專利名稱：醋酸菌的乙醇脫氫酶基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個來源于微生物的編碼具有生長促進功能蛋白的基因、一種擴增了該基因拷貝數(shù)目的微生物、特別是屬于醋酸桿菌屬(Acetobacter)的醋酸菌或者屬于葡糖酸醋酸桿菌屬(Gluconacetobacter)的醋酸菌，以及一種使用這些微生物有效生產(chǎn)含高濃度醋酸的醋的方法。
背景技術(shù)：
醋酸菌是廣泛應(yīng)用于醋生產(chǎn)的微生物。特別地，屬于醋酸桿菌屬的醋酸菌或者屬于葡糖酸醋酸桿菌屬的醋酸菌可用于工業(yè)醋酸發(fā)酵。
在醋酸發(fā)酵中，培養(yǎng)基中的乙醇被醋酸菌氧化并轉(zhuǎn)變?yōu)榇姿?，從而在培養(yǎng)基中富集醋酸。然而，醋酸對醋酸菌具有抑制作用。當(dāng)富集的醋酸量增加并且培養(yǎng)基中的醋酸濃度增高時，醋酸菌的生長能力與發(fā)酵能力逐漸降低。
特別地，生長誘導(dǎo)期，即直至醋酸菌真正開始生長，此后才可能確認(rèn)醋酸富集的這段時期，將隨醋酸濃度的增高而變得更長。
因此期望在醋酸發(fā)酵中，甚至在高濃度醋酸的條件下也能夠進一步縮短生長誘導(dǎo)期。作為實現(xiàn)該目標(biāo)的一種方式，通過向發(fā)酵液中添加PQQ(4，5-二氫-4，5-二氧代-1-吡咯并[2，3-f]醌-2，7，9-三羧酸)以促進生長進而縮短所謂的生長誘導(dǎo)期(例如，參見專利文獻1)的方法已有報道。
然而，大量獲得PQQ比較困難，而且PQQ價格昂貴。因而以工業(yè)規(guī)模實現(xiàn)這種方法時總是會遇到問題。因此，嘗試通過促進醋酸菌的生長、克隆那些編碼具有能夠縮短所謂生長誘導(dǎo)期功能的蛋白的基因(生長促進基因)、以及使用這些生長促進基因，來選育并改良醋酸菌。
然而，迄今為止還沒有分離到與醋酸菌生長促進相關(guān)的基因。在這種情況下，期望分離到新的生長促進基因，它所編碼的蛋白具有在實際應(yīng)用水平上促進醋酸菌生長、縮短生長誘導(dǎo)期的功能，并期望選育出通過使用生長促進基因而具有更強生長功能的醋酸菌。
專利文獻1特開昭61-58584A(1986)專利文獻2特開昭60-9488A(1985)專利文獻3特開昭60-9489A(1985)專利文獻4特願2003-350265的說明書非專利文獻1“Biochimica et Biophysica Acta，”vol.1088，pp.292-300，1991非專利文獻2“Applied and Environmental Microbiology，”vol.55，pp.171-176，1989非專利文獻3“Agricultural and Biological Chemistry，”vol.52，pp.3125-3129，1988非專利文獻4“Agricultural and Biological Chemistry，”vol.49，pp.2091-2097，1985非專利文獻5“Bioscience，Biotechnology and Biochemistry，”vol.58，pp.974-975，1994非專利文獻6“European Journal of Biochemistry，”vol.254，pp.356-362，1998非專利文獻7“Method in Enzymology，”vol.89，pp.450-457，1982非專利文獻8“Method in Enzymology，”vol.89，pp.491-496，1982非專利文獻9“Cellulose”pp.153-158，1989發(fā)明的簡要描述如上所述，諸如在基因水平上對醋酸菌生長促進功能進行闡述，或者對具有高生長促進功能的實用醋酸菌進行開發(fā)之類的成功案例尚未見報道。因此，本發(fā)明的目標(biāo)是分離一種新的乙醇脫氫酶基因，其所編碼的蛋白能夠在實際應(yīng)用水平上提高生長促進功能、使用該乙醇脫氫酶基因選育出具有更好生長促進功能的醋酸菌、并提供使用該醋酸菌有效生產(chǎn)含更高濃度醋酸的醋的方法。
我們提出一個假設(shè)在那些即使存在醋酸也能夠生長發(fā)酵的醋酸菌中有一種特殊的生長促進基因(在其它微生物中不存在)。我們進而構(gòu)思了新穎的想法通過應(yīng)用這樣的基因能夠比此前的方法進一步提高微生物的生長促進功能，而且能夠開發(fā)出比以前的方法更有效生產(chǎn)含高濃度醋酸的醋的方法。從而我們完成了本發(fā)明。
本發(fā)明如下所述。
(1)一種蛋白ADH，它可以是下述(A)或(B)中的任意一個(A)蛋白ADH，具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；或者(B)蛋白ADH，其由SEQ ID NO2所示的氨基酸序列通過一個或幾個氨基酸的替換、缺失、插入、添加或者倒置所衍生的氨基酸序列所組成，并具有乙醇脫氫酶活性。
(2)一種基因的DNA，其編碼下述蛋白ADH(A)或(B)中任意一個。
(A)蛋白ADH，其具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；或者(B)蛋白ADH，其由SEQ ID NO2所示的氨基酸序列通過一個或幾個氨基酸的替換、缺失、插入、添加或者倒置所衍生的氨基酸序列所組成，并具有乙醇脫氫酶活性。
(3)一種基因，其由下述DNA(A)、(B)或(C)組成。
(A)一種DNA，它包含由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列中Nos.359位到1390位核苷酸組成的核苷酸序列，(B)一種DNA，它在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能夠與由與SEQ ID NO1所示的核苷酸序列中Nos.359位到1390位核苷酸組成的DNA的互補核苷酸序列組成的DNA雜交，并編碼具有乙醇脫氫酶活性的蛋白ADH；或者(C)一種DNA，它在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能夠與由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列中Nos.359位到1390位核苷酸組成的DNA的一部分所制備的探針的核苷酸序列組成的DNA雜交，并編碼具有乙醇脫氫酶活性的蛋白ADH。
(4)一個重組載體，其含有(2)或(3)中的DNA。
(5)一種轉(zhuǎn)化子，其含有(4)中的重組載體。
