專利名稱：：血液和尿液檢驗(yàn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種新穎的方法，用于對(duì)尿液和血液中是否存在抗微生物藥物殘余進(jìn)行快速探測(cè)。
背景技術(shù)：
：抗微生物藥物不僅僅被應(yīng)用為藥物治療，其還廣泛用作為獸用藥物中的生長(zhǎng)促進(jìn)物質(zhì)。在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中，獸用藥物作為飼料添加劑的合法使用是常見的應(yīng)用。這些飼料添加劑防止動(dòng)物生病，增強(qiáng)其生長(zhǎng)或者增強(qiáng)飼料的效率?；衔锟杀患尤氲絼?dòng)物的飼料或飲用水中。在一些國(guó)家，允許通過(guò)注射例如生長(zhǎng)促進(jìn)物質(zhì)的施予方法，由此增加了人類食物中抗微生物藥物的含量。當(dāng)然，獸用藥物的非法使用也是存在的。食物中抗微生物藥物的存在日益成為消費(fèi)者關(guān)心的問(wèn)題。由抗生素導(dǎo)致的過(guò)敏反應(yīng)和對(duì)人類腸道菌群的影響是公知的。另一個(gè)議題是具有抗性的細(xì)菌的發(fā)展。人們公知，抗生素的濫用(即，不需要藥物處理時(shí)，或不完善的療程中施用)是抗生素抗性發(fā)展的最重要的原因。此外，抗微生物化合物在食物中的存在也導(dǎo)致了具有抗藥性的細(xì)菌的增加。人類病原性微生物由此可以發(fā)展出對(duì)作為飼料添加劑和在人類藥物中使用的抗微生物制劑的抗性。在飼料中使用抗生素作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑的另一缺點(diǎn)在于，抗生素會(huì)對(duì)發(fā)酵肉類產(chǎn)品(例如，香腸)的生產(chǎn)過(guò)程造成負(fù)面影響，這是由于其會(huì)抑制起始培養(yǎng)物。大多數(shù)獸用藥物是通過(guò)來(lái)自屠宰動(dòng)物的肉類，或者通過(guò)動(dòng)物產(chǎn)品(例如奶和蛋)進(jìn)入到人類食物鏈中的。對(duì)屠宰動(dòng)物、動(dòng)物產(chǎn)品和食物產(chǎn)品中抗微生物藥物的存在的控制，是食物工業(yè)的重要議題。在大多數(shù)國(guó)家，已經(jīng)建立起了關(guān)于新鮮肉類和肉類產(chǎn)品中最大殘余的限制或容許量水平。對(duì)于不被允許的化合物而言，其容許量為零，此類物質(zhì)不應(yīng)存在于動(dòng)物產(chǎn)品中。對(duì)于大多數(shù)藥物而言，要確定其停藥(withdrawl)期。這是最后一次服用至屠宰時(shí)間之間的最短的時(shí)期。在該時(shí)期內(nèi)，藥物殘余應(yīng)降低至低于最高殘余限量的水平。但是，在一些情況下，甚至在停藥期后，在動(dòng)物中仍然可能存在過(guò)高的藥物濃度。這可能是由于天然的個(gè)體代謝差異導(dǎo)致的，或者是由于疾病使得藥物的排出過(guò)程被干擾。最后，在停藥期內(nèi)可能并未正確應(yīng)用適當(dāng)?shù)募夹g(shù)。在大多數(shù)國(guó)家，關(guān)于食物產(chǎn)品中獸用藥物殘余的立法是通過(guò)官方控制程序來(lái)維持的。通常，政府機(jī)構(gòu)會(huì)對(duì)一定比例的屠宰動(dòng)物進(jìn)行關(guān)于獸用藥物殘余的存在情況的檢查。此外，屠宰場(chǎng)或超市也會(huì)檢查生肉、肉類產(chǎn)品以及器官，例如腎和肝。雖然最重要的抗微生物藥物中的很多都是通過(guò)尿液排泄的，但是目前尿液還很難用作為底物以檢測(cè)屠宰動(dòng)物中是否存在抗微生物藥物殘余。從尿液排泄出去的抗微生物動(dòng)物藥物的例子是，β-內(nèi)酰胺類，例如阿莫兩林、氨芐青霉素、青霉素G和青霉素V，四環(huán)素類，例如氯四環(huán)素和氧四環(huán)素，氨基糖苷類，例如慶大霉素和鏈霉素，以及磺胺類，例如磺胺脒(sulfamidine)。尿液中抗微生物化合物的量是在動(dòng)物可食用部分(例如，肌肉組織和肝)中抗微生物化合物水平的指示。容易理解，對(duì)尿液的檢測(cè)提供了很大的好處。對(duì)于很多種動(dòng)物來(lái)說(shuō)，可以相當(dāng)簡(jiǎn)單地獲取尿液樣品，因?yàn)楹芏鄤?dòng)物在尿液排泄期間具有特定的地點(diǎn)。用尿液作為樣品來(lái)檢測(cè)肉類中抗微生物藥物的存在情況，使得動(dòng)物可在屠宰前被檢測(cè)。這向農(nóng)民提供了下述可能性檢查停藥期是否如期待的一樣已完成了。如果不的話，農(nóng)民能決定在將動(dòng)物運(yùn)送至屠宰場(chǎng)之前等待數(shù)天。在屠宰之后再行確定動(dòng)物是否是抗生素陽(yáng)性的情況下，造成的經(jīng)濟(jì)損失會(huì)很大。相當(dāng)明顯，如果動(dòng)物在被屠宰之前而不是之后被檢測(cè)，用于探測(cè)人類食物鏈中抗微生物藥物殘余的整個(gè)控制系統(tǒng)將更為有效?；蛘?，動(dòng)物的血液樣品可被用于測(cè)定屠宰動(dòng)物中抗微生物藥物殘余是否存在。當(dāng)然，尿液和血液樣品也可在對(duì)動(dòng)物進(jìn)行屠宰之后獲得。在那種情況下，為獲得樣品，有價(jià)值的肉類部分不必被破壞?？梢允褂梦⑸镆种茩z測(cè)(例如，瓊脂擴(kuò)散檢測(cè))來(lái)探測(cè)抗微生物劑的殘余。