專利名稱：脫氣方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)油或多不飽和脂肪酸(PUFA)的方法。所述方法包括使包含(此后)從其得到油或PUFA的細胞的含水液體脫氣，(然后)由此得到油或PUFA。脫氣之后，可對細胞進行巴氏滅菌。然后可從所述細胞中提取、純化或分離油或PUFA。
背景技術(shù)：
天然發(fā)現(xiàn)了多不飽和脂肪酸(或PUFA)，而且不同的單細胞生物(藻類、真菌等)產(chǎn)生許多不同的PUFA。一種特別重要的PUFA是花生四烯酸(ARA)，其為眾多長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)中的一種?；瘜W(xué)上，花生四烯酸是順式-5，8，11，14-二十碳四烯酸(20:4)并屬于LC-PUFA的(n-6)族。
花生四烯酸是大量生物活性化合物的重要前體，這些生物活性化合物統(tǒng)稱為類二十碳烷，包括前列腺素、血栓素和白三稀?；ㄉ南┧徇€是人類乳汁中脂類部分的組分之一，其被認為是嬰兒神經(jīng)系統(tǒng)最佳發(fā)育所必須的?；ㄉ南┧峋哂袕V泛的應(yīng)用，包括用于嬰兒配方、食品和動物飼料。
WO-A-97/37032提及了由經(jīng)巴氏滅菌的生物質(zhì)來制備微生物含PUFA的油。然而，該文獻中并未公開在巴氏滅菌前進行脫氣。
2003年12月31日出版的WO-A-04/001021對巴氏滅菌條件進行了更詳細的描述。
包括加熱生物質(zhì)或微生物細胞的方法是已知的。WO-A-97/37032描述了可在以油的形式從其提取PUFA之前將微生物細胞進行巴氏滅菌。然而，本申請人已發(fā)現(xiàn)，包含脫氣工藝可改善可從細胞提取的油的品質(zhì)。更具體地，所得的油可較少地氧化或被氧化，并且可具有更低的過氧化值(POV)和/或茴香胺值(AnV)。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)油或多不飽和脂肪酸(PUFA)的改進方法。所作的改進是優(yōu)選在巴氏滅菌之前采用脫氣處理。
因此，本發(fā)明的第一方面涉及產(chǎn)油或多不飽和脂肪酸(PUFA)的方法，所述方法包括a)對包含細胞的含水液體進行脫氣；和b)從所述細胞中獲取油或PUFA。
含水液體優(yōu)選為培養(yǎng)液或培養(yǎng)基，例如發(fā)酵培養(yǎng)液或由發(fā)酵得到的培養(yǎng)液。它可以是在發(fā)酵過程中取出或移出的液體，但是優(yōu)選發(fā)酵結(jié)束后的培養(yǎng)液。細胞優(yōu)選為微生物細胞。在脫氣之前、期間和/或之后，微生物細胞可以是活的。
含水液體的脫氣優(yōu)選使空氣得以去除，例如夾帶的、裹入的、未溶解的和/或已溶解的空氣。因而本發(fā)明可以是或包括除氣。它可以去除氣體(例如氣泡)。優(yōu)選地，本方法將去除氧氣，例如溶解的氧氣(例如以被裹入的形式，或作為氣泡)。本文中，“溶解的”是指存在于或溶解于含水液體的氣體(例如空氣或氧氣)(而不是細胞內(nèi)部的任何氣體)。
脫氣工藝還可導(dǎo)致例如二氧化碳的其它氣體被從含水液體中去除。
由于脫氣可優(yōu)選地去除至少部分溶解的和/或一些未溶解的氧氣，因此可減少氧化。這意味著PUFA和/或油可更少地被氧化，因而具有更好的品質(zhì)。
并不容易看出去除氧氣帶來的優(yōu)越性，原因在于微生物細胞需要氧氣來得以存活和生長。事實上，在包括本發(fā)明優(yōu)選的工藝的很多發(fā)酵工藝中，空氣被供給至微生物細胞，例如供給(例如鼓泡)至含水液體或培養(yǎng)基。細胞將分裂并生長，并且優(yōu)選在分裂和生長過程中還生物合成一種或更多種PUFA。于是，在發(fā)酵過程中停止氧氣或空氣供給來進行脫氣的想法并不一定被認為是有利的策略，因為這會導(dǎo)致細胞死亡，或者至少減弱其生產(chǎn)PUFA以及其它有價值的化合物的能力。
對于食品(例如牛奶和橙汁)的脫氣是已知的，在某些工業(yè)工藝(例如造紙)中的脫氣也是已知的。然而，應(yīng)當(dāng)認識到這些工藝與微生物有機體的發(fā)酵(特別是為了生產(chǎn)待提取的化合物)屬于不同的領(lǐng)域，而且那些(現(xiàn)有技術(shù))體系中并無(活)細胞。在某些現(xiàn)有技術(shù)的工藝中，進行脫氣是為了減少細菌生長，而在本發(fā)明中，為了生產(chǎn)PUFA，微生物細胞的生長和存活(包括細菌細胞)是需要氧氣的發(fā)酵工藝的重要因素。
存在許多種進行脫氣的方法，包括a)施加真空(或減壓)；b)機械脫氣/除氣(攪拌、振動、例如在離心機或旋風(fēng)器中使用例如重力的加速力)；c)改變粘度(通過用水或其它液體稀釋，或通過改變溫度)；d)改變發(fā)酵條件，例如在發(fā)酵時減小空氣提升、空氣噴射或氧氣或空氣供給，或降低攪拌速率；e)改變pH，例如通過降低pH或進行酸化(例如通過使用二氧化碳，其在溶于液體時形成碳酸)；f)過濾，例如通過過濾器、毛細管或膜，例如(優(yōu)選惰性的)聚合物，例如PTFE；g)氣體置換，用惰性氣體(例如氮氣)或稀有氣體(例如氦氣)；h)化學(xué)脫氣，例如使用除氧劑(例如亞硫酸鈉或肼)；i)時間，例如靜置含水液體，或使其處于可使氣體(例如氧氣或空氣)從液體中擴散出來的條件下；和/或j)上述方法的一種或更多種的組合。
