測(cè)，用1×107-1×109PN rAd-p21WAF1/Cip1/ml處理的細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞增殖的劑量依賴性降低(圖1B)。S-期細(xì)胞百分率由未處理細(xì)胞群中的平均64.4±5.7％，減少至響應(yīng)1×108PN/ml rAd-p21WAF1/Cip1的20.6±2.6％。在1×109PN/ml的最高rAd-p21WAF1/Cip1劑量下，觀察到S期細(xì)胞百分率下降至僅檢出0.6±0.1％的陽(yáng)性細(xì)胞。用兩個(gè)最高劑量的rAd-空白觀測(cè)到可檢測(cè)的細(xì)胞周期抑制。具體地說(shuō)，在1×108PN/ml rAd-空白時(shí)，56.9±1.0％的細(xì)胞摻入BrdU，而在1×109PN/ml時(shí)，34.4±10.7％的細(xì)胞摻入BrdU。先前已描述了響應(yīng)高劑量對(duì)照腺病毒的增殖減弱(Brand，K.等，Gene Ther.6(6)1054-63(1999))。當(dāng)將rAd-p21WAF1/Cip1和rAd-空白于1×108PN/ml和1×109PN/ml對(duì)比時(shí)，BrdU摻入顯著下降(p＜0.05)。這些數(shù)據(jù)提示，盡管高劑量的重組腺病毒處理誘發(fā)一般的抗增殖作用，但我們已證明，響應(yīng)傷口靶細(xì)胞中的rAd-p21WAF1/Cip1，增殖以p21WAF1/Cip1特異性劑量依賴性降低。
人皮膚成纖維細(xì)胞在rAd-p21WAF1/Cip1作用下降低PIP的產(chǎn)生為測(cè)定PIP肽在傳遞p21WAF1/Cip1后是否減少，用劑量遞增的rAd-p21WAF1/Cip1或rAd-空白處理人成纖維細(xì)胞48小時(shí)(圖1C)。對(duì)細(xì)胞數(shù)相等的裂解物進(jìn)行ELISA，以定量胞內(nèi)PIP水平。數(shù)據(jù)表明，和對(duì)照組相比，用rAd-p21WAF1/Cip1處理人皮膚成纖維細(xì)胞后，PIP減少超過(guò)1/2。和未處理細(xì)胞相比，最高濃度rAd-p21WAF1/Cip1處理(3.0×109PN/ml)時(shí)檢測(cè)到的PIP減少，分別為165.1±9.0ng/ml蛋白對(duì)60.0±6.3ng/ml蛋白。最高劑量的rAd-空白處理顯示為170.2±10.3ng/ml胞內(nèi)PIP，與未感染細(xì)胞沒(méi)有變化。我們先前的研究已經(jīng)表明，經(jīng)FACS分析評(píng)價(jià)，在該檢測(cè)系統(tǒng)中人皮膚成纖維細(xì)胞100％為轉(zhuǎn)基因表達(dá)陽(yáng)性(數(shù)據(jù)未列出)。利用Annexin V染色和FACS進(jìn)行凋亡檢測(cè)，以測(cè)定細(xì)胞存活力，數(shù)據(jù)表明，細(xì)胞未凋亡(數(shù)據(jù)未列出)。這些數(shù)據(jù)表明，在rAd-p21WAF1/Cip1處理后胞外相關(guān)肽減少。
在體內(nèi)rAd-PDGF-B刺激后rAd-p21WAF1/Cip1減少肉芽組織為確定rAd-p21WAF1/Cip1對(duì)體內(nèi)肉芽組織的作用，使用大鼠PVA海綿模型(Buckley，A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(21)7340-4(1985))。用1×109PN/海綿的rAd-PDGF-B作為肉芽組織刺激劑注射到大鼠中的PVA海綿(Liechty，K.W.等，J Invest Dermatol，113(3)375-83(1999))，3天后以5.0×1010PN/海綿給予rAd-p21WAF1/Cip1(圖2)。另以和rAd-PDGF-B以及rAd-p21WAF1/Cip1相同的劑量水平將rAd-空白病毒傳遞至海綿，以用作重組腺病毒可對(duì)該模型系統(tǒng)產(chǎn)生的一般性作用的對(duì)照。