此類方法主要用于檢測(cè)奶和肉類流體，其被描述于GBA1467439、EP0005891、DE3613794、CA2056581、EP0285792和US5,494,805中。這些說(shuō)明書都涉及到其中使用檢測(cè)生物(testorganism)的即用型檢測(cè)。大多數(shù)情況下，檢測(cè)生物被置于瓊脂培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基可以含有指示劑、緩沖液、營(yíng)養(yǎng)物和用于以正面或負(fù)面方式改變對(duì)某些抗微生物化合物的靈敏度的物質(zhì)。合適的檢測(cè)生物是Bacillus、Streptococcus和/或Escherichiacoli的菌株。通常，檢測(cè)的原則是，當(dāng)抗細(xì)菌化合物以足以抑制檢測(cè)生物生長(zhǎng)的濃度存在于樣品中時(shí)，酸/堿或氧化還原指示劑的顏色會(huì)保留，而不存在對(duì)檢驗(yàn)生物的生長(zhǎng)的抑制時(shí)，伴隨有能改變指示劑顏色的代謝產(chǎn)物的形成。目前可獲得的檢驗(yàn)方法適于對(duì)多種不同種類樣品中的抗微生物劑殘余進(jìn)行探測(cè)。但是，這些檢驗(yàn)方法存在有如下問(wèn)題由于存在干擾物質(zhì)，無(wú)法對(duì)尿液和血液中的抗微生物劑殘余進(jìn)行探測(cè)。這些物質(zhì)會(huì)干擾檢驗(yàn)，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性的結(jié)果。制備尿液和血液樣品的一些方法是已知的。最容易的方法是用水稀釋樣品(至少三倍)。但是，明顯地，對(duì)樣品的稀釋會(huì)導(dǎo)致靈敏度以同樣的因子降低。將每份尿液或血液樣品的pH調(diào)節(jié)至某個(gè)值，可以部分消除樣品間的差異。在使用尿液的情況下，pH可以相差很多。這些波動(dòng)可在物種間、同一物種的不同動(dòng)物間以及對(duì)于個(gè)體動(dòng)物來(lái)說(shuō)某天與某天之間觀察到。例如，由于飼料和需要獲得尿液樣品的時(shí)間的不同，pH可以在酸性和堿性的之之間相當(dāng)強(qiáng)烈地變動(dòng)。但是，此類方法在實(shí)踐中是不可用的，因?yàn)樵谵r(nóng)民所在地對(duì)尿液樣品進(jìn)行檢驗(yàn)是最方便的。在這種情況下，測(cè)量出精確的pH，以及用酸性或堿性溶液將樣品滴定至某個(gè)pH值太過(guò)復(fù)雜。在該方面，Erasmusonetal.(Analyst123，2497-2499(1998))已經(jīng)提出，通過(guò)酸處理至5.5，可在分析前從尿液樣品中去除重碳酸鹽。該方法的缺點(diǎn)在于，需要進(jìn)行很多操作，例如加入若干份酸、測(cè)量pH值以及允許二氧化碳產(chǎn)生，并且，樣品由此會(huì)被稀釋，從而降低了靈敏度。此外，還觀察到，對(duì)于大多數(shù)樣品來(lái)說(shuō)，調(diào)節(jié)pH值并不能給出令人滿意的溶液，因?yàn)榧訇?yáng)性結(jié)果仍然存在。最后還有，通過(guò)調(diào)節(jié)pH，主要的缺陷又是對(duì)樣品的稀釋?？梢缘贸鼋Y(jié)論迄今為止，還無(wú)法獲得用于探測(cè)尿液和血液樣品中抗微生物劑殘余的合適的檢驗(yàn)方法。目前的方法都不可靠、消耗時(shí)間并且可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一是，提供一種經(jīng)過(guò)改進(jìn)的檢驗(yàn)培養(yǎng)基，以及提供一種用于在流體，特別是血液和尿液，中探測(cè)抗生素的方法。令人驚奇地，我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將金屬鹽用于檢驗(yàn)培養(yǎng)基時(shí)，能夠獲得實(shí)質(zhì)上的改進(jìn)。為達(dá)到此目的，本發(fā)明提供了一種檢驗(yàn)培養(yǎng)基，其中包括檢驗(yàn)微生物、指示劑和以離子化形式存在的金屬，其中，所述金屬的化合價(jià)至少為2，所述金屬的濃度在0.001M至1M之間。此外，本發(fā)明提供了探測(cè)流體中抗生素存在情況的方法，所述方法包括如下步驟(a)將所述流體的樣品與包含檢驗(yàn)微生物和指示劑的檢驗(yàn)培養(yǎng)基相接觸；(b)培養(yǎng)所述檢驗(yàn)微生物一段時(shí)間，以使得在沒有抗生素存在于所述流體樣品中的情況下，所述檢驗(yàn)微生物得以生長(zhǎng)；以及(c)用所述指示劑探測(cè)所述檢驗(yàn)微生物的生長(zhǎng)或?qū)ζ渖L(zhǎng)的抑制，其特征在于，向所述檢驗(yàn)培養(yǎng)基和/或所述流體樣品中加入了金屬鹽，其中，所述金屬的化合價(jià)至少為2，并且所述金屬鹽在20℃時(shí)在水中具有至少0.02M的溶解度。此外，本發(fā)明還提供了一種試劑盒，其適用于對(duì)流體中的抗生素進(jìn)行探測(cè)，所述試劑盒包括(a)至少一種容器，其中至少部分裝有檢驗(yàn)培養(yǎng)基，所述檢驗(yàn)培養(yǎng)基包含檢驗(yàn)微生物以及至少一種指示劑，以及；(b)金屬鹽，其中，所述金屬的化合價(jià)至少為2，并且所述金屬鹽在20℃時(shí)在水中具有至少0.02M的溶解度?；蛘撸瑱?quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的檢驗(yàn)培養(yǎng)基。