現(xiàn)分別對以上九種脫氣方法進行詳細討論。
1.真空(或減壓)可在含水液體表面上方施加真空。但是，真正的真空并不總是必須的，作為替代手段，優(yōu)選的方法包括減小含水液體(例如當(dāng)其存在于例如發(fā)酵罐的容器中)表面上方的壓力。優(yōu)選地，含水液體上方的壓力小于大氣壓或室壓，或至少與發(fā)酵罐內(nèi)的壓力(或發(fā)酵時的壓力)相比壓力有所降低。因此，當(dāng)脫氣開始時，例如發(fā)酵完成后，存在壓力的下降。
真空或減壓可施加于與發(fā)生發(fā)酵的容器(例如發(fā)酵罐)不同的獨立容器中。因此，液體可被輸送至真空工作站或獨立容器，在其中施加真空或可存在真空。在本文中，當(dāng)提及施加“真空”作為脫氣方法之一時，應(yīng)當(dāng)將此理解為對含水液體施加減壓。這是因為施加完全真空并非絕對必要。
優(yōu)選地，(在真空脫氣階段中)施加的壓力不大于800mbara(毫巴絕對壓力)，優(yōu)選不大于600mbara，最優(yōu)選不大于400mbara。在某些情況下，使用適當(dāng)?shù)难b置，壓力優(yōu)選不大于200或100mbara。優(yōu)選地，減壓為50-600mbara，例如100-500mbara，最優(yōu)選200-450mbara。
在一種優(yōu)選的實施方式中，含水溶液(例如在發(fā)酵之后)被輸送至具有減壓(換言之，壓力小于發(fā)酵罐(或含水液體從其中開始輸送的容器)的壓力)的容器中。含水液體在這兩個容器(例如從發(fā)酵罐至減壓容器)之間的輸送可以借助于壓差或由壓差引起。因此可存在輸送壓力，其表示含水液體在從一個容器移動至另一個容器的過程中經(jīng)受的壓力。此輸送壓力優(yōu)選不大于0.7bar，例如0.6bar，優(yōu)選不大于0.5bar。輸送壓力可在0.7與0.3bar之間，例如0.6-0.4bar。
減壓容器可具有增大含水液體表面積的裝置，以幫助脫氣。因此，含水液體可呈現(xiàn)為膜的形式，例如薄膜?？赏ㄟ^例如噴嘴(例如傘狀噴嘴)或傘形脫氣器的機械裝置來使含水液體形成膜(例如薄膜)。因此，可在施加減壓的同時將含水溶液壓在曲面上。通過增大含水溶液的表面積(例如通過形成膜或噴霧)，可促進脫氣過程，并可使除氣更加有效。減壓容器(包括其上施加水液體的曲面或噴嘴)內(nèi)的含水溶液的水平可為全部充滿的十分之一至十分之二。然后可將已脫氣的含水液體輸送至巴氏滅菌或加熱容器或工作站。
2.機械脫氣通常在發(fā)酵期間，氧氣或(更通常地)空氣被供給至含水液體(培養(yǎng)基或發(fā)酵培養(yǎng)液)。這可使微生物細胞生長和分裂并生物合成PUFA。
在發(fā)酵過程中，可攪拌含水液體。為了脫氣，攪拌量(或攪拌速率)可降低或減慢或完全停止。較慢的攪拌更不易造成氣穴現(xiàn)象(例如在攪拌槳或移動表面上或附近)并且更不易(在含水溶液中)生成氣泡。
停止攪拌，或降低攪拌程度，可使含水液體中的氣泡聚結(jié)，從而朝著含水液體表面上升。在降低攪拌時，攪拌速率可降至不超過發(fā)酵時的二分之一、三分之一或甚至四分之一。例如，如果攪拌速率為80rpm，則為了脫氣可將攪拌速率降至不超過40rpm。
機械脫氣還可包括減少供給至含水液體(發(fā)酵培養(yǎng)液，通過充氣)的空氣或氧氣的量?？蓽p慢空氣或氧氣的添加速率，或完全停止。在脫氣時，空氣(或氧氣)的供給速率可降至不超過(例如發(fā)酵時的速率)的二分之一、三分之一或甚至四分之一。因此，可在發(fā)酵結(jié)束時停止或中止對液體進行充氣(例如，持續(xù)5、2或1小時)。
通常在發(fā)酵時將空氣(或氧氣)供給至含水液體，同時其處在發(fā)酵容器(或發(fā)酵罐)內(nèi)。氣體可被鼓泡至含水溶液中，這可通過噴射器完成。脫氣可包括減小通過噴射器的空氣或氧氣供給速率。
還可通過在含水液體通過或進入(靜態(tài))振動容器(例如管)處進行振動來實現(xiàn)脫氣。
含水液體可通過使用除氣泵來脫氣。含水液體可受到加速力，例如在旋風(fēng)器中。因此，可對該液體施加離心力，這有助于脫氣。旋風(fēng)器可使含水液體在容器中快速旋轉(zhuǎn)，使其受到離心力，從而可使從液體中逸出的氣體上升，并從旋風(fēng)器頂部將其取出或移出，而同時已脫氣的液體可以以反方向(例如向下)流動。
可使用機械真空脫氣器來使含水液體脫氣。這可以是施加真空(或減壓)的泵?？沙惺軠p壓或可生成真空的改進的(例如離心的)泵是可購得的。優(yōu)選地，真空泵具有旋轉(zhuǎn)室，在其中氣泡可被從含水液體移出，例如在離心力的作用下。
其它類型的裝置包括除氣泵。這可以對溶解氣體的液體進行脫氣。該泵可具有(例如，聯(lián)鎖的)真空泵。它可在沒有任何化學(xué)添加劑的條件下進行除氣。這樣的系統(tǒng)能夠脫氣至0.5ppm或更低的水平。其流率可為25升/分鐘或更小。合適的除氣泵可從日本的Yokota制造公司獲得。