根據(jù)在rAd-p21WAF1/Cip1傳遞后第5天通過(guò)三色染色PVA海綿進(jìn)行的評(píng)價(jià)，rAd-PDGF-B/rAd-p21WAF1/Cip1處理海綿中的肉芽組織在量和細(xì)胞密度上均有下降(圖3)。載體/載體(圖3)和rAd-空白/rAd-空白組(未列出)具有與rAd-PDGF-B/rAd-p21WAF1/Cip1處理組(圖3)相似的肉芽組織形態(tài)。在rAd-PDGF-B/載體處理組中觀察到的肉芽組織填充最高(77％，圖3)，這與公開(kāi)的報(bào)道一致，這表明，刺激劑PDGF-B在該模型中增強(qiáng)生長(zhǎng)反應(yīng)(Liechty，K.W.等，J Invest Dermatol，113(3)375-83(1999))。我們觀測(cè)到的肉芽組織填充在rAd-PDGF-B/rAd-空白組中為53％，在rAd-PDGF-B/rAd-p21WAF1/Cip1組中為28％，在載體/載體組中為24％，在rAd-空白/rAd-空白組中為18％(圖3)。和rAd-PDGF-B/載體和rAd-PDGF-B/rAd-空白處理相比，rAd-PDGF-B后接rAd-p21WAF1/Cip1處理分別誘導(dǎo)肉芽組織填充降低至1/2.7和1/1.9(p＜0.001和p＝0.05)。相比之下，在載體/載體、rAd-空白/rAd-空白和rAd-PDGF-B/rAd-p21WAF1/Cip1處理組之間未觀測(cè)到顯著差異(p＞0.3)。載體/載體、rAd-PDGF-B/載體和rAd-PDGF-B/rAd-空白處理組相互之間均有顯著差異(分別為，p＜0.001和p＝0.01)。在另一個(gè)研究中，用1×109-5×1010PN/ml的rAd-p21WAF1/Cip1進(jìn)行劑量反應(yīng)(表1)。與rAd-PDGF-B/載體處理的最大填充相比，肉芽含量在1×109PN/ml時(shí)下降23％，在1.0×1010PN/ml時(shí)下降37％，在5×1010PN/ml時(shí)下降47％。這些數(shù)據(jù)表明，在rAd-p21WAF1/Cip1處理后肉芽組織定量和定性地減少。
體內(nèi)的p21WAF-1/Cip-1蛋白表達(dá)為驗(yàn)證體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及關(guān)聯(lián)p21WAF-1/Cip-1表達(dá)和肉芽組織減少，我們使用抗人p21WAF-1/Cip-1特異性抗體鑒別大鼠PVA海綿模型中表達(dá)p21WAF-1/Cip-1的細(xì)胞。用rAd-p21WAF1/Cip1處理后5天，定位肉芽組織細(xì)胞中的p21WAF-1/Cip-1蛋白，肉芽組織細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上類似于炎性細(xì)胞(圖5C，小箭頭)和成纖維樣細(xì)胞。我們?cè)谳d體/載體或rAd-PDGF-B/載體處理組中均未觀測(cè)到p21WAF-1/Cip-1陽(yáng)性染色的細(xì)胞。盡管主要的p21WAF-1/Cip-1表達(dá)細(xì)胞群在給予rAd-p21WAF1/Cip1后5天表現(xiàn)出強(qiáng)烈染色，但我們目前還沒(méi)有在該模型中確定p21WAF-1/Cip-1蛋白表達(dá)的峰反應(yīng)和時(shí)程。然而，在兔青光眼濾過(guò)手術(shù)模型中，經(jīng)RT-PCR評(píng)測(cè)，rAd-p21WAF1/Cip1表達(dá)在1周內(nèi)達(dá)到峰值，并持續(xù)30天以上(Perkins，T.W.等，Arch Ophthalmol 120(7)941-9(2002))。這些數(shù)據(jù)支持肉芽組織減少和體內(nèi)p21WAF-1/Cip-1表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)。