發(fā)明詳述下面給出的術(shù)語(yǔ)和縮寫在本文中使用，其定義參見如下所述。術(shù)語(yǔ)“抗生素”指展示出抗細(xì)菌的活性的一種或多種物質(zhì)，或者展示出這種活性的樣品的化學(xué)成分。術(shù)語(yǔ)“流體”指具有下述粒子的物質(zhì)或組合物，所述粒子可以容易地移動(dòng)并能改變其相對(duì)位置而無(wú)須整體分離，所述物質(zhì)或組合物易于產(chǎn)生壓力并具有流動(dòng)能力。就本發(fā)明而言，術(shù)語(yǔ)“流體”指例如水溶液、血液、糞便、肉類流體、奶、尿液等組合物。術(shù)語(yǔ)“β-內(nèi)酰胺抗生素”指，在其化學(xué)結(jié)構(gòu)中包含β-內(nèi)酰胺亞結(jié)構(gòu)并展示出抗細(xì)菌活性的抗生素。所述β-內(nèi)酰胺抗生素的例子是，阿莫西林、氨芐青霉素、頭孢克洛(cefaclor)、頭孢羥氨芐(cefadroxil)、頭孢丙烯(cefprozil)、頭孢噻呋(ceftiofur)、頭孢氨芐(cephalexin)、頭孢吡硫(cephapirin)、頭孢拉定(cephradine)、氯唑西林(cloxacillin)、二氯唑西林(dicloxacillin)、氟氯西林(flucloxacillin)、苯唑西林(oxacillin)、青霉素G、青霉素V和替卡西林。術(shù)語(yǔ)“指示劑”指下述化合物或物質(zhì)，它們能從一種狀態(tài)變?yōu)榱硪环N，以提供可探測(cè)到的信號(hào)，例如，顏色或熒光的改變。術(shù)語(yǔ)“檢驗(yàn)(test)”指用于鑒定、表征或量化一種或多種抗生素或抗生素類的方法、過(guò)程、工藝或反應(yīng)。術(shù)語(yǔ)“檢驗(yàn)設(shè)備”指適于進(jìn)行檢驗(yàn)的組件或組件的部分。術(shù)語(yǔ)“檢驗(yàn)培養(yǎng)基”指檢驗(yàn)微生物的液體或固化的懸浮物，可選地，其還包含至少一種指示劑，以及可選地，包含營(yíng)養(yǎng)物和緩沖物質(zhì)。優(yōu)選地，使用膠凝劑將檢驗(yàn)培養(yǎng)基固化為凝膠或溶膠的形式。術(shù)語(yǔ)“檢驗(yàn)微生物”指下述微生物，其對(duì)抗生素敏感，并且適于對(duì)其是否生長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。術(shù)語(yǔ)“閾值”指下述濃度值，當(dāng)高于它的時(shí)候，給定的抗生素被認(rèn)為是存在的，而當(dāng)?shù)陀谒鼤r(shí)，所述抗生素被看作是不存在的。通常，閾值是當(dāng)?shù)?、地區(qū)或地區(qū)間機(jī)構(gòu)針對(duì)特定樣品中特定的抗生素給出的，但是也可以是針對(duì)某些研究目的預(yù)先設(shè)定的。術(shù)語(yǔ)“化合價(jià)”指元素(例如金屬)的結(jié)合能力的程度，這是通過(guò)所述元素將結(jié)合的、或可取代的、或可與之相比的一價(jià)元素(例如氫)的原子量的數(shù)量來(lái)表示的。在本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了一種檢驗(yàn)培養(yǎng)基，其用于探測(cè)流體中的抗微生物化合物，所述培養(yǎng)基包括一種或多種類型的檢驗(yàn)微生物作為探測(cè)試劑，可選地，包括指示劑和以離子化形式存在的金屬。我們出人意料地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在檢驗(yàn)培養(yǎng)基中使用以離子化形式存在的金屬時(shí)，上文提到的現(xiàn)有技術(shù)的問(wèn)題可被克服而保持檢驗(yàn)的靈敏度。優(yōu)選地，所述金屬的化合價(jià)至少為2。此類金屬的例子是鋁、鋇、鈹、鉍、鈣、鉻、鈷、銅、鐵、鑭、鉛、鎂、錳、鎳、鍶、錫、鈦和鋅。更優(yōu)選地，所述金屬是堿土金屬和/或鑭系元素。最優(yōu)選地，所述金屬是鋇或鈣。優(yōu)選地，所述金屬在所述檢驗(yàn)培養(yǎng)基中的濃度在0.005至1M之間，更優(yōu)選地，在0.01至0.1M之間。對(duì)金屬離子來(lái)說(shuō)合適的反離子是能滿足溶解度要求的離子。優(yōu)選的反離子是乙酸根、苯甲酸根、溴、氯、碘、硝酸根和亞硝酸根離子，在某些情況下，硫酸根離子。金屬鹽應(yīng)當(dāng)具有在水中的溶解度，使得金屬鹽得以在檢驗(yàn)樣品或檢驗(yàn)培養(yǎng)基中容易地溶解。通常，水中的所述溶解度應(yīng)等于或高于0.1M，優(yōu)選地，等于或高于0.02M，更優(yōu)選地，等于或高于0.1M，最優(yōu)選地，等于或高于1M。優(yōu)選的金屬鹽是溴化鋇、氯化鋇、碘化鋇、硝酸鋇、氯化鈹、硫酸鈹、乙酸鈣、溴化鈣、氯化鈣、碘化鈣、硝酸該、氯化鎂、硫酸鎂、氯化錳和氯化鋅。最優(yōu)選地，金屬鹽是氯化鈣。可選地，檢驗(yàn)培養(yǎng)基還可含有營(yíng)養(yǎng)物、穩(wěn)定劑以及能以正面或負(fù)面方式改變對(duì)某些抗微生物化合物的靈敏度的物質(zhì)、和/或增加粘度的試劑。能改變對(duì)某些抗微生物化合物的靈敏度的物質(zhì)的例子是腺苷和抗葉酸制劑，例如，甲藜嘧胺(Ormethoprim)、四氧普林(Tetroxoprim)和三甲氧芐氨嘧啶(Trimethoprim)，它們能增加檢驗(yàn)微生物對(duì)磺胺類化合物的靈敏度，或者草酸鹽或氫氟酸鹽，其能增加對(duì)四環(huán)素的靈敏度。