3.調(diào)節(jié)粘度可通過加熱含水液體來增加粘度。此加熱也可導(dǎo)致脫氣。
粘度下降可使含水液體中的氣體更有效地移至含水液體表面。因此，減小粘度的方法可促進脫氣過程。這可通過添加例如水的另一種溶液(其本身是脫氣的，或與含水溶液相比空氣/氧氣含量較少)來實現(xiàn)，并因此本方法可包括稀釋。由于存在細胞和用于細胞同化的碳源和/或氮源，含水液體的粘度通常相當(dāng)大。
減小粘度的另一種方法是加熱含水液體。溫度的升高降低了氧氣在液體中的溶解度。
4.調(diào)節(jié)pH可制備酸性更大的含水溶液。這可使空氣/氧氣在其中的溶解度下降。
應(yīng)當(dāng)認識到，含水溶液包含可合成有用化合物的活細胞。細胞“呼吸”是指它們消耗氧氣并釋放二氧化碳。二氧化碳可溶于含水液體，因而生成碳酸。通過降低pH，可使含水溶液酸性更高，從而降低二氧化碳(或氧氣)在其中的溶解度。
5.過濾含水液體可通過能夠去除小氣泡(例如空氣小氣泡)的過濾器或膜。這可在較小規(guī)模上進行。過濾器或膜優(yōu)選包含惰性材料，例如聚合物。該材料(例如聚合物)可包含鹵化烯烴，例如PTFE。
因而可使含水液體通過(例如，小的，或較細的)管或毛細管。其可在壁面包含聚合物或具有聚合物的涂層，聚合物例如是PTFE。管可具有洞或孔，溶解的氣體或氣泡和從其中通過。含水液體可在壓力下通過這些管或毛細管。
6.氣體置換這包括置換或替換含水液體中的氧氣或空氣(溶解的或以其他方式存在的)?？捎枚喾N氣體替換空氣或氧氣，只要，優(yōu)選地，將溶解的氧氣擠出溶液，然后氧氣可離開含水液體。優(yōu)選的是惰性氣體(例如氮氣)或稀有氣體(例如氦氣)。氣體可被供至含水液體的上方、頂部(例如發(fā)酵罐的頂部空間)。例如，它可以被添加或供給至例如容器(例如發(fā)酵罐)中的液體上方的頂部空間?；蛘撸衫缤ㄟ^鼓泡或使用噴射器來將氣體可供給至含水液體。優(yōu)選的氣體是氮氣，但是可使用含氮氣的氣體(但氧氣量減少，例如小于20％或小于10％或15％，使其低于大氣中的水平)。
優(yōu)選的工藝是在發(fā)酵結(jié)束之前減少供給至含水液體的空氣(或氧氣)的量或停止供給。首先，例如，在發(fā)酵結(jié)束前至少一個或兩個小時，無空氣例如通過噴射器供給。代替通過噴射器供給空氣，可供給除空氣或氧氣外的氣體，例如氧氣含量低的氣體(例如氮氣)。因而，優(yōu)選地，可在發(fā)酵結(jié)束前用一個或兩個小時將氮氣供給至含水液體。這可在含水液體上方形成惰性的或氧氣含量降低(例如，富含氮氣)的氣氛，例如比大氣的氮氣含量高的氣氛。含水液體上方的氮氣壓力可為0.4-0.8bar，例如約0.6bar。
7.化學(xué)脫氣這可通過使用可有利地與空氣反應(yīng)或更重要地與空氣中的氧氣反應(yīng)的物質(zhì)或化學(xué)制劑來實現(xiàn)。該物質(zhì)可為除氧劑?？墒勾宋镔|(zhì)與含水液體接觸?？衫缭诤后w處于容器(例如發(fā)酵罐)中時將化學(xué)制劑添加至含水液體。合適的氧氣反應(yīng)材料(包括除氧劑)在本領(lǐng)域中是公知的，包括堿金屬(例如鈉)亞硫酸鹽和含肼的化合物。如果PUFA或油將用于食品，則可采用其它(非化學(xué))脫氣方法。
8.時間在靜置時，含水液體會緩慢地釋放出其中溶解的氣體，例如氧氣和空氣。溶解的氣體可從含水液體中擴散出來。因此，氣體可隨時間逐漸地從溶液中移出。
測定空氣/氧氣含量這可通過本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來完成。例如，可使用EGT(夾帶氣體測試器)?？赏ㄟ^在線技術(shù)在含水液體(實際上是微生物細胞懸浮液)中測量空氣的量。
可通過在測量單元中壓縮樣品對夾帶的氣體(氣泡)進行測量。然后通過Boyle法則(pV為常數(shù))來計算夾帶氣體的體積分數(shù)。另一方面，可通過使樣品膨脹來測量可被釋放的溶解氣體。這模擬了壓力的驟降。由于測量單元中的壓力下降，氣體的溶解度降低，從而被釋放。懸浮液的體積因而增大。此操作可以是全自動的和/或可包括在線氣體分析儀(在系統(tǒng)中的適當(dāng)位置，合適在脫氣后)。
脫氣可導(dǎo)致O2含量(在含水液體中)小于20或15ppm，例如2或5至15或20ppm。(例如溶解的)氧氣的濃度可優(yōu)選小于10ppm，例如小于5ppm，最優(yōu)選小于2ppm。
優(yōu)選地，發(fā)生脫氣以使(溶解的)氧氣的濃度小于0.03cc/l(44ppb)，優(yōu)選小于0.005cc/l(7ppb)。
有利地，可對(根據(jù)本發(fā)明，通過對含細胞的含水液體進行脫氣而得到的)脫氣含水液體進行增壓和/或升溫。可在例如對細胞進行加熱和/或巴氏滅菌時采用增加的壓力和升高的溫度。
在一種優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法包括使脫氣含水液體經(jīng)受至少1bara，優(yōu)選至少1.5bara，優(yōu)選至少2bara，優(yōu)選至少2bara，優(yōu)選至少5bara的壓力。對于壓力并無具體上限。例如可使脫氣含水液體經(jīng)受的壓力低于40bar，例如低于20bar。