在體內(nèi)rAd-p21WAF1/Cip1處理后增殖指數(shù)下降為確定rAd-p21WAF1/Cip1傳遞后肉芽組織的增殖狀態(tài)，對(duì)PVA海綿組織進(jìn)行BrdU和Ki67免疫組化染色。圖4提供了載體/載體組、rAd-PDGF-B/載體組、rAd-PDGF-B/rAd-空白組和rAd-PDGF-B/rAd-p21WAF1/Cip1組中的BrdU和Ki67陽(yáng)性細(xì)胞百分率。在rAd-PDGF-B/載體組和rAd-PDGF-B/rAd-空白組中觀測(cè)到的BrdU染色最高(分別為25％和24％)，這表明rAd-PDGF-B促進(jìn)組織增殖，還提示rAd-空白處理對(duì)體內(nèi)增殖狀態(tài)的影響最小。在rAd-PDGF-B/rAd-p21WAF1/Cip1處理組中鑒別出的BrdU染色細(xì)胞百分率最低(9％)。和rAd-PDGF-B/載體和rAd-PDGF-B/rAd-空白相比，rAd-PDGF-B/rAd-p21WAF1/Cip1處理組中的BrdU摻入明顯較低(兩個(gè)對(duì)比均為p＜0.01)。另外，載體/載體處理組的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比rAd-PDGF-B/rAd-p21WAF1/Cip1處理組高出1倍(分別為18％對(duì)9％)。
盡管BrdU摻入需要S期啟動(dòng)，但Ki67或Mib1抗原在G0期以外的所有細(xì)胞周期階段都表達(dá)(Barnard，N.J.等，J Pathol，152(4)287-95(1987))。Ki67染色分析顯示出與BrdU染色相似的陽(yáng)性細(xì)胞百分率(圖4B)。載體/載體處理組和rAd-PDGF-B/載體處理組的增殖指數(shù)分別為22％和34％。相比之下，rAd-PDGF-B/rAd-p21WAF1/Cip1處理組表現(xiàn)出的增殖細(xì)胞百分率(11％)明顯比rAd-PDGF-B/載體和載體/載體處理組低(全部對(duì)比都為p＜0.001)。這些數(shù)據(jù)表明，rAd-p21WAF1/Cip1處理通過(guò)降低細(xì)胞增殖減少體內(nèi)肉芽組織。
總結(jié)增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的病因還未知曉，但似乎由正常傷口愈合反應(yīng)中的失調(diào)引起。正常傷口愈合由于纖維增生反應(yīng)而演進(jìn)，發(fā)展成纖維化瘢痕。重要之處在于，即使是在最佳情況下，受傷部位也是“修補(bǔ)”而不是“復(fù)原”，形式和功能都受到與組織再生相對(duì)的負(fù)責(zé)替換的機(jī)制影響。正常傷口愈合的級(jí)聯(lián)由3個(gè)時(shí)間上重疊的反應(yīng)組成，包括炎癥、增殖和重建階段。在所有階段中，在涉及生長(zhǎng)促進(jìn)因子和負(fù)責(zé)下調(diào)增殖反應(yīng)的因子的分解代謝和合成代謝過(guò)程之間存在著平衡。盡管在闡述參與刺激傷口愈合的因素方面已獲得顯著進(jìn)展，但關(guān)于分子過(guò)程(包括涉及正常傷口愈合反應(yīng)的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和程序性細(xì)胞死亡)的進(jìn)展則少得多。本文提供的數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞周期調(diào)節(jié)對(duì)涉及傷口修復(fù)和瘢痕形成的過(guò)程所具有的重要作用。
我們的研究表明，經(jīng)重組腺病毒傳遞的p21WAF-1/Cip-1在人初級(jí)皮膚成纖維細(xì)胞中可有效抑制人初級(jí)皮膚成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期。我們表明，經(jīng)體外BrdU染色證實(shí)，p21WAF-1/Cip-1蛋白表達(dá)的劑量依賴性增加與增殖狀態(tài)的劑量依賴性下降有關(guān)聯(lián)。用最高劑量的對(duì)照腺病毒處理觀測(cè)到可檢測(cè)的抗增殖作用，但碘化丙錠染色揭示，這些細(xì)胞在G2/M而不是G1期累積，這和用rAd-p21WAF-1/Cip-1處理的細(xì)胞的情況一樣(數(shù)據(jù)未列出)。