(6)一種微生物，其具有通過在細(xì)胞內(nèi)擴增(2)或(3)所述的DNA的拷貝數(shù)所增強的乙醇脫氫酶活性。
(7)(6)中的微生物，該微生物是屬于醋酸桿菌屬或者葡糖酸醋酸桿菌屬的醋酸菌。
(8)一種生產(chǎn)醋的方法，它包括在含乙醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)(6)或(7)中的微生物，并促使微生物在培養(yǎng)基中生產(chǎn)并富集醋酸。
(9)通過(8)中的方法獲得的含有高濃度醋酸的醋。
(10)(9)中的醋，其中醋酸濃度為10％至13％。
根據(jù)本發(fā)明，賦予微生物生長促進功能并增強該功能是可能的。進一步，對于能夠氧化乙醇的微生物，尤其是對醋酸菌，可賦予他們顯著縮短生長誘導(dǎo)期及在培養(yǎng)基中有效富集高濃度醋酸的能力。
附圖的簡要描述

圖1是來源于Gluconacetobacter entanii的基因片段(pP1)的限制性內(nèi)切酶圖譜示意圖。
圖2顯示的是含有來源于Gluconacetobacter entanii的多拷貝的、NAD依賴的乙醇脫氫酶基因的轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵過程。
圖3顯示的是來源于Gluconacetobacter entanii的、NAD依賴的乙醇脫氫酶基因所編碼蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖4顯示的是引物1的核苷酸序列。
圖5顯示的是引物2的核苷酸序列。
下文將就本發(fā)明進行詳細(xì)說明。本申請要求2003年3月12日提交的日本專利申請No.2003-66697的優(yōu)先權(quán)，并包括該專利申請說明書和/或附圖中所述的內(nèi)容。
對從醋酸菌中發(fā)現(xiàn)生長促進基因的方法進行了細(xì)致的研究，結(jié)果，通過構(gòu)建醋酸菌的染色體DNA文庫、利用該文庫轉(zhuǎn)化醋酸菌、然后篩選能夠使菌株在含1％醋酸的瓊脂糖培養(yǎng)基上在3天內(nèi)長成的基因——而菌株在同樣的培養(yǎng)基上一般需要4天長成，我們開發(fā)出一種用來從醋酸菌中分離生長促進基因的方法。
通過使用這個方法，我們從已實際用于醋生產(chǎn)的屬于葡糖酸醋酸桿菌屬的醋酸菌中，第一次成功克隆到一個能在實際應(yīng)用水平上提高生長促進功能的、新的乙醇脫氫酶基因(在下文中也稱為adh基因)。
DDBJ/EMBL/Genbank及SWISS-PROT/PIRd的同源性搜索結(jié)果表明，所獲得的adh基因與大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的adhP基因、Shinorhizobium meliloti中的adhA基因及其它類似基因所產(chǎn)生的一類蛋白具有一定程度的同源性。這暗示adh基因是醋酸菌的一種乙醇脫氫酶基因。
然而，本發(fā)明的adh基因與迄今為止所報道的Acetobacterpolyoxogenes中的adh基因(例如，參見非專利文獻1)在氨基酸序列水平上僅有6.4％的極低同源性。此外，本發(fā)明中adh基因的預(yù)測分子量與非專利文獻1中報道的adh基因的預(yù)測分子量也差異顯著。因此，可以確認(rèn)本發(fā)明的adh基因與迄今所報道的作為膜蛋白的任何一種adh基因有明顯不同。
進一步地，本發(fā)明的adh基因與大腸桿菌的adhP基因在氨基酸序列水平上有39％的同源性，與Shinorhizobium meliloti的adhA基因在氨基酸序列水平上有56％的同源性。由于這種同源性程度極低，可以進一步證明本發(fā)明的adh基因雖然與其它原核生物的adh基因有些類似，但卻是一個編碼一種新的醋酸菌特異性蛋白(也稱作ADH蛋白)的全新基因。
在本發(fā)明中，通過將adh基因連接到質(zhì)粒載體上然后用該載體轉(zhuǎn)化醋酸菌來制備具有多拷貝adh基因的轉(zhuǎn)化子。由于在轉(zhuǎn)化子中乙醇脫氫酶活性增強了約54倍，因此可以確認(rèn)該基因編碼具有醋酸菌乙醇脫氫酶活性的蛋白。
我們還發(fā)現(xiàn)在存在乙醇時進行通風(fēng)培養(yǎng)，醋酸發(fā)酵能力，尤其是生長促進功能，顯著提高了；而且生長誘導(dǎo)期也縮短了。因此，可以有效生產(chǎn)含高濃度醋酸的醋。從而，我們完成了本發(fā)明。
本發(fā)明將在以下各項中詳細(xì)描述。
(1)本發(fā)明的DNA本發(fā)明的DNA與大腸桿菌的adh基因或其它類似基因具有一定程度的同源性，并包含編碼乙醇脫氫酶的核苷酸序列，該酶具有序列表中SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，能夠提高生長促進功能。本發(fā)明的DNA包含調(diào)節(jié)元件與結(jié)構(gòu)基因。
本發(fā)明的DNA可以按下文所述從Gluconacetobacter entanii的染色體DNA獲得。
首先，制備Gluconacetobacter entanii，例如Acetobacteraltoacetigenes MH-24菌株(于1984年2月23日以保藏號FERMBP-491保藏，(原始保藏)在國際專利生物保藏機構(gòu)(Tsukuba Central6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaragi，Japan)，獨立行政法人工業(yè)技術(shù)綜合研究所(AIST)特許生物寄托中心)的染色體DNA文庫。此外，染色體DNA通過常規(guī)方法(例如，參見專利文獻3)獲得。
接下來，為了從獲得的染色體DNA中分離乙醇脫氫酶基因，構(gòu)建一個染色體DNA文庫。第一步，使用限制性內(nèi)切酶對染色體DNA進行部分消化以獲得不同大小片段的混合物。在調(diào)節(jié)剪切反應(yīng)時間及其它類似的反應(yīng)條件以調(diào)節(jié)剪切程度的過程中，可使用限制性內(nèi)切酶的寬范圍模式。例如，在不同反應(yīng)時間(1分鐘至2小時)及酶濃度也在1至100單位/ml的范圍內(nèi)變動的條件下，通過Sau3A I在30℃或更高溫度下，優(yōu)選的是37℃作用于DNA來消化染色體DNA。此外，在下文所示的實施例中也使用了Pst I。