在一種優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法包括使脫氣含水液體經(jīng)受至少60℃，優(yōu)選至少80℃，優(yōu)選至少90℃，優(yōu)選至少100℃，優(yōu)選至少110℃的溫度。對于溫度并無具體上限。例如可使脫氣含水液體經(jīng)受的溫度低于150℃。
優(yōu)選地，可經(jīng)歷升溫和/或增壓的脫水含水液體具有本文公開的優(yōu)選的O2含量和/或優(yōu)選的(溶解的)氧氣的濃度巴氏滅菌工藝巴氏滅菌通常在脫氣和/或發(fā)酵完成后發(fā)生。在一種優(yōu)選的實施方式中，巴氏滅菌會結(jié)束發(fā)酵，因為巴氏滅菌時的加熱會殺死細胞。因此，可對發(fā)酵培養(yǎng)液(或在液體(含水)介質(zhì)中的細胞)進行巴氏滅菌，但是可對由培養(yǎng)液得到的微生物生物質(zhì)進行巴氏滅菌。在前一種情況下，巴氏滅菌可在微生物細胞仍處于發(fā)酵罐內(nèi)時發(fā)生。巴氏滅菌優(yōu)選在對微生物細胞進行任何進一步處理(例如粒化(例如通過擠壓)、粉碎或捏合)之前發(fā)生。
發(fā)酵完成后，發(fā)酵培養(yǎng)液可被過濾或進行其它處理以去除水或含水液體。去除水之后，可得到生物質(zhì)“餅”。如果還未發(fā)生巴氏滅菌，則可對脫水細胞(生物質(zhì)餅)進行巴氏滅菌。
可通過直接或間接加熱(細胞)來進行巴氏滅菌?？赏ㄟ^將蒸汽通入發(fā)酵罐來進行直接加熱。間接方法可使用通過換熱器的介質(zhì)，透過發(fā)酵罐的壁，或使用加熱線圈，或外部換熱器(例如板式換熱器)。
通常，巴氏滅菌在已發(fā)生發(fā)酵的發(fā)酵容器中進行。然而，對某些生物體(例如細菌)，通常優(yōu)選首先從容器中移出細胞，然后再進行巴氏滅菌。巴氏滅菌可在對生物體進行其它處理(例如干燥或?；?前發(fā)生。
巴氏滅菌通常會殺死大多數(shù)(如果不是全部的話)微生物體。巴氏滅菌后，可能至少95％、96％或甚至98％的微生物體已被殺死，即是說，它們不是活的。
可在任何合適的溫度下對細胞進行加熱或巴氏滅菌，優(yōu)選溫度至少為60℃，優(yōu)選至少80℃，優(yōu)選至少90℃，優(yōu)選至少100℃，優(yōu)選至少110℃。對于溫度并無具體上限。巴氏滅菌可例如在低于150℃的溫度下進行。優(yōu)選的巴氏滅菌方法在WO 97/37032和WO-A-04/001021中有所描述。
提取PUFA本發(fā)明可包括從(例如已巴氏滅菌的)細胞提取和/或分離PUFA。優(yōu)選地，這是在發(fā)酵之后并且(可選地)還在巴氏滅菌之后。
提取可首先從添加堿土金屬鹵化物(例如氯化鈣)開始。(然后)可將細胞進行過濾、洗滌和/或擠壓，從而形成濕餅。
然后可對微生物細胞進行擠出，如果需要，對得到的擠出顆?；驍D出物進行干燥。然后得到的干燥顆?；蚋稍锷镔|(zhì)可用于提取一種PUFA，優(yōu)選含一種或更多種PUFA的油。優(yōu)選的用于從微生物細胞制備含PUFA的油的提取方法在國際專利申請No.PCT/EP99/01446(WO 97/36996)、No.PCT/EP97/01448(WO 97/37032)和No.PCT/EP01/08903(WO02/10423)中有描述。
多不飽和脂肪酸(PUFA)和微生物油PUFA可以是單一的PUFA也可以是兩種或更多種不同的PUFA。所述或每種PUFA可以是n-3或n-6族的。其優(yōu)選為C18、C20或C22PUFA。其可為具有至少18個碳原子和/或至少3或4個雙鍵的PUFA。PUFA可以以游離脂肪酸、鹽的形式，作為脂肪酸酯(例如甲酯或乙酯)，作為磷脂和/或以甘油單酯、甘油二酯或甘油三酯的形式來提供。
合適的(n-3和n-6)PUFA包括二十二碳六烯酸(DHA，22:6 Ω3)，合適地來源于藻類或真菌，例如(溝鞭藻，dinoflagellate)寇氏隱甲藻(Crypthecodinium)或(真菌)破囊壺菌(Thraustochytrium)；γ-亞麻酸(GLA，18:3Ω6)；α-亞麻酸(ALA，18:3Ω3)；共軛亞麻酸(十八碳二烯酸，CLA)；二高-γ-亞麻酸(DGLA，20:3Ω6)；花生四烯酸(ARA，20:4Ω6)；和二十碳五烯酸(EPA，20:5Ω3)。
優(yōu)選的PUFA包括花生四烯酸(ARA)、二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)和/或γ-亞麻酸(GLA)。特別優(yōu)選的是ARA。
在本發(fā)明的方法中可通過經(jīng)巴氏滅菌的細胞(例如微生物細胞)來生產(chǎn)PUFA。這可以是細菌、藻類、真菌或酵母菌細胞。真菌是優(yōu)選的，優(yōu)選屬于毛霉(Mucorales)目，例如被孢霉屬(Mortierella)、須霉屬(Phycomyces)、布拉霉屬(Blakeslea)、曲霉屬(Aspergillus)、破囊壺菌屬(Thraustochytrium)、腐霉屬(Pythium)或蟲霉屬(Entomphthora)。ARA優(yōu)選來源于高山被孢霉(Mortierella alpina)、三孢布拉霉(Blakeslea trispora)、土曲霉(Aspergillus terrus)或Pythiuminsidiosum。藻類可以是溝鞭藻和/或包括Porphyridium、Nitszchia或Crypthecodinium(例如Crypthecodinium cohnii)。酵母菌包括畢赤氏酵母(Pichia)屬或糖酵母(Saccharomyces)屬，例如Pichia ciferii。細菌可以是丙酸桿菌(Propionibacterium)屬。微生物油可以是液體(在室溫下)。