需要的情況下，可以加入半胱氨酸，以降低對(duì)青霉素類的靈敏度。增加粘度的試劑的例子包括抗壞血酸甲基硅烷醇果膠酸酯(pectinate)、卡波姆(carbomer)、羧甲基纖維素、十六硬脂醇(cetearylalcohol)、十六烷醇(cetylalcohol)、鯨蠟酯(cetylester)、椰油酰胺DEA、乳化蠟、葡萄糖、羥乙基纖維素、羥基丙甲基纖維素、月桂酰胺DEA、亞油酰胺DEA、硅酸鋁鎂、麥芽糊精、PEG-8二硬脂酸、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、PVP/十六烯共聚物、氯化鈉、硫酸鈉、大豆氨基丙基甜菜堿(soyamidopropylbetaine)、黃原膠等?；蛘撸衔奶岬降臋z驗(yàn)培養(yǎng)基的可選原料也可外源加入。可選地，檢驗(yàn)培養(yǎng)基包含一種或多種指示劑，但是，這些化合物也可以在檢驗(yàn)方法期間加入。流體樣品存在時(shí)，微生物生長(zhǎng)期間存在至少一種指示劑，以顯示反應(yīng)培養(yǎng)基中發(fā)生的任何變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，多種指示劑都適于此目的。特別有用的是下述指示劑，其從一種狀態(tài)變化為另一種狀態(tài)時(shí)，能提供視覺可探測(cè)到的顏色或熒光變化。此類指示劑可以從手冊(cè)中很容易地選擇出來(lái)，例如‘H.J.Conn’sBiologicalStains’，R.D.Lillieed.，Baltimore，1969。優(yōu)選的指示劑是pH指示劑和/或氧化還原指示劑。合適的指示劑的例子是AcidBlue120、AcidOrange51、AcidYellow38、AlizarinAcid、AlizarinBlue、AzureA、AzureB、BasicBlue3、BrilliantBlack、BrilliantCresylBlue、BrilliantCroceinMOO、BrilliantYellow、BromocresolPurple、BromophenolBlue、BromophenolRed、BromothymolBlue、CongoRed、Gallocyanine、IndigoCarmine、JanusGreenB、Litmus、MethyleneBlue、NileBlueA、NitrazolYellow(也被稱為NitrazineYellow)、o-Nitrophenol、p-Nitrophenol、1-10Phenanthroline、Phenolphthalein、SafranineO、Thionin、ToluidineBlue。在本發(fā)明第一個(gè)方面的一種實(shí)施方式中，檢驗(yàn)培養(yǎng)基優(yōu)選以溶膠或凝膠形式存在。合適的膠凝劑的例子是瓊脂、褐藻酸及其鹽、角叉菜膠、明膠、羥丙基瓜爾豆膠及其衍生物、角豆膠(Carob膠)、經(jīng)加工的麒麟菜海藻等。檢驗(yàn)培養(yǎng)基中膠凝劑的量在2至100g.l-1之間，優(yōu)選在5至50g.l-1之間，更優(yōu)選在10至20g.l-1之間，最優(yōu)選在12至15g.l-1之間。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能理解，其它類型的固體檢驗(yàn)培養(yǎng)基可以基于載體材料，例如陶瓷、棉、玻璃、金屬顆粒、紙、任何形狀或形式存在的聚合物、硅酸鹽、海綿、羊毛等。在商業(yè)檢驗(yàn)設(shè)備的情況下，例如，PremiTest或Delvotest檢驗(yàn)培養(yǎng)基存在于試管或平板中?？捎糜诒景l(fā)明的目的的設(shè)備的例子有，透明試管，其可以是單個(gè)的、一套的或與一批半透明材料組合，其上提供有多個(gè)洞。檢驗(yàn)設(shè)備優(yōu)選具有確定的尺寸。這是因?yàn)闄z驗(yàn)的可靠性。基于瓊脂擴(kuò)散技術(shù)的檢驗(yàn)的情況下，優(yōu)選使用試管。優(yōu)選地，檢驗(yàn)設(shè)備將足夠高，以含有大量的瓊脂培養(yǎng)基和樣品，相應(yīng)于3-30mm，更優(yōu)選地，5-15mm。檢驗(yàn)單元的內(nèi)部橫截面尺寸優(yōu)選為1-30mm，更優(yōu)選為5-15mm。檢驗(yàn)設(shè)備優(yōu)選在儲(chǔ)存期間被密封，在此條件下它們能被存放至少數(shù)月。當(dāng)然，任何其它適于進(jìn)行本發(fā)明方法的檢驗(yàn)設(shè)備也包括在本發(fā)明中。檢驗(yàn)設(shè)備中瓊脂培養(yǎng)基的體積是由檢驗(yàn)設(shè)備的高度、檢驗(yàn)設(shè)備的內(nèi)部橫截面尺寸以及檢驗(yàn)設(shè)備裝有的瓊脂培養(yǎng)基體積的百分比決定的。瓊脂培養(yǎng)基的體積優(yōu)選為0.01-5ml，更優(yōu)選為0.1-1ml。在另一種實(shí)施方式中，檢驗(yàn)設(shè)備是包含一個(gè)或多個(gè)含有檢驗(yàn)培養(yǎng)基的孔的平板。待分析的流體樣品可被直接加入到含有檢驗(yàn)培養(yǎng)基的孔中，或者可以間接加入到所述孔中，例如，通過(guò)首先將待分析流體樣品應(yīng)用于載體材料(例如紙盤)然后將其上粘附或吸收有流體的載體材料放置到檢驗(yàn)培養(yǎng)基上來(lái)進(jìn)行。