接下來，這些剪切的染色體DNA片段連接到可在醋酸菌中自主復(fù)制的載體DNA上，從而構(gòu)建重組載體。特別地，在37℃及酶濃度在1至10單位/ml的范圍內(nèi)反應(yīng)1或幾個小時的條件下，可使用限制性內(nèi)切酶(例如Pst I，它可生成與使用了限制性內(nèi)切酶Pst I所剪切的染色體DNA相互補的末端核苷酸序列)作用于載體DNA，從而完全消化并剪切載體DNA。
接下來，上文獲得的染色體DNA片段的混合物與剪切的載體DNA混合，然后在溫度4℃至16℃、酶濃度1至100單位/ml、反應(yīng)時間1小時以上(優(yōu)選的6至24小時)的條件下，加入T4DNA連接酶進行反應(yīng)，從而獲得重組載體。
使用所獲得的重組載體進行轉(zhuǎn)化在含濃度為1％醋酸的瓊脂糖培養(yǎng)基上一般需4天才能長成的醋酸菌，例如醋化醋桿菌(Acetobacteraceti)No.1023菌株(于1983年6月27日以保藏號FERM BP-2287保藏，(原始保藏)獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心(Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaragi，Japan))。然后，產(chǎn)物涂布在含1％醋酸的瓊脂糖培養(yǎng)基上，隨后培養(yǎng)3天。生成的菌落轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。從得到的菌體細(xì)胞中收集質(zhì)粒，這樣便獲得了含adh基因的DNA片段。
本發(fā)明DNA的特定實施例是序列表中SEQ ID NO1的核苷酸序列。在此DNA中，含Nos.359位至1390位核苷酸的核苷酸序列是一個編碼區(qū)。
DDBJ/EMBL/Genbank及SWISS-PROT/PIR的同源性搜索結(jié)果表明，序列表中SEQ ID NO1所示的核苷酸序列或者序列表中SEQ IDNO2(對應(yīng)于圖3核苷酸Nos.359位至1390位)所示的氨基酸序列與大腸桿菌的adhP基因在氨基酸水平上具有39％的同源性，與Shinorhizobium moliloti的adhA基因在氨基酸水平上具有56％的同源性。從而，推斷出相應(yīng)的基因編碼一種蛋白ADH。然而，由于兩個同源性只有60％或更低，清晰表明該基因是一個與這些基因不同的新基因。
此外，已有從醋酸菌Acetobacter polyoxogenes中獲得adh基因的報道(例如，參見非專利文獻1)。在這個案例中adh基因編碼的蛋白與由核苷酸Nos.359位至1390位組成的核苷酸序列所編碼的蛋白，其氨基酸序列的同源性極低，僅為6.4％。本發(fā)明的基因與已知的adh基因明顯不同，顯然是醋酸菌的一個新的adh基因。
本發(fā)明DNA的核苷酸序列已經(jīng)闡明。因此，可以通過，例如使用Gluconacetobacter entanii的基因組DNA作為模板、及基于核苷酸序列合成的寡核苷酸作為引物的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR反應(yīng))，或者通過使用基于核苷酸序列合成的寡核苷酸作為探針的雜交來獲得DNA。
寡核苷酸可以按照常規(guī)方法合成，例如，多種商業(yè)化的DNA合成儀來合成。進一步地，PCR反應(yīng)可以使用Applied Biosystems公司生產(chǎn)的Thermal Cycler Gene Amp PCR system 9700、Taq DNA聚合酶(由TAKARA BIO INC.生產(chǎn))、KOD-Plus-(由TOYOBO CO.，LTD.生產(chǎn))及其它類似物按照常規(guī)方法進行。
本發(fā)明中編碼具有生長促進功能蛋白ADH的DNA，只要乙醇脫氫酶活性或者所編碼的蛋白ADH的生長促進功能沒有退化，可以是編碼通過1個或幾個氨基酸在1個或多個位置缺失、替換、插入或者添加或倒置所得到的蛋白的任意DNA。
還可以通過，例如，定點誘變、特別通過特定位點上氨基酸的缺失、替換、插入或者添加或倒置對核苷酸序列進行改變，來獲得這種編碼與具有生長促進功能的乙醇脫氫酶幾乎完全相同的蛋白ADH的DNA。此外，也可以通過已知的傳統(tǒng)誘變處理來獲得上文的改變的DNA。
進一步地，已知蛋白的氨基酸序列與編碼蛋白的核苷酸序列在種間、菌株間、變型間及變種間會略有不同。編碼基本上完全相同的蛋白的DNA可以從全部醋酸菌中獲得，尤其是那些來自醋酸桿菌屬或者葡糖酸醋酸桿菌屬的種、菌株、變型及變種。
特別地，在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與，例如，由與Nos.359位至1390位(序列表中SEQ ID NO1的核苷酸序列)核苷酸所組成的核苷酸序列互補的核苷酸序列組成的DNA，或者具有由Nos.359位至1390位(序列表中SEQ ID NO1的核苷酸序列)核苷酸所組成的核苷酸序列的一部分所制備的探針的核苷酸序列組成的DNA，進行雜交、并編碼對醋酸具有增強抗性功能的蛋白的DNA，是從醋酸桿菌屬或葡糖酸醋酸桿菌屬的醋酸菌、醋酸桿菌屬或葡糖酸醋酸桿菌屬的突變醋酸菌、或者其自發(fā)突變的菌株或者變種中分離到的。以這種方式，也可以獲得編碼與所述蛋白基本上完全相同的蛋白的DNA。此處所用的術(shù)語“嚴(yán)謹(jǐn)條件”指在此條件下可以形成所謂的特異性雜交而不形成非特異性雜交。很難使用數(shù)值來精確描述這種條件。這種條件的實施例包括在此條件下，具有高同源性的核苷酸序列，例如，DNA具有70％或以上的同源性，能夠相互雜交；而同源性低于這個水平的核苷酸序列不會彼此雜交。其它此類實施例包括雜交的一般洗脫條件，例如在此條件下，在60℃、鹽濃度為1×SSC，0.1％SDS的溶液中進行清洗。
(2)本發(fā)明中的醋酸菌本發(fā)明的醋酸菌屬于醋酸桿菌屬或者葡糖酸醋酸桿菌屬，這二者對醋酸均具有增強的抗性。
醋酸桿菌屬細(xì)菌的具體實施例包括諸如醋化醋桿菌No.1023菌株(由國際專利生物保藏機構(gòu)以FERM BP-2287保藏，)、醋化醋桿菌木糖亞種(Acetobacter aceti xylinum)IFO3288菌株及醋化醋桿菌IFO3283株這樣的醋化醋桿菌。
進一步地，葡糖酸醋酸桿菌屬細(xì)菌的實施例包括Gluconacetobacter europaeus DSM6160菌株以及諸如目前由國際專利生物保藏機構(gòu)以FERM BP-491保藏的Acetobacter altoacetigenes MH-24菌株這樣的Gluconacetobacter entanii。
