專利名稱：新型重組腺病毒載體骨架質(zhì)粒及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型重組腺病毒載體骨架質(zhì)粒及其用途。
背景技術(shù)：
腺病毒載體是目前運(yùn)用最廣的病毒載體之一，它被廣泛用于基因治療、基因功能性研究、反義治療、疫苗開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域。目前普遍使用的腺病毒包裝系統(tǒng)主要有兩種AdEasy系統(tǒng)和AdMax系統(tǒng)。其中，AdEasy系統(tǒng)由穿梭質(zhì)粒、骨架質(zhì)粒和原核細(xì)胞(BJ5183)組成，外源基因序列被構(gòu)建入穿梭質(zhì)粒后，通過(guò)與骨架質(zhì)粒在原核細(xì)胞中完成病毒基因組重組來(lái)產(chǎn)生重組腺病毒。AdMax系統(tǒng)由含有l(wèi)oxP位點(diǎn)的穿梭質(zhì)粒、骨架質(zhì)粒和HEK-293細(xì)胞株組成，外源基因序列被構(gòu)建入穿梭質(zhì)粒后，通過(guò)與骨架質(zhì)粒在HEK-293細(xì)胞中進(jìn)行基因重組來(lái)產(chǎn)生重組腺病毒。
AdMax腺病毒系統(tǒng)是由腺病毒載體鼻祖Dr.Frank Graham在1999年創(chuàng)建的一套重組腺病毒構(gòu)建系統(tǒng)，目前已被加拿大的Micobix公司開(kāi)發(fā)成為一種腺病毒載體包裝系統(tǒng)。AdMax系統(tǒng)進(jìn)行重組腺病毒包裝的基本原理是通過(guò)Cre-loxP或FLP-frt重組酶，使轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK-293細(xì)胞的穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒發(fā)生定點(diǎn)重組，產(chǎn)生重組腺病毒，這樣得到的重組病毒是E1缺失的復(fù)制缺陷型腺病毒，病毒在不能夠提供E1區(qū)的細(xì)胞中只能實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)而本身不具備增殖能力。AdMax系統(tǒng)的特點(diǎn)是通過(guò)重組酶在真核細(xì)胞內(nèi)完成重組出毒，高效且穩(wěn)定，可以說(shuō)，它是目前最方便快捷的腺病毒包裝系統(tǒng)之一。
與現(xiàn)在使用最普及的AdEasy系統(tǒng)相比，AdMax系統(tǒng)出毒更快，能夠高效率、簡(jiǎn)便而快速地獲得重組腺病毒，并且病毒的產(chǎn)率(yielding)明顯提高。利用AdMax系統(tǒng)，只需要2～4周就能完成從質(zhì)粒構(gòu)建到重組出毒的全過(guò)程，成功率大于98％(其中95％的克隆含有目的基因)，因?yàn)橹亟M出毒是在真核細(xì)胞內(nèi)完成的，保持了對(duì)腺病毒的生存壓力，因此有助于保持重組腺病毒基因組的完整性；而AdEasy系統(tǒng)的出毒成功率只有18-34％(Stratagene公司新版的AdEasy XL系統(tǒng)成功率在94％左右)，而且在原核細(xì)胞(BJ5183)中完成病毒基因組重組，理論上，失去了生存壓力的腺病毒基因組更容易發(fā)生突變，病毒遺傳背景及活性可能會(huì)受到影響。
人類腺病毒家族有51個(gè)已知血清型，分為6個(gè)亞群A組、B組、C組、D組、E組和F組。現(xiàn)今最常用的腺病毒載體是Ad5，即血清型為5的腺病毒，屬于C亞群，AdEasy系統(tǒng)和AdMax系統(tǒng)包裝出的也都是Ad5。腺病毒的纖突結(jié)(fiber knob)介導(dǎo)病毒與細(xì)胞的吸附，除了B組腺病毒以外，其它各組腺病毒都用CAR(coxsackievirus-adenovirus receptors)作為其主要吸附受體(attachment receptor)，而B(niǎo)組腺病毒則用另外一種細(xì)胞受體CD46作為吸附受體(Gaggar，A.