先前已描述了用單獨(dú)的高劑量重組腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)使細(xì)胞增殖降低的觀測(cè)結(jié)果，幾個(gè)研究報(bào)道了含報(bào)告基因的高劑量重組腺病毒的抗腫瘤作用(Erhardt，J.A.和R.N.Pittman，Oncogene，16(4)443-51(1998)；Pierce，G.F.等，J Exp Med.167(3)974-87(1988)；Teramoto，S.等，Hum Gene Ther.6(8)1045-53(1995))。在人皮膚初級(jí)成纖維細(xì)胞中，細(xì)胞p21WAF-1/Cip-1蛋白水平增加與增殖反應(yīng)下降相互關(guān)聯(lián)。
胞外基質(zhì)(即膠原蛋白)的過(guò)量累積和結(jié)構(gòu)破壞是瘢痕疙瘩和增生性瘢痕的特征(Rockwell，W.B.等，Plast Reconstr Surg，84(5)827-37(1989))。已有報(bào)道指兩種化療劑絲裂霉素C和阿霉素以包括ECM和細(xì)胞毒性降低的作用機(jī)制抑制傷口愈合反應(yīng)(Saika，S.等，OphthalmicRes.29(2)91-102(1997))。我們的研究表明，皮膚初級(jí)成纖維細(xì)胞中的p21WAF-1/Cip-1水平升高降低了體外PIP水平。令人感興趣的是，PIP水平被減弱但未被消除，這提示在活細(xì)胞群中保持了基礎(chǔ)水平的PIP生產(chǎn)。相比之下，盡管絲裂霉素C和阿霉素減少了PIP分泌，但觀察到細(xì)胞存活的劑量依賴性下降，這有可能是在傷口愈合動(dòng)物模型中觀察到的傷口開(kāi)裂的成因(Saika，S.等，Ophthalmic Res.29(2)91-102(1997))。此外，PIP水平未受rAd-空白處理的影響，提示PIP降低是p21WAF-1/Cip-1特異性的。轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞是轉(zhuǎn)錄活性的(數(shù)據(jù)未列出)，這表明PIP降低不是細(xì)胞中一般轉(zhuǎn)錄阻抑的結(jié)果。我們推測(cè)，由于外源表達(dá)p21WAF-1/Cip-1而引起的胞外基質(zhì)生產(chǎn)減少對(duì)體內(nèi)肉芽組織產(chǎn)生有弱化作用。
不存在精確模擬人瘢痕疙瘩和增生性瘢痕的生化參數(shù)和病理生理學(xué)參數(shù)的動(dòng)物模型。在本報(bào)道中，我們使用一種動(dòng)物模型系統(tǒng)來(lái)研究p21WAF-1/Cip-1升高對(duì)體內(nèi)肉芽組織的作用。肉芽組織由成纖維細(xì)胞、新微血管、炎性細(xì)胞和胞外基質(zhì)組成，是傷口修復(fù)的必要和必需元件。肉芽組織的正常時(shí)空形成的破壞被認(rèn)為在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中起病因作用。PDGF-BB是肉芽組織形成的有效刺激劑，最近的報(bào)道已證明了其在傷口損傷模型中的有效促傷口愈合作用(Liechty，K.W.等，J Invest Dermatol 113(3)375-83(1999)；Pierce，G.F.等，J Exp Med.167(3)974-87(1988)；Pierce，G.F.等，J Cell Biochem.45(4)319-26(1991)；Doukas，J.等，Hum Gene Ther.12(7)783-98(2001))。令人感興趣的是，將PDGF-BB加入到無(wú)瘢痕胎兒模型中引起傷口纖維化，PDGF-BB的水平升高與肝硬化有關(guān)聯(lián)(Haynes，J.H.等，J Pediatr Surg.29(11)1405-8(1994)；Peterson，T.C.和R.A.Isbrueker，Hepatology 15(2)191-7(1992))。我們使用rAd-PDGF-B增強(qiáng)細(xì)胞流入、增殖和肉芽組織沉積，接著在大鼠PVA海綿模型中進(jìn)行rAd-p21WAF1/Cip1處理，以確定rAd-p21WAF-1/Cip-1是否可弱化體內(nèi)的這些刺激作用。