優(yōu)選大多數(shù)PUFA是以甘油三酯的形式。因此，優(yōu)選至少50％、例如至少60％或最優(yōu)選至少70％的PUFA是以甘油三酯的形式。但是，甘油三酯的量可以更高，例如是油的至少85％，優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少93％或95％。這些甘油三酯中，優(yōu)選至少40％、例如至少50％、最優(yōu)選至少60％的PUFA存在于甘油的a位(位于甘油三酯骨架)，也稱為1位或3位。優(yōu)選至少20％、例如至少30％、最優(yōu)選至少40％的PUFA是在b(2)位上。
微生物油可包含至少10％、35％、40％或45％或更多的所需PUFA(例如花生四烯酸)。其甘油三酯含量可為至少90％，例如92-94％。通常，微生物油的二十碳五烯酸(EPA)含量小于5％，優(yōu)選小于1％，更優(yōu)選小于0.5％。油中的C20、C20.3、C22.0和/或C24.0脂肪酸的每一種的含量可小于5％、小于2％、小于1％。游離脂肪酸(FFA)的含量可不大于1.0、0.4、0.2或0.1。油中可含很少或不含GLA和/或DGLA。
微生物油可以是粗制油。已通過使用例如有機液體(例如己烷或異丙醇)的溶劑將其從細胞中提取出來。
PUFA提取工藝然后可從(已巴氏滅菌的)微生物細胞中將PUFA(或微生物油，通常包含PUFA)提取出來。優(yōu)選地，從含細胞的(例如干燥的)顆粒(例如擠出物)中將其提取出來。提取可利用溶劑來進行。優(yōu)選使用非極性溶劑，例如C1-8、優(yōu)選C2-6烷烴，例如己烷。
優(yōu)選地，使溶劑在干燥顆粒上滲透。WO-A-97/37032中描述了合適的微生物粒化和擠出技術(shù)以及隨后對含PUFA的微生物油的提取。
利用溶劑可以得到含PUFA的粗制油。此油可以不進行進一步處理而以所述狀態(tài)使用，或可使其經(jīng)歷一個或更多個精制步驟。然而，粗制油通常含有溶劑，例如用于提取油的溶劑(例如己烷，或例如異丙醇的醇)，或者粗制油并未進行后續(xù)精制步驟中的一個(或優(yōu)選全部)。合適的精制方法在國際專利申請No.PCT/EP01/08902(此文獻以及所有其它文獻的內(nèi)容通過引用被包含在本文中)中有所描述。例如，可使油經(jīng)歷一個或更多個精制步驟，可包括酸處理或脫膠、堿處理或游離脂肪酸去除、漂白或色素去除、過濾、冬化(或冷卻，例如去除飽和甘油三酯)、除臭(或去除游離脂肪酸)和/或精加工(或去除不溶于油的物質(zhì))。所有這些精制步驟在PCT/EP01/08902中有更詳細的描述，并經(jīng)過必要的調(diào)整可用于本申請所述的步驟。
所得的油特別具有營養(yǎng)價值，可被添加至(人類)食品或(動物)飼料中。例子包括牛奶、嬰兒配方、健康飲料、面包以及動物飼料。
細胞細胞可以是任何可從其中得到油或PUFA的細胞。優(yōu)選地，細胞是微生物細胞。用于本發(fā)明的微生物細胞(或微生物體)可以是在前面所述的特別是與PUFA和微生物油相關(guān)的部分中所述的那些微生物細胞。它們可以包含或能夠生成PUFA或微生物油，并且可合適地將PUFA油從細胞中提取或分離。它們可以是絲狀的，如真菌或細菌，或單細胞，如酵母菌、藻類和細菌。細胞可包含微生物體，該微生物體可為酵母菌、真菌、細菌或藻類。優(yōu)選的真菌屬于毛霉目，例如真菌可以是被孢霉屬、須霉屬、布拉霉屬或曲霉屬。優(yōu)選的真菌是高山被孢霉種、三孢布拉霉種和土曲霉種。酵母菌優(yōu)選的是畢赤氏酵母屬(例如Pichia ciferii種)或糖酵母屬。細菌可以是丙酸桿菌屬。如果細胞來源于藻類，則藻類優(yōu)選溝鞭藻和/或?qū)儆贑rypthecodinium或Daniella種。優(yōu)選的藻類是Crypthecodinium cohnii種或Daniella salina種。
過氧化值(POV)優(yōu)選地，(微生物)油的POV為3至8或12。然而，用本發(fā)明的方法可得到較低的POV值，這些值可小于10.0或小于8.0?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)來測量POV，例如根據(jù)AOCS Cd-8-53。(POV的)單位通常為meq/kg。
茴香胺值(AnV)此值可給出醛含量的量度。優(yōu)選地，(微生物)油的茴香胺值為5、6、7或10至15、20或25。合適地，AnV不大于20，例如不大于15。還可以不大于10甚至不大于5或2。(優(yōu)選實驗中的)AnV值為5-15，最優(yōu)選7-12。優(yōu)選地，AnV為2或5至12或15?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)來測量AnV，例如根據(jù)AOCS Cd-18-90。