，et al.，Nature Medicine.2003)。依據(jù)組織親嗜性和與致病部位的相關(guān)性，B組腺病毒又進(jìn)一步分為B1和B2亞組B1亞組感染呼吸道，B2亞組感染腎和尿道。Ad11p，Ad14，Ad35為B2亞組腺病毒；Ad3，Ad16，Ad21，Ad50為B1亞組腺病毒。CD46是一種廣泛表達(dá)的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白(complement regulatory protein)，這種蛋白幾乎存在于所有的人類體細(xì)胞表面。近年來(lái)，B組腺病毒的衍生體作為頗具吸引力的基因治療載體而受到關(guān)注，因?yàn)樗鼈兛梢赞D(zhuǎn)導(dǎo)造血干細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞(DC細(xì)胞)和惡性腫瘤細(xì)胞等靶細(xì)胞，而這些細(xì)胞往往不易被常用的腺病毒載體(如Ad5)感染(Shayakhmetov，D.，et al.，Journal of Virology.2000)。
近年來(lái)，由于基因治療的需要，包括骨髓干細(xì)胞在內(nèi)的的一系列人造血干細(xì)胞(Humanhematopoietic stemcells，HSCs)的轉(zhuǎn)染越來(lái)越受到重視。而此類細(xì)胞表面通常都缺乏CAR，是一類很難用傳統(tǒng)病毒載體，包括Ad5感染的細(xì)胞(Crooks，G.M.，and D.B.Kohn.，Blood.1993)。各個(gè)血清型的腺病毒間纖突結(jié)的核苷酸和氨基酸序列差別很大，通常認(rèn)為正是這些差別導(dǎo)致了不同血清型的腺病毒所能識(shí)別受體的差異(Bailey，A.，et al.，Virology.1994)。因此，很多研究人員都在致力于帶有其他血清型腺病毒纖突結(jié)的Ad5嵌合體的構(gòu)建，并已取得了一定的突破。Ad5F35腺病毒載體是一種“改外殼”的腺病毒雜合載體，即在5型腺病毒外殼的基礎(chǔ)上用35型腺病毒(Ad35)的纖突替代5型腺病毒的纖突。此重組病毒除了擁有35型腺病毒(Ad35)的纖突結(jié)外，其它外殼組成完全是5型腺病毒的外殼蛋白。有實(shí)驗(yàn)表明，帶有綠色熒光蛋白(GFP)的Ad5F35感染CD34+細(xì)胞后，54％的細(xì)胞中表達(dá)了GFP；而用Ad5-GFP以同樣條件進(jìn)行的平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，只有25％的CD34+細(xì)胞能夠表達(dá)GFP(Shayakhmetov，D.，et al.，Journal ofVirology.2000)。瑞典Lund大學(xué)的研究人員已經(jīng)利用AdEasy系統(tǒng)的骨架質(zhì)粒為基礎(chǔ)，對(duì)AdEasy系統(tǒng)進(jìn)行改造，在骨架質(zhì)粒中加入編碼Ad35的纖突柄、Ad35纖突結(jié)的DNA序列，就能夠?qū)崿F(xiàn)利用AdEasy包裝嵌合型腺病毒載體的目的(Fan，X.，et al.，Gene Therapy.2000；Nilsson，M.，etal.，2003.Unpublished manuscript)。在穿梭質(zhì)粒中插入編碼外源基因GFP的序列，就能夠利用改造過(guò)的AdEasy系統(tǒng)包裝出重組腺病毒Ad5F35-GFP，以Ad5-GFP為對(duì)照，轉(zhuǎn)染CD34+造血細(xì)胞。同樣條件下Ad5F35-GFP感染細(xì)胞數(shù)是Ad5-GFP的2～3倍；而被感染細(xì)胞中GFP的表達(dá)量則相差3～4倍(Nilsson M.，et al.，Molecular Therapy.2003)。
參考文獻(xiàn)文獻(xiàn)1.Gaggar，A.，Shayakhmetov，D.M.，and Lieber，A.CD46 is a cellular for group B adenoviruses.