我們的結(jié)果表明，與單獨(dú)的rAd-PDGF-B處理相比，rAd-p21WAF1/Cip1定性和定量地減少肉芽填充。rAd-空白處理后的肉芽填充減少與我們的體外結(jié)果一致，在作用上比rAd-p21WAF1/Cip1處理遜色。最初，我們假定單獨(dú)的rAd-空白處理可通過(guò)已由文件證明的rAd傳遞載體對(duì)宿主的免疫調(diào)節(jié)作用干擾肉芽組織的數(shù)量(Nielsen，L.L.，Oncol Rep 7151-5(2000)；Kajiwara，K.等，Hum Gene Ther，.8(3)253-65(1997)；St George，J.A.等，Gene Ther，3(2)103-16(1996)；Brody，S.L.等，Hum Gene Ther，5(7)821-36頁(yè)(1994))。我們重復(fù)地發(fā)現(xiàn)，PDGF-BB和p21WAF-1/Cip-1的刺激和抑制作用分別調(diào)節(jié)肉芽組織活性，超過(guò)了源自重組腺病毒的反應(yīng)。此觀察結(jié)果的關(guān)鍵之處在于我們證明了體內(nèi)肉芽組織的p21WAF1/Cip1劑量依賴性減少，這進(jìn)一步支持了在該模型系統(tǒng)中的基因特異性活性。
我們能夠證明rAd-p21WAF1/Cip1處理的海綿中人p21WAF-1/Cip-1蛋白的表達(dá)，因此將人p21WAF-1/Cip-1和肉芽組織減少聯(lián)系在一起。我們還通過(guò)兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)表明p21WAF-1/Cip-1處理的海綿中增殖減少，這支持p21WAF-1/Cip-1在體內(nèi)的直接抗增殖作用。在這些研究中沒(méi)有確定細(xì)胞特異性蛋白表達(dá)，但在形態(tài)學(xué)上，我們的結(jié)果提示巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞均可表達(dá)外源p21WAF-1/Cip-1蛋白。
皮膚是機(jī)體最大的器官，其以有限的系統(tǒng)暴露提供局部區(qū)域傳遞，易到達(dá)并可非侵入性檢查。病毒和非病毒途徑均已證實(shí)基因轉(zhuǎn)移(Khavari P.A.等，J Intern Med，252(1)1-10(2002))。我們?cè)诒疚奶峁┝艘韵伦C據(jù)經(jīng)重組腺病毒傳遞的外源表達(dá)的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑p21WAF-1/Cip-1減弱與過(guò)多瘢痕形成相關(guān)的增殖反應(yīng)。使用合適的設(shè)計(jì)和應(yīng)用方案，p21WAF-1/Cip-1在皮膚病(例如其中病理生理學(xué)源自增殖反應(yīng)失調(diào)的瘢痕疙瘩和增生性瘢痕)中具有處理用途。
實(shí)施例2本實(shí)施例闡述了傷口中的rAd-p21傳遞和p21WAF-1/Cip-1表達(dá)。
如下在單次皮內(nèi)注射后的兔耳過(guò)多瘢痕模型中表征rAd-p21基因傳遞和隨時(shí)間的表達(dá)
方法對(duì)每只兔耳誘生2-4個(gè)6mm直徑的傷口。待分析的樣品數(shù)量由每個(gè)處理組3-8個(gè)傷口組成。將兩只耳相同受傷部位的兩個(gè)傷口合并，并放在單個(gè)試管中，以滿足RT-PCR和PCR實(shí)驗(yàn)的組織要求。該試管代表兩個(gè)傷口的平均值和一個(gè)檢測(cè)樣品。對(duì)于PCR和RT-PCR實(shí)驗(yàn)，在第8小時(shí)、第1、3、5、7和10天的收集時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行，N＝1或4代表總共2或8個(gè)傷口。對(duì)于第14天，將一個(gè)傷口放在單個(gè)試管中作為一個(gè)樣品，因此N＝1或4代表每組共1或4個(gè)傷口。對(duì)于形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)，一個(gè)傷口代表1個(gè)樣品，每組評(píng)價(jià)2-4個(gè)樣品。