通過，例如，將含有結(jié)構(gòu)基因的DNA片段與在醋酸桿菌屬細(xì)菌中能夠有效發(fā)揮功能的啟動子序列連接為重組DNA，使用該重組DNA轉(zhuǎn)化醋酸桿菌屬的細(xì)菌或者擴增adh基因在細(xì)胞中的拷貝數(shù)，來增強生長促進功能。
還可以通過使用在醋酸桿菌屬或者葡糖酸醋酸桿菌屬的醋酸菌中能夠有效發(fā)揮功能的另一個啟動子序列，來替換染色體DNA上基因的啟動子序列，由此增強生長促進功能。實施例包括來源于非醋酸菌微生物的啟動子序列，譬如大腸桿菌質(zhì)粒pBR322(由TAKARA BIOINC.生產(chǎn))的氨芐青霉素抗性基因、質(zhì)粒pHSG298(由TAKARA BIOINC.生產(chǎn))的卡那霉素抗性基因、質(zhì)粒pHSG396(由TAKARA BIO INC.生產(chǎn))的氯霉素抗性基因及β-半乳糖苷酶基因上的啟動子。
可以通過將含有基因的多拷貝載體導(dǎo)入醋酸桿菌屬的醋酸菌細(xì)胞中來擴增細(xì)胞內(nèi)該基因的拷貝數(shù)。特別地，擴增可以通過將含該基因的質(zhì)粒、含該基因的轉(zhuǎn)座子或其它類似物導(dǎo)入醋酸桿菌屬或葡糖酸醋酸桿菌屬的醋酸菌細(xì)胞中來進行。
多拷貝載體(醋酸菌-大腸桿菌穿梭載體)的實例包括pMV24(例如，參見非專利文獻2)、pGI18(例如，參見專利文獻4)、pUF106(例如，參見非專利文獻9)、pTA5001(A)及pTA5001(B)(例如，參見專利文獻2)。此處的另一個實例是pMVL1(例如，參見非專利文獻3)，它是一個染色體整合載體。此外，轉(zhuǎn)座子的實例包括Mu與IS1452。
DNA可以通過氯化鈣法(例如，參見非專利文獻4)、電轉(zhuǎn)化法(例如，參見非專利文獻5)或類似方法導(dǎo)入醋酸桿菌屬或葡糖酸醋酸桿菌屬的醋酸菌中。
轉(zhuǎn)化子通過將重組質(zhì)粒導(dǎo)入醋化醋桿菌No.1023(FERM BP-2287)來獲得。這樣的重組質(zhì)粒含有至少一段具有序列表中SEQ IDNO1表示的核苷酸序列的DNA片段，譬如將上述的DNA片段插入到醋酸菌-大腸桿菌穿梭載體(多拷貝載體)pMV24而制備的重組質(zhì)粒pADH1。
在具有氧化乙醇能力的醋酸桿菌屬或葡糖酸醋酸桿菌屬的醋酸菌中當(dāng)乙醇脫氫酶活性如上所述得到增強時，生長促進功能也得到增強，并且生長誘導(dǎo)期縮短了，因此可以有效生產(chǎn)含高濃度醋酸的醋。
(3)生產(chǎn)醋的方法通過上述的擴增adh基因拷貝數(shù)的方法可獲得生長促進功能得到選擇性增強的醋酸桿菌屬或葡糖酸醋酸桿菌屬的醋酸菌。這類能夠氧化乙醇的醋酸菌在含有乙醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，隨后會在培養(yǎng)基中產(chǎn)生并富集醋酸，從而可以有效生產(chǎn)含高濃度醋酸的醋。
本發(fā)明生產(chǎn)方法中的醋酸發(fā)酵可以按照與常規(guī)的使用醋酸菌發(fā)酵生產(chǎn)醋時所用方法相類似的方式來進行。不論是合成的還是天然培養(yǎng)基，只要含有碳源、氮源、無機物與乙醇，以及，如果需要，還含有適量微生物菌株進行生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，都可以用作醋酸菌發(fā)酵的培養(yǎng)基。
碳源的實施例包括多種碳水化合物，譬如葡萄糖、蔗糖及多種有機酸?？梢允褂闷┤绲鞍纂诉@樣的天然氮源及發(fā)酵微生物的分解產(chǎn)物作為氮源。
進一步地，培養(yǎng)在諸如靜置培養(yǎng)方法、搖床培養(yǎng)方法及通風(fēng)振蕩培養(yǎng)方法這樣的有氧條件下進行。培養(yǎng)在溫度為20℃至40℃的范圍內(nèi)進行，優(yōu)選的為25℃至35℃，一般為30℃。培養(yǎng)基的pH值一般在2.5至7之間，優(yōu)選的為2.7至6.5。pH值可以使用多種酸、多種核苷酸、緩沖液及其它類似物來調(diào)節(jié)。一般經(jīng)1至21天的培養(yǎng)，可在培養(yǎng)基中富集高濃度的醋酸。使用這種方法獲得的醋中醋酸濃度范圍為10％至13％。
優(yōu)選實施例的詳細(xì)描述將通過實施例對本發(fā)明做進一步詳細(xì)描述。
(實施例1)從Gluconacetobacter entanii中克隆具有生長促進功能的基因并測定其核苷酸序列及氨基酸序列(1)染色體DNA文庫的構(gòu)建30℃條件下，在添加了6％醋酸與4％乙醇的YPG培養(yǎng)基(3％葡萄糖，0.5％酵母提取物及0.2％聚胨)中以搖床培養(yǎng)方式培養(yǎng)Acetobacter altoacetigenes MH-24菌株(FERM BP-491)，一株Gluconacetobacter entanii。培養(yǎng)后，離心培養(yǎng)基(7500×g，10分鐘)以收集菌體細(xì)胞。從所獲得的菌體細(xì)胞中，通過染色體DNA制備方法(例如，參見專利文獻3)制備染色體DNA。
上文獲得的染色體DNA用限制性內(nèi)切酶Pst I(由TAKARA BIOINC.生產(chǎn))部分消化。使用限制性內(nèi)切酶Pst I完全消化大腸桿菌-醋酸菌穿梭載體pMV24。將適量的這些DNA混合并用連接試劑盒(TAKARA DNA Ligation Kit Ver.2，由TAKARA BIO INC.生產(chǎn))進行連接，從而構(gòu)建了一個Gluconacetobacter entanii的染色體DNA文庫。
(2)具有生長促進功能的基因的克隆按上文所述所獲得的Gluconacetobacter entanii的染色體DNA文庫轉(zhuǎn)化到在含1％醋酸的瓊脂糖培養(yǎng)基上一般需4天長成的醋化醋桿菌No.1023菌株中，然后在含1％醋酸及100μg/ml氨芐青霉素的YPG瓊脂糖培養(yǎng)基上于30℃培養(yǎng)3天。接種3天內(nèi)形成的菌落并在含100μg/ml氨芐青霉素的YPG培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后從所獲得的菌體細(xì)胞中收集質(zhì)粒。如圖1所示，所克隆的是一條大約1.7-kbp的Pst I片段，質(zhì)粒命名為pP1。此外，可以進一步證實致使醋化醋桿菌No.1023菌株在含1％醋酸的YPG瓊脂糖培養(yǎng)基上于3天內(nèi)長成的片段，是克隆到pP1中的約1.7-kbp的Pst I片段上的一段約為1.2-kbp的Bgl I片段。