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Functionally Distinct Subpopulations of Cord Blood CD34+Cells Are Transduced by AdenoviralVectors with Serotype 5 or 35 Tropism.
Molecular Therapy.2003；12；4C發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種重組腺病毒載體骨架質(zhì)粒pBHG-fiber5/35，利用這種骨架質(zhì)粒，可以和AdMax系統(tǒng)含有l(wèi)oxP位點(diǎn)的穿梭質(zhì)粒以及能夠提供腺病毒E1區(qū)的細(xì)胞(HEK-293細(xì)胞、911細(xì)胞或者PERC6細(xì)胞)共同組成一種新型重組腺病毒載體包裝系統(tǒng)。將外源基因克隆入含有l(wèi)oxP位點(diǎn)的穿梭質(zhì)粒后，與本發(fā)明所述的腺病毒載體骨架質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染細(xì)胞，就能夠包裝出帶有外源基因的Ad5F35，此重組Ad5F35是E1區(qū)缺失的復(fù)制缺陷型腺病毒，在不能夠提供E1區(qū)的細(xì)胞中只能實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)而本身不具備增殖能力。在本發(fā)明所述之骨架質(zhì)粒的PacI單一酶切位點(diǎn)處也可以插入外源基因，帶有外源基因序列的pBHG-fiber5/35與含有l(wèi)oxP位點(diǎn)的穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染能夠提供腺病毒E1區(qū)的細(xì)胞，也可以包裝出能夠表達(dá)外源基因編碼蛋白質(zhì)的重組Ad5F35型腺病毒。與現(xiàn)有的AdEasy系統(tǒng)、AdMax系統(tǒng)等腺病毒包裝系統(tǒng)中的骨架質(zhì)粒相比，本發(fā)明所述的骨架質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)在于第一，本發(fā)明中所述的骨架質(zhì)粒可以和AdMax系統(tǒng)中含有l(wèi)oxP位點(diǎn)的穿梭質(zhì)粒及細(xì)胞組合使用，進(jìn)行重組腺病毒的包裝，從而使得已經(jīng)將外源基因構(gòu)建入原有AdMax系統(tǒng)穿梭質(zhì)粒的用戶不必重新進(jìn)行復(fù)雜的質(zhì)粒構(gòu)建，就可以應(yīng)用由本發(fā)明所述的骨架質(zhì)粒所構(gòu)成的重組腺病毒載體包裝系統(tǒng)包裝出新型的Ad5F35重組腺病毒；第二，本發(fā)明中所述的重組腺病毒載體骨架質(zhì)粒所構(gòu)成的包裝系統(tǒng)具備AdMax系統(tǒng)出毒快、穩(wěn)定性好、產(chǎn)率高的優(yōu)點(diǎn)；第三，利用本發(fā)明中所述的骨架質(zhì)粒，能夠包裝出帶有外源基因的Ad5F35型重組腺病毒，此類重組腺病毒能夠通過(guò)CD46來(lái)感染細(xì)胞，而CD46是一種廣泛表達(dá)的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，這種蛋白幾乎存在于所有的人類體細(xì)胞表面，因此，利用本發(fā)明中所述骨架質(zhì)粒所裝出的Ad5F35型重組腺病毒與AdMax系統(tǒng)包裝出的Ad5型重組腺病毒相比，所能夠感染的細(xì)胞種類明顯增加；第四，一些因?yàn)楸砻嫒狈d5型腺病毒受體CAR而難以被現(xiàn)有AdEasy及AdMax系統(tǒng)包裝出的重組腺病毒所感染的細(xì)胞，如樹(shù)突狀細(xì)胞(DC細(xì)胞)、惡性腫瘤細(xì)胞，及CD34+的人外周血細(xì)胞和造血干細(xì)胞等靶細(xì)胞，均能夠被本發(fā)明中所述的重組腺病毒包裝系統(tǒng)所包裝出的Ad5F35型重組腺病毒感染，從而實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)入。