vPBS處理組同時(shí)用作PCR/RT-PCR實(shí)驗(yàn)和形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)的載體對(duì)照。rAd-空白處理在本研究中用作腺病毒作用的對(duì)照。
檢測(cè)試劑制備rAd-p21和rAd-空白在研究的第0天用vPBS稀釋液稀釋病毒母液，并保持在冰上。在皮內(nèi)注射入動(dòng)物前半小時(shí)，將稀釋的病毒升至室溫。
兔準(zhǔn)備肌內(nèi)注射70mg/kg氯胺酮、5mg/kg甲苯噻嗪和0.1mg/kg布托啡諾，麻醉雌性新西蘭白兔。用脫毛器(NairTM)脫耳毛，用溫自來(lái)水淋洗耳，用聚維酮碘和異丙醇擦洗手術(shù)部位。將動(dòng)物由預(yù)手術(shù)室轉(zhuǎn)移至手術(shù)室。
手術(shù)方法和處理在無(wú)菌條件下，用環(huán)鉆在每只耳的腹面上制造2-4個(gè)深達(dá)軟骨的6mm傷口。用止血鉗去除每個(gè)傷口的軟骨和上皮。用Mastisol準(zhǔn)備傷口周邊部位，用OpSite繃帶覆蓋傷口，以防止干燥。在研究過(guò)程中繃帶保留在傷口上。用28G胰島素注射器，在每個(gè)傷口周邊部位周圍皮內(nèi)注射2×106或2×1010PN/傷口的rAd-p21，總體積為100μl/傷口。傷口上的注射部位在3、6、9和12點(diǎn)位置，并在傷口周邊部位的2-3mm內(nèi)。對(duì)組1、3和4的所有兔的兩只耳重復(fù)以上步驟。對(duì)rAd-空白處理組，在第1、3、10天的時(shí)間點(diǎn)使每只兔的一只耳受傷。使動(dòng)物返回籠中，允許隨意進(jìn)食和飲水。
終點(diǎn)分析在規(guī)定的處死時(shí)間點(diǎn)，用過(guò)量的Euthasol CIII 200mg/kg靜脈內(nèi)麻醉動(dòng)物，在底部切除兔耳。用10mm活組織檢查穿孔器切除全層傷口，并放置在含250μl QIAGEN RNAlaterTM(RNA穩(wěn)定試劑)的微量離心管中。所有組織都浸入RNA穩(wěn)定試劑中，并儲(chǔ)存在4℃，用于PCR和RT-PCR分析。在第14天的時(shí)間點(diǎn)，所有的步驟都和上述相同，除了將來(lái)自相同耳傷口部位的一個(gè)傷口放置在微量離心管中代表一個(gè)樣品以外。對(duì)于形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)，將傷口切開(kāi)兩半，一半傷口冷凍在OCT化合物(Optimum Cryosection TemperatureCompound)中，剩余的一半于4℃在4％多聚甲醛中固定4小時(shí)，轉(zhuǎn)移至70％EtOH中，進(jìn)行三色染色處理。對(duì)傷口組織切片進(jìn)行炎性和傷口愈合反應(yīng)的形態(tài)學(xué)檢查。
定量PCR/定量RT-PCR和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備如先前Wen.等，ExpEye Res.77(3)355-65(2003)的描述，使用定量PCR和RT-PCR(QPCR和QRT-PCR)方法定量rAd-p21 DNA和轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。使用Tri-Reagent由約50-100mg組織中共提取DNA和RNA。
結(jié)果在兔耳過(guò)多瘢痕模型中，在受傷后立即傳遞單次皮內(nèi)劑量，以此表征隨時(shí)間變化的rAd-p21傳遞和人p21WAF-1/Cip-1基因表達(dá)。實(shí)施QPCR和QRT-PCR技術(shù)，以定量傷口部位中的rAd-p21 DNA和人p21WAF-1/Cip-1基因表達(dá)。