油和PUFA的用途本發(fā)明的另一方面涉及包含油和(如果合適)或更多(另外的)物質(zhì)的組合物。所述組合物可以是動物或人類的食品和/或食品添加劑。如果需要，通常通過對從微生物得到的油進行精制或純化，可使該油適于人類食用。
此組合物可以是嬰兒配方或(人類)食品。這里，可對配方的組合物進行調(diào)節(jié)以使其具有與正常母乳接近的脂類或PUFA含量。這可以包括將本發(fā)明的微生物油與其它油混合以獲得適當(dāng)?shù)慕M合物。
此組合物可以是動物或水生動物的飼料組合物或添加劑。這樣的飼料和添加劑可供給任何家畜，特別是羊、牛和家禽。此外，飼料或添加劑可供給養(yǎng)殖的水生生物，例如魚和貝類。因此，針對這些動物，本組合物可包含一種或更多種飼料物質(zhì)或成分。
本發(fā)明的油可以是粗制油或精制油。它可作為油而直接出售，并且裝于適當(dāng)?shù)陌b中，包裝通常為內(nèi)部涂布環(huán)氧酚醛漆并充以氮氣的鋁瓶。油可含有一種或更多種抗氧化劑(例如，生育酚、維生素E、棕櫚酸酯)，其中每種抗氧化劑的濃度例如為50-800ppm，例如100-700ppm。
合適的組合物可包括(例如口服的)藥物或獸藥組合物，或化妝品組合物。油可以直接服用，或可將油封裝在例如外殼中，因而形成膠囊。外殼或膠囊殼包含明膠和/或甘油。組合物可包含其它成分，例如調(diào)味劑(例如檸檬或萊檬味)或藥物或獸藥可接受的載體或賦形劑。
消泡劑脫氣時可在含水液體中形成氣泡。這可在除氣過程中發(fā)生，因為氣體從溶液中出來并(作為氣泡)朝著含水液體的表面上升。顯然，這可在含水液體頂部形成泡沫。如果不需要泡沫，則可通過向含水液體添加一種或更多種消泡劑來減少或防止泡沫形成。這樣的消泡劑在本領(lǐng)域中是已知的，因此可使用適當(dāng)?shù)南輨?，例如磷酸三丁酯。消泡劑?yōu)選具有疏水性，并可不溶于水。其可包含例如由極性基團改性的非極性烴鏈。優(yōu)選的消泡劑包括硅油、石蠟、烷氧基化脂肪醇和/或聚二醇。
優(yōu)選的化學(xué)脫氣劑包括脂族醇、脂肪酸酯、乙氧基化脂肪酸、脂肪酸聚醚和/或脂肪醇。
特別是如果微生物細胞將被加熱(例如需要將其殺死或進行巴氏滅菌)，脫氣可具有其它優(yōu)點。在加熱或巴氏滅菌時，可使細胞或含水液體(或包含適當(dāng)階段的細胞的任意組合物)經(jīng)受高溫和/或高壓。這會使氣體突然地或猛烈地離開含水液體，例如可在生物細胞輸送過程中引起泵的氣蝕。這是不期望的，因其可導(dǎo)致細胞壁破裂，即細胞破碎。因此，前面的脫氣步驟可減少高溫或高壓時(例如在加熱或巴氏滅菌時)可能引起的問題。
設(shè)備(例如工業(yè)過程設(shè)備)本發(fā)明的第二方面涉及適用于進行第一方面的方法的設(shè)備。因此，第二方面可包括(a)培養(yǎng)(或發(fā)酵)微生物細胞的裝置(例如發(fā)酵罐)，可選地連接至；(b)對包含微生物細胞的含水液體進行脫氣的裝置；和(c)可選的，從微生物細胞中得到(成品)油的裝置。
在一種實施方式中，(b)中的脫氣可在細胞(仍)在發(fā)酵罐內(nèi)時發(fā)生。在另一種實施方式中，脫氣裝置可與(b)中的脫氣裝置分離(雖然可選地與其連接)。因此，細胞和培養(yǎng)基(例如培養(yǎng)液)可(直接地)通入或輸送至(b)中的脫氣裝置。還可以有用于巴氏滅菌的裝置。在(b)中的脫氣之后，脫氣的液體可輸送至或通入巴氏滅菌裝置或液體(和細胞)在其中進行巴氏滅菌的容器。每種裝置以特定的順序定位，以第一方面的方法的階段的順序排列。
在優(yōu)選的系統(tǒng)中，含水液體可從發(fā)酵罐輸送至(合適的管式)加熱系統(tǒng)。含水液體可被(預(yù))加熱，這可引起其內(nèi)部脫氣。液體可被加熱至40-80℃，例如50-70℃，例如55-65℃。因而加熱(或預(yù)加熱階段)可成為脫氣系統(tǒng)的一部分?？赏ㄟ^添加水(稀釋技術(shù))和/或蒸汽(氣體替換技術(shù))來進一步促進脫氣。上述之一或兩者可在(預(yù))加熱之前發(fā)生。
在例如預(yù)加熱之后，可使含水液體經(jīng)歷進一步脫氣階段，例如真空或減壓。然后可對液體進行巴氏滅菌。
本發(fā)明的一個方面的優(yōu)選特點和特征經(jīng)必要修正后可適用于另一個方面。
現(xiàn)在通過參考以下實施例來描述本發(fā)明，這些實施例僅作為示例而無意于限制本發(fā)明的范圍。
對比實施例1和實施例2-4(發(fā)酵罐內(nèi)的脫氣)在一些包括對真菌生物質(zhì)(高山被孢霉)進行巴氏滅菌的實驗中，出現(xiàn)了一定的氧化?？赡艿慕忉屖前l(fā)酵培養(yǎng)液中空氣的存在導(dǎo)致了化學(xué)氧化，特別是在高溫下。雖然微生物細胞需要空氣來存活和生物合成PUFA，但還是決定在巴氏滅菌(熱休克(heat shock)處理)之前對發(fā)酵培養(yǎng)液進行脫氣。