本發(fā)明所述之骨架質(zhì)粒，是以pBHGlox(delta)E1，3Cre骨架質(zhì)粒為材料，通過(guò)下述方法得到用AdEasy5/35為模板擴(kuò)增得到fiber5/35序列，即編碼Ad35纖突柄及Ad35纖突結(jié)的基因序列，序列如序列表中SEQ ID No 2所示；用fiber5/35序列替換pBHGlox(delta)E1，3Cre骨架質(zhì)粒上編碼Ad5纖突柄及纖突結(jié)的基因序列，如序列表中SEQ ID No 1所示序列，得到pBHG-fiber5/35。因此，在pBHG-fiber5/35質(zhì)粒上，含有SV40AN位點(diǎn)和pIX基因，SV40AN位點(diǎn)和pIX基因之間含有Cre位點(diǎn)、HCMV IE立早啟動(dòng)字、氨芐青霉素抗性基因和loxP位點(diǎn)。pBHG-fiber5/35與pBHGlox(delta)E1，3Cre相比，編碼腺病毒纖突柄及纖突結(jié)的基因發(fā)生了改變，而重組腺病毒包裝所需的其他元件并沒(méi)有發(fā)生變化。通過(guò)這種改造，使得pBHG-fiber5/35骨架質(zhì)粒可以與帶有l(wèi)oxP位點(diǎn)的穿梭質(zhì)粒配合起來(lái)進(jìn)行重組腺病毒的包裝，而且包裝出的帶有外源基因的重組腺病毒不僅保留了AdMax系統(tǒng)出毒快、穩(wěn)定性好、產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)，而且感染細(xì)胞的范圍更廣、感染效率更高、外源基因表達(dá)量更多。
本發(fā)明所述之骨架質(zhì)?？梢耘c具有l(wèi)oxP位點(diǎn)的穿梭質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生病毒基因組同源重組，產(chǎn)生能夠表達(dá)外源基因的Ad5F35型重組腺病毒。
本發(fā)明所述之骨架質(zhì)?？梢耘c具有l(wèi)oxP位點(diǎn)的穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生病毒基因組同源重組，產(chǎn)生攜帶組織或腫瘤特異啟動(dòng)元件的Ad5F35型重組腺病毒。


圖1.本發(fā)明公開(kāi)的骨架質(zhì)粒構(gòu)建流程(1)將AdMax系統(tǒng)中的骨架質(zhì)粒pBHGlox(delta)E1，3Cre用SpeI和XbaI進(jìn)行雙酶切，保留酶切后得到的大片段；(2)將雙酶切得到的小片段即圖1中的片段I克隆入pBluescript II KS，得到中間質(zhì)粒I；(3)用PacI和AflII雙酶切中間質(zhì)粒I，保留酶切得到的大片段；(4)以AdEasy5/35為模板擴(kuò)增得到兩端帶有PacI和AflII酶切位點(diǎn)的fiber5/35序列，即為圖1中所示的片段II；(5)將步驟(4)得到的fiber5/35序列即片段II連接入步驟(3)得到的大片段中，得到中間質(zhì)粒II；(6)將步驟(5)得到的中間質(zhì)粒II用SpeI和XbaI進(jìn)行雙酶切，將得到的小片段與步驟(1)中保留的大片段連接，得到本發(fā)明中所述之骨架質(zhì)粒pBHG-fiber5/35。與改造前的pBHGlox(delta)E1，3Cre質(zhì)粒相比，在SpeI與XbaI兩個(gè)酶切位點(diǎn)間，編碼Ad5纖突柄及Ad5纖突結(jié)的基因序列(圖3B所示)被編碼Ad35纖突柄及Ad35纖突結(jié)的基因序列替換(圖3A所示)，其他序列沒(méi)有改變。
圖2.Microbix公司AdMax系統(tǒng)pBHGlox(delta)E1，3Cre骨架質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖此質(zhì)粒上含有SV40AN位點(diǎn)和pIX基因，SV40AN位點(diǎn)和pIX基因之間含有Cre位點(diǎn)、HCMVIE立早啟動(dòng)字、氨芐青霉素抗性基因和loxP位點(diǎn)，還具有如圖2所示的多個(gè)限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)。