如上所述，獲得了使得醋化醋桿菌No.1023菌株在含1％醋酸的瓊脂糖培養(yǎng)基上于3天內(nèi)長成的基因片段，而該菌株在含1％醋酸的此種瓊脂糖培養(yǎng)基上通常需4天長成。
(3)測定克隆DNA片段的核苷酸序列上述克隆的PstI片段插入到pUC19的Pst I位點，然后利用Sanger的雙脫氧鏈終止法來測定片段的核苷酸序列。從而測定了SEQ IDNO1的核苷酸序列。通過使所有的剪切點都相互交疊，對兩條DNA鏈的全部區(qū)域都進行了測序。
在SEQ ID NO1的核苷酸序列中，確認(rèn)存在一個由No.359位核苷酸至No.1390位核苷酸構(gòu)成的編碼在SEQ ID NO2(圖3)中描述的344個氨基酸的開放閱讀框。
(實施例2)在來源于Gluconacetobacter entanii的具有生長促進功能的基因所轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子中縮短生長誘導(dǎo)期的效果(1)轉(zhuǎn)化到醋化醋桿菌中上文所克隆的來源于Acetobacter altoacetigenes MH-24菌株(FERM BP-491)的具有生長促進功能的基因通過使用KOD-Plus-(由TOYOBO CO.，LTD.生產(chǎn))的PCR方法進行擴增。所獲得的DNA片段插入到醋酸菌-大腸桿菌穿梭載體pMV24(例如，參見非專利文獻2)的限制性內(nèi)切酶SmaI酶切位點上，從而制備質(zhì)粒pADH1。插入到pADH1中的擴增片段如圖1所示。圖1所示的是使用PstI進行克隆的來源于Gluconacetobacter entanii的基因片段(pP1)的限制性內(nèi)切酶圖譜、具有生長促進功能的基因的位置，及插入到pADH1中的片段。
PCR方法按下文詳細(xì)說明進行。具體說來，在下述使用Acetobacteraltoacetigenes MH-24菌株的基因組DNA作為模板、引物1(其核苷酸序列在SEQ ID NO3(圖4)中所示)、引物2(其核苷酸序列在SEQ ID NO4(圖5)中所示)、及KOD-Plus-(由TOYOBO CO.，LTD.生產(chǎn))的PCR反應(yīng)條件下進行PCR反應(yīng)。
具體地，PCR方法進行30個循環(huán)，每循環(huán)包括94℃15秒，60℃30秒及68℃1分鐘。
pADH1通過電轉(zhuǎn)化法(例如，參見非專利文獻5)轉(zhuǎn)到醋化醋桿菌No.1023菌株中。轉(zhuǎn)化子通過添加了100μg/ml氨芐青霉素及1％醋酸的YPG瓊脂糖培養(yǎng)基進行篩選。
從3天內(nèi)在選擇培養(yǎng)基上長成的具有氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒，然后按照常規(guī)方法進行分析。從而，可以確認(rèn)菌株含有具有生長促進功能基因的質(zhì)粒。
(2)轉(zhuǎn)化子的生長促進功能根據(jù)在添加了醋酸的YPG培養(yǎng)基上的生長比較上文獲得的含有質(zhì)粒pADH1的具有氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子與僅使用穿梭質(zhì)粒pMV24轉(zhuǎn)化的原始醋化醋桿菌No.1023菌株。
具體地，搖床培養(yǎng)(150rpm)是在含有3％醋酸、3％乙醇及100μg/ml氨芐青霉素的100ml YPG培養(yǎng)基中于30℃進行的。通過測量660nm處的吸光度來比較轉(zhuǎn)化子與原始菌株在添加了醋酸的培養(yǎng)基中的生長。
結(jié)果如圖2所示，可以確認(rèn)在添加了3％醋酸與3％乙醇的培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)化子比原始醋化醋桿菌No.1023菌株生長更快。進一步證實了基因能夠增強生長促進功能的效果。
(3)轉(zhuǎn)化子與原始菌株的多種酶活對于含有質(zhì)粒pADH1且具有氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子與僅使用穿梭質(zhì)粒pMV24轉(zhuǎn)化的原始醋化醋桿菌No.1023菌株，通過用于細(xì)菌的改進的方法(例如，參見非專利文獻6)來測定NAD依賴的乙醇脫氫酶活性。確切地，將適量的破碎細(xì)胞懸浮液加入到1ml含有25mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)、500mM乙醇及1.5mM NAD+的反應(yīng)混合液中，然后在25℃測定340nm處的吸光度。規(guī)定1個單位的酶活相當(dāng)于每分鐘產(chǎn)生NADH量為1μmol。此外，通過用于醋酸菌的方法(例如，參見非專利文獻7)來測定膜結(jié)合的乙醇脫氫酶活性，通過用于醋酸菌的方法(例如，參見非專利文獻8)來測定膜結(jié)合的乙醛脫氫酶活性。結(jié)果如表1所示。
表1
基于表1的結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子中膜結(jié)合的乙醇脫氫酶活性與膜結(jié)合的乙醛脫氫酶活性同原始醋化醋桿菌No.1023菌株中這些酶活性在同一個水平。然而，轉(zhuǎn)化子具有比原始菌株高約54倍的NAD依賴的乙醇脫氫酶活性。因此，可以確認(rèn)所克隆的基因是編碼NAD依賴的乙醇脫氫酶的adh基因。
(實施例3)含有來源于Gluconacetobacter entanii的adh基因的轉(zhuǎn)化子的醋酸發(fā)酵試驗實施例2中獲得的含質(zhì)粒pADH1且具有氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子與僅具有穿梭質(zhì)粒pMV24的原始醋化醋桿菌No.1023菌株根據(jù)醋酸發(fā)酵能力進行比較。
具體地，使用裝有2.5升含1％醋酸、4％乙醇與100μg/ml氨芐青霉素的YPG培養(yǎng)基的5升小型發(fā)酵罐(由Mitsuwa Scientific Corp.生產(chǎn)；KNJ-5A)進行通氣振蕩培養(yǎng)(30℃，400rpm，0.20vvm)。使菌株發(fā)酵從而使醋酸濃度達到3％。隨后從小型發(fā)酵罐中移走培養(yǎng)基僅余下700ml培養(yǎng)基。向余下的700ml培養(yǎng)基中添加1.8升含醋酸、乙醇及100μg/ml氨芐青霉素的YPG培養(yǎng)基。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基使其中醋酸與乙醇的濃度分別為3％與4％，然后重新開始醋酸發(fā)酵。繼續(xù)進行通氣振蕩培養(yǎng)，在發(fā)酵過程中添加乙醇使培養(yǎng)基中的乙醇濃度維持在1％。轉(zhuǎn)化子與原始菌株根據(jù)醋酸發(fā)酵能力來進行比較。結(jié)果總結(jié)在表2中。