用現(xiàn)有技術(shù)已描述的方法對真菌生物質(zhì)(高山被孢霉)進行發(fā)酵。發(fā)酵以與WO 97/36996所述類似的方式進行發(fā)酵(見實施例)。發(fā)酵持續(xù)約150-200小時。將培養(yǎng)液從發(fā)酵罐經(jīng)由小容器(容量350升)輸送至巴氏滅菌裝置。
對發(fā)酵培養(yǎng)液進行大量發(fā)酵時間為150-200小時的相似的發(fā)酵試驗。
在第一組實驗中，使用各種脫氣方法直接對仍在發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)液進行試驗，包括在發(fā)酵結(jié)束前2小時內(nèi)停止通過噴射器將空氣鼓泡進入培養(yǎng)液(實施例2)以及用氮氣置換發(fā)酵培養(yǎng)液上方的頂部空間中的空氣(實施例3和4)。對于對比實施例1，不進行脫氣。
對由熱休克試驗得到的干燥生物質(zhì)進行TPC(總板數(shù))分析。TPC結(jié)果并未偏離對在標(biāo)準(zhǔn)條件下進行巴氏滅菌的培養(yǎng)液所測量的結(jié)果。培養(yǎng)液(在脫氣和巴氏滅菌之后)被用于分離含花生四烯酸(ARA)的微生物/單細胞油。對花生四烯酸粗制油進行回收和分析?；厥障到y(tǒng)包括(在對培養(yǎng)液進行脫氣和巴氏滅菌之后)添加氯化鈣、過濾/洗滌和擠壓，從而形成濕餅。然后擠出此濕餅以形成擠出物，對其進行干燥，將得到的干燥生物質(zhì)進行提取。
近似地，1升培養(yǎng)液包含約45-55克干燥生物質(zhì)，以及約30-35％的油。
使用以下的實驗室規(guī)模的回收方法。用實驗室玻璃容器添加氯化鈣(氯化鈣薄片和水)。用CaCl2·2H2O配制25wt％的氯化鈣溶液。將24克該溶液添加至1升已巴氏滅菌的培養(yǎng)液中，并充分混合。
用過濾來模擬膜壓濾機，使用具有Sefar Fyltis AM 25116濾布的1升的“賽氏”過濾器。在0.5-1bar的氮氣下過濾1升的培養(yǎng)液。然后降低壓力并添加0.6倍培養(yǎng)液體積的洗滌水，在添加水時不擾動濾餅。在0.5-1bar下洗滌濾餅，然后用1分鐘將濾餅吹干。
然后用采用Pannevis濾布材料的Pannevis實驗室規(guī)模的帶式過濾器進行真空過濾。使用約400-500ml培養(yǎng)液，過濾至壓力為0.45bara(真空度-0.55bar)。然后，添加0.6倍培養(yǎng)液體積的洗滌水，在0.45bara的壓力下洗滌濾餅。然后將濾餅抽干。
然后在板間擠壓生物質(zhì)，直到不再有水被擠出。這通過使用粗棉布來完成。
然后用絞肉(Victoria)擠出機來進行擠出。然后用流化床干燥器(入口溫度為50℃，流率設(shè)定為“5”)對所得顆粒干燥30分鐘。干燥物質(zhì)占91-96％。
然后進行提取，以500ml己烷在環(huán)境溫度下對100克干燥生物質(zhì)提取60分鐘。倒出己烷，并用250ml新鮮的己烷在環(huán)境溫度下洗滌濾餅30分鐘。倒出己烷并添加至先前已提取的己烷中。使用玻璃過濾器通過真空過濾來凈化提取物。
蒸發(fā)包括在60-70℃的水浴溫度、200mbara下，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中用5-10分鐘閃蒸出主體己烷。還可在相同的溫度下，在低于100mbar的壓力下，用5-10分鐘蒸發(fā)剩余的己烷。為了使氧化最小化，用氮氣來對該系統(tǒng)進行減壓。
然后分析得到的含ARA的油的POV和AnV含量，如以下表1所示。
表1

*通過發(fā)酵罐中1.8-2bar的頂部壓力來輸送培養(yǎng)液從表1中的數(shù)據(jù)可看出，培養(yǎng)液中空氣量的減少導(dǎo)致POV和/或AnV的改善?；谶@些結(jié)果，可認為脫氣能夠減少氧化，并改善POV和AnV值。然后進行另一個試驗，采用更大的體積，并使用獨立的脫氣器。
實施例5-14(獨立的脫氣器)安裝永久式脫氣系統(tǒng)，其具有“傘形噴嘴”，工作壓力低于500mbara。通過低剪切泵(monho泵)來將發(fā)酵培養(yǎng)液從發(fā)酵罐輸送至脫氣器。
安裝脫氣系統(tǒng)(在發(fā)酵之后但在巴氏滅菌前)，用APV脫氣系統(tǒng)來模擬傘形脫氣器。發(fā)酵罐與脫氣器相連，并在0.5bar的輸送壓力下輸送培養(yǎng)液。脫氣器連接至真空泵。在通過脫氣器之后，在送去進行使用熱休克處理裝置(也是APV)的巴氏滅菌之前，將生物質(zhì)(通過monho泵)送入存儲罐中。monho泵的流率為10m3/h，脫氣器內(nèi)的壓力為400mbara。
表2列出了用此脫氣裝置進行的試驗的結(jié)果。微生物油的分離和分析如前所述。
表2


權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)油或多不飽和脂肪酸的方法，所述方法包括(a)對包含細胞的含水液體進行脫氣；和(b)從所述細胞獲取所述油或多不飽和脂肪酸。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中所述細胞是微生物細胞。
3.如權(quán)利要求1或2的方法，其中在(a)中的脫氣之后但在階段(b)之前對所述細胞進行加熱或巴氏滅菌。