在本發(fā)明第一個(gè)方面的另一種實(shí)施方式中，微生物是熱穩(wěn)定的微生物，例如Bacillus的種，優(yōu)選地，Bacillusstearothermophilus，或Streptococcus的種，優(yōu)選地，Streptococcusthermophilus。這些物種可作為能產(chǎn)生菌落的單位或菌落形成單位(CFU’s)被引入到檢驗(yàn)系統(tǒng)中。所述CFU’s可以是芽孢/孢子、無(wú)性繁殖細(xì)胞或其兩者的混合物。所述CFU’s的濃度被表示為每ml檢驗(yàn)培養(yǎng)基的菌落形成單位(CFU.ml-1)，其通常在1×105至1×1012CFU.ml-1的范圍內(nèi)，優(yōu)選為1×106至1×1010CFU.ml-1，更優(yōu)選為2×106至1×109CFU.ml-1，最優(yōu)選為5×106至1×108CFU.ml-1，或者進(jìn)一步更優(yōu)選為5×106至2×107CFU.ml-1。優(yōu)選的菌株的例子是Bacillusstearothermophilusvar.calidolactisC953(以保藏號(hào)LMD74.1保藏于LaboratoryofMicrobiologyoftheTechnicalUniversityofDelft，以及以保藏號(hào)CBS760.83保藏于CentraalBureauvoorSchimmelcultures(CBS)，Baarn)以及StreptococcusthermophilusT101(DSM4022)。兩種菌株都對(duì)抗微生物化合物非常敏感，尤其是化療類藥物，例如，磺胺類化合物，以及抗生素，例如青霉素類和四環(huán)素類。Escherichiacoli菌株或其它合適的革蘭氏陰性細(xì)菌可被用于探測(cè)，例如，喹啉酮。Bacillusstearothermophilusvar.calidolactisC953和StreptococcusthermohphilusT101生長(zhǎng)迅速，并且具有嗜熱性的優(yōu)點(diǎn)。例如，對(duì)所述Bacillus菌株而言最優(yōu)生長(zhǎng)溫度為50℃至70℃之間。使用嗜熱性微生物能防止檢驗(yàn)系統(tǒng)儲(chǔ)存或轉(zhuǎn)運(yùn)期間微生物的生長(zhǎng)。當(dāng)檢驗(yàn)生物是Bacillus菌株時(shí)，優(yōu)選地，將其以芽孢懸浮物的形式包括進(jìn)瓊脂培養(yǎng)基中，其可以在固化之前通過(guò)已知方法(見，例如，GBA1467439)來(lái)制備并添加到瓊脂培養(yǎng)基中。當(dāng)檢驗(yàn)生物是Streptococcus菌株時(shí)，細(xì)菌優(yōu)選地以細(xì)菌細(xì)胞的形式被包括進(jìn)瓊脂培養(yǎng)基，其可按照已知方法(見，例如，EP0285792)來(lái)制備。瓊脂培養(yǎng)基中檢驗(yàn)生物的濃度優(yōu)選在每ml瓊脂培養(yǎng)基105至1010個(gè)菌落形成單位(CFU.ml-1)之間。在本發(fā)明第一個(gè)方面的另一種實(shí)施方式中，營(yíng)養(yǎng)物和/或金屬鹽作為單獨(dú)的來(lái)源被加入，例如，作為微粒、粉末、藥片、圓盤(disc)或紙過(guò)濾器(paperfilter)。此外，其它化合物，例如，指示劑、穩(wěn)定劑和/或抗葉酸劑可作為單獨(dú)的來(lái)源加入，可選地，被包括進(jìn)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。能使檢驗(yàn)生物在不存在抗微生物劑殘余的情況下繁殖的合適的營(yíng)養(yǎng)物是，例如，可吸收的碳源(例如，乳糖、葡萄糖或右旋糖(dextrose))、可吸收的氮源(例如，蛋白胨)以及生長(zhǎng)因子、微生物和礦物質(zhì)的來(lái)源(例如，酵母提取物)。在本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了一種可靠并且簡(jiǎn)單的方法，用于開展對(duì)尿液和血液中抗微生物化合物的探測(cè)。根據(jù)本發(fā)明，在將樣品加入到檢驗(yàn)系統(tǒng)中之前，將具有等于或高于2的化合價(jià)的金屬鹽加入到待分析的流體樣品中，例如，尿液或血液樣品?；蛘?，檢驗(yàn)系統(tǒng)本身可以含有所述金屬鹽，如本發(fā)明的第一個(gè)方面所示。我們意外地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)金屬鹽被用于檢驗(yàn)方法中時(shí)，上文提到的現(xiàn)有技術(shù)的問(wèn)題可被克服并保持檢驗(yàn)的靈敏度。對(duì)金屬鹽、檢驗(yàn)培養(yǎng)基、指示劑、微生物和其它成分以及其優(yōu)選選擇的要求與第一個(gè)方面所述相同。所述金屬鹽被加入到檢驗(yàn)培養(yǎng)基和/或待分析的流體樣品中。在第二個(gè)方面的一種實(shí)施方式中，通過(guò)溶液，優(yōu)選地，通過(guò)水溶液，將金屬鹽加入到待分析的流體樣品中。在本發(fā)明的第二個(gè)方面的另一種實(shí)施方式中，金屬鹽以固體形式被加入到待分析的流體樣品中?？蛇x地，在分析之前對(duì)以固體形式存在的金屬鹽和待分析的流體樣品進(jìn)行混合。優(yōu)選地，以固體形式存在的金屬鹽以粉末、微粒、藥片、圓盤或紙過(guò)濾器的形式加入?？蛇x地，所述微粒、粉末、藥片、圓盤或紙過(guò)濾器還含有營(yíng)養(yǎng)物和/或一種或多種指示劑和/或穩(wěn)定劑，和/或能以正面或負(fù)面方式改變對(duì)某些抗微生物化合物靈敏度的物質(zhì)，和/或增加粘度的試劑，如上文中本發(fā)明的第一個(gè)方面所述。