圖3.本發(fā)明公開(kāi)的骨架質(zhì)粒與pBHGlox(delta)E1，3Cre骨架質(zhì)粒相比，SpeI與XbaI兩個(gè)酶切位點(diǎn)間序列的示意A顯示的是本發(fā)明公開(kāi)的骨架質(zhì)粒中SpeI與XbaI兩個(gè)酶切位點(diǎn)間序列的示意圖，在兩個(gè)酶切位點(diǎn)間包含Ad5尾部序列、Ad35纖突柄序列、Ad35纖突結(jié)序列、polyA序列、E4基因序列；
圖B顯示的是AdMax系統(tǒng)中未經(jīng)改造的pBHGlox(delta)E1，3Cre骨架質(zhì)粒，SpeI與XbaI兩個(gè)酶切位點(diǎn)間序列的示意圖，在兩個(gè)酶切位點(diǎn)間，包含Ad5尾部序列、Ad5纖突柄序列、Ad5纖突結(jié)序列、polyA序列、E4基因序列圖4.本發(fā)明公開(kāi)的骨架質(zhì)粒與帶有外源基因及l(fā)oxP位點(diǎn)的穿梭質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生病毒基因組同源重組，產(chǎn)生能夠表達(dá)外源基因的Ad5F35型重組腺病毒過(guò)程的示意圖通過(guò)Cre-loxP重組酶，轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK-293細(xì)胞的穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒發(fā)生定點(diǎn)重組，7～10天后，產(chǎn)生帶有外源基因序列的重組腺病毒圖5.帶有編碼GFP的外源基因序列及l(fā)oxP位點(diǎn)的穿梭質(zhì)粒與本發(fā)明所述的骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞后，產(chǎn)生能夠表達(dá)外源基因GFP的Ad5F35重組腺病毒圖A是在相差顯微鏡下觀察的結(jié)果，在圖的中心部分可以看到一個(gè)明顯的毒斑；圖B是同一視野在熒光顯微鏡下觀察的結(jié)果，可以看到毒斑及其周圍細(xì)胞中有能夠發(fā)出綠色熒光的GFP表達(dá)。
結(jié)果說(shuō)明用帶有編碼外源基因序列及l(fā)oxP位點(diǎn)的穿梭質(zhì)粒與本發(fā)明所述的骨架質(zhì)粒，以及能夠提供腺病毒E1區(qū)的細(xì)胞(本實(shí)施例中采用HEK-293細(xì)胞)所組成的新型重組腺病毒包裝系統(tǒng)能夠包裝出表達(dá)外源基因的Ad5F35重組腺病毒。
圖6.利用發(fā)明所述的系統(tǒng)包裝出的Ad5F35-GFP與Ad5-GFP感染CD34+造血干細(xì)胞的效率比較結(jié)果白色柱狀圖顯示的是在MOI分別為20、100、500時(shí)用Ad5-GFP感染CD34+造血干細(xì)胞后能夠表達(dá)GFP的細(xì)胞占總細(xì)胞量的百分比；黑色柱狀圖顯示的是在MOI分別為20、100、500時(shí)用Ad5F35-GFP感染CD34+造血干細(xì)胞后能夠表達(dá)GFP的細(xì)胞占總細(xì)胞量的百分比。***表示在t檢測(cè)中，p＜0.001。結(jié)果說(shuō)明與Ad5相比，Ad5F35能夠攜帶外源基因高效感染CD34+造血干細(xì)胞，并實(shí)現(xiàn)外源基因在其中的表達(dá)。
圖7.帶有編碼人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF的外源基因序列及l(fā)oxP位點(diǎn)的穿梭質(zhì)粒與本發(fā)明所述的骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞后，產(chǎn)生能夠表達(dá)外源基因VEGF的Ad5F35重組腺病毒結(jié)果可以看到，被病毒感染的細(xì)胞脹大、脫落、崩解，細(xì)胞間出現(xiàn)明顯的毒斑。