表2
基于表2的結(jié)果，轉(zhuǎn)化子的生長誘導(dǎo)期同原始菌株的相比較有顯著縮短。因此，可以確認(rèn)轉(zhuǎn)化子能夠有效地進行醋酸發(fā)酵。
(實施例4)含有來源于Gluconacetobacter entanii的adh基因的轉(zhuǎn)化子的醋酸發(fā)酵試驗(1)轉(zhuǎn)化到Acetobacter altoacetigenes中來源于Acetobacter altoacetigenes MH-24菌株(FERM BP-491)的具有生長促進功能的基因，通過使用KOD-Plus-(由TOYOBO CO.，LTD.生產(chǎn))的PCR方法進行擴增。使用限制性內(nèi)切酶Sma I剪切醋酸菌-大腸桿菌穿梭載體pGI18后(例如，參見專利文獻4)，將所擴增的DNA片段插入到該位點，從而制備質(zhì)粒pADH2。插入到pADH2中的擴增片段如圖1所示。圖1所示的是使用Pst I進行克隆的來源于Gluconacetobacter entanii-的基因片段(pP1)的限制性內(nèi)切酶圖譜、具有生長促進功能的基因的位置，及插入到pADH2中的片段。
PCR方法按下文詳細(xì)說明進行。具體地，在下述使用Acetobacteraltoacetigenes MH-24菌株的基因組DNA作為模板、引物1(其核苷酸序列在SEQ ID NO3(圖4)中所示)、引物2(其核苷酸序列在SEQ ID NO4(圖5)中所示)、及KOD-Plus-(由TOYOBO CO.，LTD.生產(chǎn))的PCR反應(yīng)條件下進行PCR反應(yīng)。
具體地，PCR方法進行30個循環(huán)，每循環(huán)包括94℃15秒，60℃30秒及68℃1分鐘。
PADH2通過電轉(zhuǎn)化法(例如，參見非專利文獻5)轉(zhuǎn)到Acetobacteraltoacetigenes MH-24菌株中。轉(zhuǎn)化子通過添加了100μg/ml氨芐青霉素、4％醋酸及3％乙醇的YPG瓊脂糖培養(yǎng)基進行篩選。
從在選擇培養(yǎng)基上長成的具有氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒，然后按照常規(guī)方法進行分析。從而，可以確認(rèn)轉(zhuǎn)化子具有含adh基因的質(zhì)粒。
(2)轉(zhuǎn)化子的醋酸發(fā)酵試驗(1)中獲得的含質(zhì)粒pADH2且具有氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子與僅使用穿梭載體pGI18轉(zhuǎn)化的原始Acetobacter altoacetigenes MH-24菌株根據(jù)醋酸發(fā)酵能力來進行比較。
具體地，使用裝有2.5升含100μg/ml氨芐青霉素的原料培養(yǎng)基(7％醋酸，3％乙醇，0.2％酵母提取物及0.2％葡萄糖)的5升小型發(fā)酵罐(由Mitsuwa Scientific Corp.生產(chǎn)；KNJ-5A)進行通氣振蕩培養(yǎng)(30℃，500rpm，0.20vvm)。在可清楚觀測到菌體生長且殘留乙醇濃度降為2％的時候，加入含有乙醇的培養(yǎng)基(1％醋酸、50％乙醇、0.2％酵母提取物及0.2％葡萄糖)使發(fā)酵液的乙醇濃度控制在2％。通過這種醋酸發(fā)酵方法，對轉(zhuǎn)化子與原始菌株的醋酸發(fā)酵能力進行比較。結(jié)果總結(jié)在表3中。
表3
基于表3的結(jié)果，根據(jù)獲得的醋酸終濃度可以確認(rèn)轉(zhuǎn)化子明顯優(yōu)于原始菌株。
(實施例5)含有來源于Gluconacetobacter entanii的adh基因的轉(zhuǎn)化子的醋酸發(fā)酵試驗
(1)轉(zhuǎn)化到醋化醋桿菌木糖亞種中實施例4中獲得的質(zhì)粒pADH2通過電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)到一株醋化醋桿菌木糖亞種—醋化醋桿菌木糖亞種IFO3288菌株中。使用添加了100μg/ml氨芐青霉素的YPG瓊脂糖培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子。
從生長在選擇培養(yǎng)基上的具有氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒，然后按照常規(guī)方法進行分析。從而，可確認(rèn)菌株具有含參與增強醋酸抗性的基因的質(zhì)粒。
(2)醋酸發(fā)酵試驗在(1)中獲得的含質(zhì)粒pADH2且具有氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子與僅使用穿梭質(zhì)粒pGI18轉(zhuǎn)化的原始醋化醋桿菌木糖亞種IFO3288菌株根據(jù)醋酸發(fā)酵能力進行比較。
具體地，在裝有由17.9％糖化大米溶液、3.2％發(fā)酵的醪、7.8％乙醇與71.1％水混合所制備的原料培養(yǎng)基(7.8％的乙醇濃度與0.26％的醋酸濃度)的5升小型發(fā)酵罐(由Mitsuwa Scientific Corp.生產(chǎn)；KNJ-5A)中進行通氣振蕩培養(yǎng)(30℃，500rpm，0.20vvm)。在7.3％的醋酸濃度下進行連續(xù)發(fā)酵。在7.2％的醋酸濃度下進行連續(xù)發(fā)酵的菌株根據(jù)原料培養(yǎng)基添加速率進行比較。結(jié)果如表4所示。此外，根據(jù)醋酸發(fā)酵能力對菌株進行比較，此時將轉(zhuǎn)化子的原料培養(yǎng)基添加速率調(diào)整為在7.3％醋酸濃度進行連續(xù)發(fā)酵時原始菌株的原料培養(yǎng)基添加速率。結(jié)果如表4所示。
表4
表5
基于表4與表5的結(jié)果，根據(jù)連續(xù)醋酸發(fā)酵、產(chǎn)率(原料培養(yǎng)基添加速率)及所生產(chǎn)醋酸的濃度可以確認(rèn)轉(zhuǎn)化子明顯優(yōu)于原始菌株。