優(yōu)選地，所述金屬在所述待分析流體樣品中的濃度在0.005至1M之間，更優(yōu)選地，在0.01至0.1M之間。將要加入到檢驗(yàn)培養(yǎng)基中的尿液或血液樣品的量取決于檢驗(yàn)系統(tǒng)。按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書來(lái)對(duì)檢驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行培育。對(duì)于微生物擴(kuò)散而言，用公知方法向檢驗(yàn)培養(yǎng)基中加入0.01-1.0ml，優(yōu)選地，0.05-0.5ml。對(duì)檢驗(yàn)系統(tǒng)的培育時(shí)間取決于條件。在使用Bacillusstearothermophilus進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散檢驗(yàn)的情況下，在水浴或模塊加熱器(blockheater)中，于60-70℃對(duì)檢驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行培育，優(yōu)選地，62-65℃。1.5-4小時(shí)后可獲得結(jié)果，優(yōu)選地，2.5-3.5小時(shí)。適合進(jìn)行本發(fā)明方法的任何檢驗(yàn)都包括在本發(fā)明中。例子是，其中使用了選定的敏感微生物的檢驗(yàn)，例如，微生物瓊脂擴(kuò)散檢驗(yàn)。以及基于與待探測(cè)的化合物的選擇性結(jié)合的檢驗(yàn)。選擇性結(jié)合可以用公知的抗體技術(shù)或使用特定的示蹤劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。任何流體樣品都適于通過(guò)本發(fā)明的方法進(jìn)行的分析。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的方法也適于固體物質(zhì)，其中感興趣的流體可以通過(guò)擴(kuò)散、壓力或天然流體損失被取出。后一種情況的具體的例子是已將待分析流體注入其中的肉類和載體材料。在本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供了一種用于進(jìn)行本發(fā)明的第二個(gè)方面的方法的試劑盒。此類試劑盒包含一種或多種容器，其中裝有如本發(fā)明的第一個(gè)方面所述的檢驗(yàn)培養(yǎng)基，并包含金屬鹽。所述容器可以是任何形狀和大小的試管，并可獲得自任何可獲得的材料，只要能夠觀察到指示劑的變化。此外，容器可以是孔，例如被包括進(jìn)微滴定板中的。所述金屬鹽是能形成如本發(fā)明的第一個(gè)方面所述的金屬離子的金屬鹽。所述金屬鹽可以以貯藏于容器中的溶液形式存在，優(yōu)選地，水溶液的形式。優(yōu)選地，所述金屬鹽以固體形式存在，例如，以藥片、圓盤或紙過(guò)濾器的形式存在。在試劑盒中提供固體形式的金屬鹽的好處在于，可以容易地包裝成給定的量，例如，以藥片形式，其使得劑量容易達(dá)成。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，使用干形式的金屬鹽不會(huì)導(dǎo)致樣品被稀釋，從而隨之降低檢驗(yàn)的靈敏度?？蛇x地，所述試劑盒包含用于在培育期間密封裝有檢驗(yàn)培養(yǎng)基的所述容器的設(shè)備，和/或關(guān)于使用的說(shuō)明書，和/或用于設(shè)定培育所需時(shí)間的設(shè)備。在第三個(gè)方面的一種實(shí)施方式中，所述試劑盒包含營(yíng)養(yǎng)物。優(yōu)選地，所述營(yíng)養(yǎng)物被包含于培養(yǎng)基內(nèi)，例如，藥片、圓盤或紙過(guò)濾器。此外，其它化合物，例如，指示劑、穩(wěn)定劑和/或抗葉酸制劑可作為單獨(dú)的來(lái)源加入，可選地，包括進(jìn)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中。當(dāng)所述培養(yǎng)基存在時(shí)，還將金屬鹽包括在內(nèi)是非常有好處的。在本發(fā)明第三個(gè)方面的另一種實(shí)施方式中，所述試劑盒包含溫度調(diào)節(jié)設(shè)備，在其協(xié)助下，檢驗(yàn)樣品可被保持于預(yù)先設(shè)定的溫度。優(yōu)選地，按照使其能容納具有檢驗(yàn)培養(yǎng)基的所述容器的方式，來(lái)設(shè)計(jì)所述溫度調(diào)節(jié)設(shè)備?？蛇x地，溫度調(diào)節(jié)設(shè)備與設(shè)置培育所需時(shí)間的設(shè)備耦合，使得在預(yù)先設(shè)定的時(shí)間過(guò)后加熱和/或冷卻得以停止。在本發(fā)明的第三個(gè)方面的又一種實(shí)施方式中，所述試劑盒包含數(shù)據(jù)載體，其載有計(jì)算機(jī)程序，所述程序適于引導(dǎo)計(jì)算機(jī)對(duì)從樣品讀取設(shè)備獲得的數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行分析。所述數(shù)據(jù)載體可以是適于存貯數(shù)字信息的任何載體，例如，CD-ROM、磁盤、DVD、記憶棒、磁帶等。有利地，載有計(jì)算機(jī)程序的所述數(shù)據(jù)載體提供了對(duì)適于在本發(fā)明方法中使用的可獲得的計(jì)算機(jī)程序的最新版本的簡(jiǎn)單獲取途徑。