4.如權(quán)利要求1-3中任何一項的方法，其中所述含水液體是發(fā)酵培養(yǎng)液。
5.如權(quán)利要求1-4中任何一項的方法，所述方法還包括(c)提取、純化或分離所述油或一種或更多種多不飽和脂肪酸。
6.如權(quán)利要求1-5中任何一項的方法，其中脫氣包括a)施加真空(或減壓)；b)機械脫氣/除氣(攪拌、振動、例如在離心機或旋風(fēng)器中使用加速力或重力)；c)改變粘度(通過用水或其它液體稀釋，或通過升高溫度)；d)改變發(fā)酵條件，例如在發(fā)酵時減少空氣提升、空氣噴射或氧氣或空氣供給，或降低攪拌速率；e)改變pH，例如通過降低pH或進行酸化；f)過濾，例如通過使用膜或過濾器，其優(yōu)選包含(惰性)聚合物，例如PTFE；g)氣體置換，用例如氮氣的惰性氣體、例如氦氣的稀有氣體或蒸汽；h)化學(xué)脫氣，例如使用除氧劑，例如亞硫酸鈉或肼；i)時間，在可使氧氣或空氣從所述液體中擴散出來的條件下靜置所述含水液體；或所述(a)至(i)的方法中的一種或更多種的組合。
7.如權(quán)利要求1-6中任何一項的方法，其中所述脫氣是通過減少攪拌和/或氣體置換進行的。
8.如權(quán)利要求7的方法，其中使用不含氧氣或所含氧氣濃度水平低于大氣的氣體來進行氣體置換。
9.如權(quán)利要求7或8的方法，其中所述氣體是或包含氮氣。
10.如權(quán)利要求1-9中任何一項的方法，其中脫氣包括使所述含水液體經(jīng)受減壓。
11.如權(quán)利要求10的方法，其中所述減壓是不大于800mbara的壓力，優(yōu)選不大于600mbara。
12.如權(quán)利要求10或11的方法，其中使用真空或除氣泵、傘形脫氣器或傘形噴嘴對所述含水液體進行脫氣。
13.如權(quán)利要求1-12中任何一項的方法，其中脫氣導(dǎo)致所述含水液體中的O2含量小于20ppm，優(yōu)選小于10ppm。
14.如權(quán)利要求1-13中任何一項的方法，其中脫氣導(dǎo)致溶解的氧氣的濃度小于10ppm，優(yōu)選小于5ppm，更優(yōu)選小于2ppm。
15.如權(quán)利要求1-14中任何一項的方法，其中所述方法包括使所述已脫氣的含水液體經(jīng)受(i)大于1bara、優(yōu)選大于1.5bara、更優(yōu)選大于2bara的壓力；和/或(ii)大于60℃、優(yōu)選大于80℃、更優(yōu)選大于100℃的溫度。
16.如權(quán)利要求1-15中任何一項的方法，其中在大于80℃、優(yōu)選大于90℃、優(yōu)選大于100℃的溫度下對所述細胞進行加熱或巴氏滅菌。
17.如權(quán)利要求1-16中任何一項的方法，其中所述多不飽和脂肪酸或油包含C18、C20或C22的Ω-3或Ω-6族的多不飽和脂肪酸(可選ARA、EPA、DHA和/或GLA)。
18.如權(quán)利要求1-17中任何一項的方法，其中所述細胞是酵母菌、細菌、真菌或藻類細胞。
19.如權(quán)利要求1-18中任何一項的方法，其中所述油是微生物或單細胞油。
20.如權(quán)利要求1-19中任何一項的方法，其中(b)包括從所述細胞獲取含多不飽和脂肪酸的油，所述油的POV小于12和/或AnV小于20。
21.通過權(quán)利要求1-20中任何一項的方法得到的含多不飽和脂肪酸的油或多不飽和脂肪酸。
22.如權(quán)利要求21的油，其中所述油是微生物或單細胞油。
23.用于從微生物細胞生產(chǎn)油或多不飽和脂肪酸的設(shè)備，包括(a)培養(yǎng)或發(fā)酵微生物細胞的裝置；(b)對包含所述微生物細胞的含水液體進行脫氣的裝置；和(c)可選的，從所述微生物細胞獲取所述油或多不飽和脂肪酸的裝置。
24.如權(quán)利要求23的設(shè)備，其中(a)包括發(fā)酵罐，(b)包括脫氣器，所述脫氣器可選能夠施加減壓，和/或(c)包括均化器和/或離心機。
25.如權(quán)利要求23或24的裝置，其中(b)包括真空或除氣泵、傘形脫氣器或傘形噴嘴。
26.如如權(quán)利要求1-25中任何一項的裝置，其中(b)包括能施加小于800mbara、優(yōu)選小于600mbara的壓力的脫氣器。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種生產(chǎn)油或多不飽和脂肪酸(PUFA)的方法，包括對包含細胞的含水液體進行脫氣，然后從所述細胞獲取油或PUFA?？刹捎枚喾N技術(shù)進行脫氣，包括施加真空(或減壓)；通過減少攪拌或使培養(yǎng)液經(jīng)受離心力的機械脫氣或除氣；降低粘度(通過稀釋或加熱)；在發(fā)酵時減少氧氣或空氣供給或降低攪拌速率；降低pH(為了降低CO
文檔編號C12M1/00GK1902320SQ200480039457
公開日2007年1月24日 申請日期2004年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月30日
發(fā)明者艾伯特·沙普, 迪尼埃爾·韋爾科埃爾簡 申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司