本文所引用的所有出版物、專利與專利申請均全文引入作為參考。
工業(yè)應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明，提供了一種參與醋酸抗性的新基因。進一步地，使用該基因，可獲得高效生產(chǎn)含高濃度醋酸的醋的改良菌株。從而，可提供使用該改良菌株高效生產(chǎn)含高濃度醋酸的醋的方法。
以純文本列出的序列SEQ ID NO3引物SEQ ID NO4引物序列表<110>Mitsukan Group Corporation<120>醋酸菌的乙醇脫氫酶基因<130>PH-1986-PCT<150>JP2003-066697<151>2003-03-12<160>4<210>1<211>1658<212>DNA<213>Gluconacetobacter entanii<400>1ctgcagcatt tcggcattgg cgcgtcatgg ggtgggtatg aaagccttgt gctgcccacc 60acgggcggga tctcgcgttc gtgcctgtcg gttacgggcg cgggaccggc gtgcaggctg 120catgtcgggc tggaagctgg cgggttgctg gtggacgatc tggcgcgtgg tctggatggc 180atgtctgccg cccgcgcagg gcggtggacg gactgacgta gatcaaggtt gcgacggggc 240agggatggga cacttgcccc atacacgatg cccccgtccg gccatgccgg ccgggcgggt 300ggcgcaggga atggtggctc catggccggg gccgtgacat cggaacggaa ggtgcaagat 360ggctggaaag atgaaggctg cggttgtacg ggaattcggc aagccgctga cgatcgagga 420actggacatt ccgcagatca acaccaacca gatcctggtc aaggtcgatg cctgcggcgt 480ctgccatact gacctgcatg ccgcccgtgg cgactggccc accaagccca ggccgccctt 540tatcccgggg cacgagggaa tcggccatgt ggtcgaggtc ggcagcaacg tcaactggat 600caagaccggc gacgtggtgg gcgtgccgtg gctgtattcg gcctgcgggc attgcgaaca 660ctgtctgggc ggatgggaaa ccctgtgtga aaagcaggag gacaccggct attccgtcaa 720tggctgcttt gccgaatatg tggtggccga ccccaattac gtcgcccatc tgccgaaaga 780catcgacccg atcaagacgg cccccgtgct gtgcgcgggg ctgacggtgt acaagggcct 840gaagatgacg gacacccggg ccggggaatg ggtcgccatt tccggcgcgg gcgggcttgg 900gcagatggcc atccagtacg cggtggccat gggcctgaac gtggcggcgg tggatatcag 960cgatgaaaag ctggaagaag cccgcaagct gggcgcgcgc gtgaccgtca acgcgctgaa1020gcaggatccg gtcgcctata tccgcgaaca gaccggcggc acccacggcg tgctggtcac1080cgccgtgtcg gacaaggcgt tcagccaggc ggtgggttac gcgcggcgcg gcggcacggt1140ggtgctgaac ggcctgccgc ccggtgactt cccgctgtcc atctttgaca tggtgatgaa1200tggcacgacc gtgcgcggat ccattgtcgg cacgcggctg gacatgatcg aagccatgtc1260cttcttcact gatggcaagg tgacgacggt ggtcagcacg gacaaactgg aaaacatcaa1320caccattttc gacaacctgc agcatggccg ggtaaaggga cgcgtggtgc tggatttccg1380taacggggcc tgaaacgacg gcagccgcca ccctgatgcc cgttcagggt ggcgtatcgt1440gtaaccggag ggcgcgaacg ggaaagatgc atcccgtcgt cgcgccgccg tggcaagtgg1500
ctgtccgatg taaaacgaca gggttattgc gcattccggc taaaggatgc cgatacgatg1560cagtaatttt tcggacaggt gcgctatttt attgtcgggt cccggtctca ggtcggaaaa1620ttttattttg ggcggattga atttctttat ttctgcag1658<210>2<211>344<212>PRT<213>Gluconacetobacter entanii<400>2Met Ala Gly Lys Met Lys Ala Ala Val Val Arg Glu Phe Gly Lys Pro5 10 15Leu Thr Ile Glu Glu Leu Asp Ile Pro Gln Ile Asn Thr Asn Gln Ile2025 30Leu Val Lys Val Asp Ala Cys Gly Val Cys His Thr Asp Leu His Ala35 4045Ala Arg Gly Asp Trp Pro Thr Lys Pro Arg Pro Pro Phe Ile Pro Gly50 55 60His Glu Gly Ile Gly His Val Val Glu Val Gly Ser Asn Val Asn Trp65 7075 80Ile Lys Thr Gly Asp Val Val Gly Val Pro Trp Leu Tyr Ser Ala Cys8590 95Gly His Cys Glu His Cys Leu Gly Gly Trp Glu Thr Leu Cys Glu Lys100105110Gln Glu Asp Thr Gly Tyr Ser Val Asn Gly Cys Phe