實(shí)施例實(shí)施例1向尿液樣品中加入氯化鈣(CaCl2)用微生物抑制檢驗(yàn)安瓿來(lái)檢測(cè)尿液樣品，所述安瓿是按照EP0005891所述的方法生產(chǎn)的，其中，瓊脂中存在有營(yíng)養(yǎng)物。所述檢驗(yàn)系統(tǒng)也被稱為PremiTest(可通過(guò)商業(yè)途徑從DSM，Delft，TheNetherlands獲得)。CaCl2·2H2O(0.81mg，0.0055mmol)被溶于100μl從豬(總共評(píng)估了10份樣品)或牛犢(總共評(píng)估了35份樣品)中獲得的尿液中，所述尿液中不含任何藥物殘余。對(duì)照樣品中沒有加入CaCl2。樣品被加入到檢驗(yàn)安瓿中。在室溫預(yù)培育20分鐘后，樣品被移開，按照廠商說(shuō)明書，檢驗(yàn)系統(tǒng)在水浴中于64±1℃被培育。3-4小時(shí)后，通過(guò)觀察從紫色到黃色的顏色變化來(lái)獲得結(jié)果。結(jié)果被概括于下表中，其清楚地顯示，用CaCl2去處理尿液，對(duì)于減少PremiTest中的假陽(yáng)性檢驗(yàn)結(jié)果來(lái)說(shuō)是很重要的。表1實(shí)施例2CaCl2對(duì)微生物抑制檢驗(yàn)的影響按照實(shí)施例1所述來(lái)檢測(cè)樣品。CaCl2·2H2O被溶于水或雞肉流體中，其濃度為0、0.0078、0.0156、0.0312、0.0625、0.125、0.25、0.5和1M。樣品被加入到檢驗(yàn)安瓿中。在室溫預(yù)培育20分鐘后，樣品被移開，按照廠商說(shuō)明書，檢驗(yàn)系統(tǒng)在水浴中于64±1℃被培育。對(duì)雞肉流體而言，165分鐘后，對(duì)水的情況而言，185分鐘后，通過(guò)觀察從紫色到黃色的顏色變化來(lái)獲得結(jié)果。被概括于下表中的結(jié)果清楚地顯示，水中高達(dá)0.25M的CaCl2濃度不會(huì)影響到檢驗(yàn)結(jié)果。在雞肉流體中，當(dāng)CaCl2濃度高達(dá)1M時(shí)也沒有抑制。表2<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="838">CaCl2濃度(M)微生物抑制檢驗(yàn)中觀察到的顏色水雞肉流體0(對(duì)照)黃色黃色0.0078黃色黃色0.0156黃色黃色0.0312黃色黃色0.0625黃色黃色0.125黃色黃色0.25黃色黃色0.5紫色黃色1紫色黃色</table></tables>實(shí)施例3將氯化鈣加入到牛尿液樣品中該實(shí)驗(yàn)顯示了將CaCl2加入到尿液中能降低微生物抑制檢驗(yàn)的假結(jié)果。用微生物抑制檢驗(yàn)安瓿來(lái)檢測(cè)尿液樣品，所述安瓿是按照EP0005891所述的方法生產(chǎn)的，其中，瓊脂中存在有營(yíng)養(yǎng)物。所述檢驗(yàn)系統(tǒng)也被稱為PremiTest(可通過(guò)商業(yè)途徑從DSM，Delft，TheNetherlands獲得)。CaCl2·2H2O(1mg，0.0068mmol)被溶于100μl從牛(總共評(píng)估了25份樣品)中獲得的尿液中，所述尿液中不含任何藥物殘余。對(duì)照樣品中沒有加入CaCl2。樣品被加入到檢驗(yàn)安瓿中。在室溫預(yù)培育20分鐘后，樣品被移開，按照廠商說(shuō)明書，檢驗(yàn)系統(tǒng)在水浴中于64±1℃被培育。3-4小時(shí)后，通過(guò)觀察從紫色到黃色的顏色變化來(lái)獲得結(jié)果。結(jié)果被概括于下表3中，其清楚地顯示，用CaCl2去處理尿液，對(duì)于使PremiTest中的假陽(yáng)性檢驗(yàn)結(jié)果最小化來(lái)說(shuō)是很必要的。表3<tablesid="table3"num="003"><tablewidth="835">假陽(yáng)性結(jié)果的量(％)牛</table></tables><tablesid="table4"num="004"><tablewidth="834">尿液100尿液+CaCl2(1mg/100μl)12</table></tables>實(shí)施例4將乙酸鈣(Ca(CH3COO)2)加入到牛和豬的尿液樣品中該實(shí)驗(yàn)顯示了將堿土金屬鈣CaCl2或Ca(CH3COO)2加入到尿液中能降低微生物抑制檢驗(yàn)的假結(jié)果。用微生物抑制檢驗(yàn)安瓿來(lái)檢測(cè)尿液樣品，所述安瓿是按照EP0005891所述的方法生產(chǎn)的，其中，瓊脂中存在有營(yíng)養(yǎng)物。所述檢驗(yàn)系統(tǒng)也被稱為PremiTest(可通過(guò)商業(yè)途徑從DSM，Delft，TheNetherlands獲得)。CaCl2·2H2O(1.0mg，0.0068mmol)、Ca(CH3COO)2(1.0mg，0.0041mmol)和Ca(CH3COO)2(2.0mg，0.0082mmol)被溶于100μl從牛(總共評(píng)估了25份樣品)和豬(總共評(píng)估了9份樣品)中獲得的尿液中，所述尿液中不含任何藥物殘余。對(duì)照樣品中沒有加入堿土金屬鈣。樣品被加入到檢驗(yàn)安瓿中。在室溫預(yù)培育20分鐘后，樣品被移開，按照廠商說(shuō)明書，檢驗(yàn)系統(tǒng)在水浴中于64±1℃被培育。3-4小時(shí)后，通過(guò)觀察從紫色到黃色的顏色變化來(lái)獲得結(jié)果。