QPCR和QRT-PCR評(píng)價(jià)通過(guò)皮內(nèi)單劑注射至兔耳傷口，以2×106或2×1010PN/傷口傳遞rAd-p21。每個(gè)rAd-p21分析樣品為每個(gè)傷口2×106或2×1010PN的兩個(gè)傷口的合并，因此總共分別為4×106或4×1010PN。在第14天，每個(gè)樣品僅為一個(gè)傷口。
在第8小時(shí)和第1天，由低和高rAd-p21劑量組都觀測(cè)到最高的rAd-p21 DNA水平。在低和高劑量rAd-p21組，在14天的周期內(nèi)，DNA水平分別下降1.0和3.0個(gè)對(duì)數(shù)。在高劑量組，在皮內(nèi)注射后3天觀測(cè)到最高的rAd-p21 RNA水平。和第3天的峰值水平相比，第7、10和14天的RNA水平下降約0.5-1.0個(gè)對(duì)數(shù)。在處理后8小時(shí)和第1天，在低劑量rAd-p21組未能檢測(cè)到RNA水平(在可定量水平以下；BQL)。在第3天觀測(cè)到在低劑量rAd-p21組出現(xiàn)可檢測(cè)的RNA表達(dá)。在第3天和第14天觀測(cè)到峰值RNA水平，低劑量組中第3天和第14天的RNA水平無(wú)顯著差異(p＜0.5；Fisher′s Post HocANOVA)。在低劑量rAd-p21組，與第3天和第14天的RNA水平相比，第5、7和10天的RNA水平降低約0.5-1.0個(gè)對(duì)數(shù)。正如所料，所有的vPBS樣品都是陰性的，證實(shí)樣品沒(méi)有交叉污染，或人p21引物序列和內(nèi)源兔序列沒(méi)有交叉反應(yīng)性。低劑量時(shí)隨時(shí)間變化的此RNA表達(dá)模式表現(xiàn)出和高劑量rAd-p21組相似的表達(dá)趨勢(shì)。
形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)兔傷口的形態(tài)學(xué)變化發(fā)生在典型的急性傷口愈合過(guò)程階段之后。簡(jiǎn)而言之，在受傷后8小時(shí)，觀察到傷口中的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。在第1天和第3天，所有傷口中的炎性細(xì)胞流入都增加。至第5天，肉芽組織開(kāi)始填充傷口，在傷口邊緣附近觀察到上皮遷移突起(tongue)。在第7、10和14天，傷口被肉芽組織填滿，并被上皮覆蓋。在第10天和第14天，與其余組相比，在低rAd-p21劑量處理組中觀察到較薄的肉芽組織和上皮層。但是，在第14天，低劑量rAd-p21組顯示出比高劑量組更密集的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。此數(shù)據(jù)提示，rAd-p21可減小傷口瘢痕的肉芽組織體積和上皮厚度。
討論在高和低劑量rAd-p21處理組，在兔耳傷口中均檢測(cè)到人rAd-p21DNA傳遞和p21WAF-1/Cip-1RNA表達(dá)。高和低劑量組中p21WAF-1/Cip-1RNA水平在14天的周期內(nèi)都得到保持。
實(shí)施例3本實(shí)施例闡述了rAd-p21處理抑制瘢痕厚度。
使用過(guò)多瘢痕兔模型測(cè)定rAd-p21處理對(duì)瘢痕厚度的作用。如前所述，通過(guò)將PDGF-BB(2μg)蛋白注射入兔耳傷口誘發(fā)增強(qiáng)的瘢痕形成。7天后第2次注射2×1010PN的rAd-p21或rAd-空白。檢測(cè)響應(yīng)處理的瘢痕高度，在rAd-p21處理后約11天觀測(cè)到的作用最大。在第18天和第35天(初始受傷后)之間檢測(cè)瘢痕組織，在初次注射PDGF-BB后第35天收集組織。
圖5表明，在兔耳過(guò)多瘢痕模型中，rAd-p21處理在皮內(nèi)傳遞后減小了瘢痕厚度。此數(shù)據(jù)支持先前的觀察結(jié)果在正常瘢痕環(huán)境下，低劑量的rAd-p21(例如2×106PN/傷口(7×106PN/cm2))在該模型中有效降低瘢痕高度。當(dāng)使用PDGF-BB誘發(fā)增強(qiáng)的瘢痕形成時(shí)，需要更多的rAd-p21來(lái)克服這些瘢痕作用。