Ala Glu Tyr Val115120125Val Ala Asp Pro Asn Tyr Val Ala His Leu Pro Lys Asp Ile Asp Pro130 135140Ile Lys Thr Ala Pro Val Leu Cys Ala Gly Leu Thr Val Tyr Lys Gly145150 155160Leu Lys Met Thr Asp Thr Arg Ala Gly Glu Trp Val Ala Ile Ser Gly165170 175Ala Gly Gly Leu Gly Gln Met Ala Ile Gln Tyr Ala Val Ala Met Gly180185190Leu Asn Val Ala Ala Val Asp Ile Ser Asp Glu Lys Leu Glu Glu Ala195200205Arg Lys Leu Gly Ala Arg Val Thr Val Asn Ala Leu Lys Gln Asp Pro210215 220Val Ala Tyr Ile Arg Glu Gln Thr Gly Gly Thr His Gly Val Leu Val225 230235240Thr Ala Val Ser Asp Lys Ala Phe Ser Gln Ala Val Gly Tyr Ala Arg245250 255Arg Gly Gly Thr Val Val Leu Asn Gly Leu Pro Pro Gly Asp Phe Pro260265270
Leu Ser Ile Phe Asp Met Val Met Asn Gly Thr Thr Val Arg Gly Ser275280285Ile Val Gly Thr Arg Leu Asp Met Ile Glu Ala Met Ser Phe Phe Thr290295300Asp Gly Lys Val Thr Thr Val Val Ser Thr Asp Lys Leu Glu Asn Ile305310 315 320Asn Thr Ile Phe Asp Asn Leu Gln His Gly Arg Val Lys Gly Arg Val325 330335Val Leu Asp Phe Arg Asn Gly Ala340<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>3gtggacggac tgacgtagat caaggttgcg 30<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>4atgcatcttt cccgttcgcg ccctccggtt 30
權(quán)利要求
1.一種蛋白ADH，它可以是下述(A)或(B)中的任意一個(A)蛋白ADH，其具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；或者(B)蛋白ADH，其由如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列通過一個或幾個氨基酸的替換、缺失、插入、添加或者倒置所衍生的氨基酸序列所組成，并具有乙醇脫氫酶活性。
2.一種基因的DNA，其編碼下述蛋白ADH(A)或(B)中任意一個(A)蛋白ADH，其具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；或者(B)蛋白ADH，其由如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列通過一個或幾個氨基酸的替換、缺失、插入、添加或者倒置所衍生的氨基酸序列所組成，并具有乙醇脫氫酶活性。
3.一種基因，其由下述DNA(A)、(B)或(C)組成(A)一種DNA，它包含由如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列中Nos.359位到1390位核苷酸組成的核苷酸序列，(B)一種DNA，它在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能夠與由與如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列中Nos.359位到1390位核苷酸組成的DNA的互補核苷酸序列組成的DNA雜交，并編碼具有乙醇脫氫酶活性的蛋白ADH；或者(C)一種DNA，它在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能夠與由如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列中Nos.359位到1390位核苷酸序列組成的DNA的一部分所制備的探針的核苷酸序列組成的DNA雜交，并編碼具有乙醇脫氫酶活性的蛋白ADH。
4.一個重組載體，其含有權(quán)利要求2或3中的DNA。
5.一種轉(zhuǎn)化子，其含有權(quán)利要求4中的重組載體。
6.一種微生物，其具有通過在細(xì)胞內(nèi)擴增如權(quán)利要求2或3所述的DNA的拷貝數(shù)所增強的乙醇脫氫酶活性。
7.權(quán)利要求6中的微生物，所述微生物是屬于醋酸桿菌屬或者葡糖酸醋酸桿菌屬的醋酸菌。
8.一種生產(chǎn)醋的方法，它包括在含乙醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求6或7中的微生物，并促使微生物在培養(yǎng)基中生產(chǎn)并富集醋酸。
9.通過權(quán)利要求8中的方法獲得的含有高濃度醋酸的醋。
10.權(quán)利要求9中的醋，其中醋酸濃度為10％至13％。
全文摘要
通過從醋酸菌染色體DNA文庫中獲得在含醋酸的培養(yǎng)基中具有生產(chǎn)促進功能的基因的方法，在屬于葡糖酸醋酸桿菌屬的實際應(yīng)用的醋酸菌中克隆到一種在實際應(yīng)用水平上具有提高醋酸發(fā)酵功能的新基因。將該基因轉(zhuǎn)入醋酸菌獲得轉(zhuǎn)化子，當(dāng)這種轉(zhuǎn)化子在存在乙醇的條件下培養(yǎng)時，有可能顯著縮短其生長誘導(dǎo)期并顯著提高其醋酸發(fā)酵速率。
文檔編號C12N1/19GK1788087SQ20048001300
公開日2006年6月14日 申請日期2004年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月12日
發(fā)明者中野繁 申請人:株式會社味滋集團公司