結(jié)果被概括于下表4中，其清楚地顯示，用堿土金屬鈣去處理尿液，對(duì)于使PremiTest中的假陽(yáng)性檢驗(yàn)結(jié)果最小化來(lái)說(shuō)是很重要的。表4<tablesid="table5"num="005"><tablewidth="835">假陽(yáng)性結(jié)果的量(％)牛豬尿液10089尿液+CaCl2(1mg/100μl)1211尿液+Ca(CH3COO)2(1mg/100μl)200尿液+Ca(CH3COO)2(2mg/100μl)412</table></tables>權(quán)利要求1.檢驗(yàn)培養(yǎng)基，其中包含檢驗(yàn)微生物、指示劑和以離子化形式存在的金屬，其中所述金屬的化合價(jià)至少為2，所述金屬的濃度在0.001M至1M之間。2.如權(quán)利要求1所述的檢驗(yàn)培養(yǎng)基，其特征在于，所述金屬是堿土金屬和/或鑭系元素。3.如權(quán)利要求2所述的檢驗(yàn)培養(yǎng)基，其特征在于，所述堿土金屬是鈣。4.探測(cè)流體中抗生素存在情況的方法，所述方法包括如下步驟(a)將所述流體樣品與包含檢驗(yàn)微生物和指示劑的檢驗(yàn)培養(yǎng)基相接觸；(b)培養(yǎng)所述檢驗(yàn)微生物一段時(shí)間，以使得在沒有抗生素存在于所述流體樣品中的情況下，所述檢驗(yàn)微生物得以生長(zhǎng)；以及(c)用所述指示劑探測(cè)所述檢驗(yàn)微生物的生長(zhǎng)或?qū)ζ渖L(zhǎng)的抑制，其特征在于，向所述檢驗(yàn)培養(yǎng)基和/或所述流體樣品中加入了金屬鹽，其中，所述金屬的化合價(jià)至少為2，并且所述金屬鹽在20℃時(shí)在水中具有至少0.02M的溶解度。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述指示劑為至少一種pH指示劑和/或至少一種氧化還原指示劑。6.如權(quán)利要求4至5中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，將對(duì)其中抗生素進(jìn)行測(cè)定的所述流體是尿液或血液。7.如權(quán)利要求4至6中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述金屬是堿土金屬和/或鑭系元素。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述堿土金屬是鈣。9.如權(quán)利要求4至8中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述檢驗(yàn)培養(yǎng)基和/或所述流體樣品中所述金屬鹽的濃度不超過(guò)1M。10.如權(quán)利要求4至9中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述金屬鹽加入到所述流體樣品中。11.適合對(duì)流體中抗生素進(jìn)行測(cè)定的試劑盒，其中包含(a)至少一種容器，其中至少部分裝有檢驗(yàn)培養(yǎng)基，所述檢驗(yàn)培養(yǎng)基包含檢驗(yàn)微生物以及至少一種指示劑，以及；(b)金屬鹽，其中，所述金屬的化合價(jià)至少為2，并且所述金屬鹽在20℃時(shí)在水中具有至少0.02M的溶解度，或者，包含權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的檢驗(yàn)培養(yǎng)基。12.如權(quán)利要求11所述的試劑盒，進(jìn)一步包含溫度調(diào)節(jié)設(shè)備，所述設(shè)備適于將檢驗(yàn)樣品保持為預(yù)先設(shè)定的溫度。13.如權(quán)利要求11至12中任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其還進(jìn)一步包含載有計(jì)算機(jī)程序的數(shù)據(jù)載體，所述程序適于引導(dǎo)計(jì)算機(jī)對(duì)從樣品讀取設(shè)備獲得的數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行分析。14.如權(quán)利要求11至13中任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述金屬鹽以藥片或紙盤或水溶液形式存在。15.金屬鹽在微生物抑制檢驗(yàn)中的用途。16.金屬鹽的用途，用于在微生物抑制檢驗(yàn)中對(duì)所述樣品中是否存在抗生素進(jìn)行測(cè)定之前，對(duì)樣品進(jìn)行處理。全文摘要本發(fā)明提供了一種檢驗(yàn)培養(yǎng)基，其中包含檢驗(yàn)微生物、指示劑和以離子化形式存在的金屬，其中，所述金屬的化合價(jià)至少為2，所述金屬的濃度在0.001M至1M之間。此外，本發(fā)明還提供了用于測(cè)定抗生素存在情況的方法，其特征在于，向所述檢驗(yàn)培養(yǎng)基和/或所述流體樣品中加入金屬鹽。最后，本發(fā)明還提供了適于測(cè)定流體中是否存在抗生素的試劑盒。文檔編號(hào)C12Q1/18GK1849399SQ200480026119公開日2006年10月18日申請(qǐng)日期2004年9月6日優(yōu)先權(quán)日2003年9月11日發(fā)明者埃迪特·瑪達(dá)·露西雅·格吉帕,雅各布斯·斯塔克申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司