在本說(shuō)明書中引用的所有出版物和專利申請(qǐng)都通過(guò)引用結(jié)合到本文中，如同各單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)被明確和個(gè)別指出通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
盡管為了清楚理解的目的，已通過(guò)說(shuō)明和實(shí)施例的方式詳細(xì)地描述了前述發(fā)明，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易理解，按照本發(fā)明的教導(dǎo)，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行某些變化和修改，而不偏離所附權(quán)利要求書的精神或范圍。
權(quán)利要求
1.一種減少瘢痕形成的方法，所述方法包括給予具有傷口的對(duì)象的皮膚含表達(dá)盒的多核苷酸，其中所述表達(dá)盒包含有效連接至p21WAF1/Cip1編碼多核苷酸的啟動(dòng)子。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述DNA作為載體的一部分給予。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述載體為病毒載體。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述病毒載體為腺病毒載體。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述腺病毒載體為復(fù)制缺陷型腺病毒載體。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述給予步驟導(dǎo)致傷口處的瘢痕疙瘩或增生性瘢痕形成比未處理傷口上的瘢痕形成減少。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述腺病毒載體以105-109顆粒數(shù)(PN)/cm2傷口之間的劑量給予。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述載體在生物相容性基質(zhì)中給予。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述基質(zhì)包括膠原、金屬、羥基磷灰石、生物玻璃、鋁酸鹽、生物陶瓷材料、純化的蛋白或胞外基質(zhì)組合物。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述基質(zhì)為膠原基質(zhì)。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述皮膚被灼傷。
12.一種藥物組合物，所述組合物包含表達(dá)盒和藥物可接受賦形劑，其中所述組合物適于局部給予，所述表達(dá)盒包含有效連接至p21WAF1/Cip1編碼多核苷酸的啟動(dòng)子。
13.權(quán)利要求12的藥物組合物，其中所述表達(dá)盒在生物相容性基質(zhì)中。
14.權(quán)利要求12的藥物組合物，其中所述基質(zhì)包含含所述表達(dá)盒的病毒載體。
15.權(quán)利要求14的藥物組合物，其中所述病毒載體為腺病毒載體。
16.權(quán)利要求15的藥物組合物，其中所述腺病毒載體為復(fù)制缺陷型腺病毒載體。
17.權(quán)利要求12的藥物組合物，其中所述基質(zhì)包括膠原、金屬、羥基磷灰石、生物玻璃、鋁酸鹽、生物陶瓷材料、純化的蛋白或胞外基質(zhì)組合物。
18.權(quán)利要求12的藥物組合物，其中所述基質(zhì)為膠原基質(zhì)。
全文摘要
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公開(kāi)日2007年1月31日 申請(qǐng)日期2004年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月24日
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