圖8.帶有編碼人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF的外源基因序列及l(fā)oxP位點(diǎn)的穿梭質(zhì)粒與本發(fā)明所述的骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞后，產(chǎn)生能夠表達(dá)外源基因VEGF的Ad5F35重組腺病毒Ad5F35-VEGF，用此病毒感染CHO細(xì)胞，Western blot檢測(cè)被病毒感染的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞及未被病毒感染的對(duì)照組細(xì)胞抽提液中VEGF表達(dá)情況結(jié)果可以看出，被Ad5F35-VEGF感染的A59細(xì)胞與未被感染的細(xì)胞相比，VEGF的表達(dá)量明顯增加。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，但本發(fā)明的內(nèi)容并不只限于下列實(shí)施例所述的范圍。能夠與含有l(wèi)oxP位點(diǎn)的穿梭質(zhì)粒及本發(fā)明所述的pBHG-fiber5/35質(zhì)粒構(gòu)成重組腺病毒包裝系統(tǒng)的細(xì)胞是能夠提供腺病毒E1區(qū)的細(xì)胞，下述實(shí)施例以HEK-293細(xì)胞為例進(jìn)行說(shuō)明，其它允許細(xì)胞也可以使用。
實(shí)施例1pBHG-fiber5/35質(zhì)粒的構(gòu)建過(guò)程以圖2所示的pBHGlox(delta)E1，3Cre質(zhì)粒為材料，按照?qǐng)D1所示的過(guò)程，構(gòu)建本發(fā)明所公開(kāi)的骨架質(zhì)粒，步驟如下(1)將AdMax系統(tǒng)中的骨架質(zhì)粒pBHGlox(delta)E1，3Cre用SpeI和XbaI進(jìn)行雙酶切，保留酶切后得到的大片段；(2)將雙酶切得到的小片段即圖1中的片段I克隆入pBluescript II KS，得到中間質(zhì)粒I；(3)用PacI和AflII雙酶切中間質(zhì)粒I，保留酶切得到的大片段；(4)以AdEasy5/35為模板擴(kuò)增得到兩端帶有PacI和AflII酶切位點(diǎn)的fiber5/35序列，即為圖1中所示的片段II；(5)將步驟(4)得到的fiber5/35序列即片段II連接入步驟(3)得到的大片段中，得到中間質(zhì)粒II；(6)將步驟(5)得到的中間質(zhì)粒II用SpeI和XbaI進(jìn)行雙酶切，將得到的小片段與步驟(1)中保留的大片段連接，得到本發(fā)明中所述之骨架質(zhì)粒pBHG-fiber5/35。與改造前的pBHGlox(delta)E1，3Cre質(zhì)粒相比，在SpeI與XbaI兩個(gè)酶切位點(diǎn)間，編碼Ad5纖突柄及Ad5纖突結(jié)的基因序列(圖3B所示)被編碼Ad35纖突柄及Ad35纖突結(jié)的基因序列替換(圖3A所示)，其他序列沒(méi)有改變。
實(shí)施例2利用本發(fā)明所述的重組腺病毒載體骨架質(zhì)粒pBHG-fiber5/35包裝出帶有外源基因的重組腺病毒下列操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行，包裝出毒的原理如圖4所示1.將HEK-293細(xì)胞復(fù)蘇1.1取凍存于液氮中的HEK-293細(xì)胞一支，迅速于35～42℃溫水中融化；1.2將細(xì)胞在室溫，1000rpm下離心5分鐘；1.3棄掉上清，加入1mL含有10％FBS的DMEM，輕輕吹打重懸細(xì)胞；1.4將重懸的細(xì)胞加入裝有5mL含有10％FBS的DMEM的25cm2培養(yǎng)瓶中，在5％CO2，37℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜；2.HEK-293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染2.1細(xì)胞培養(yǎng)至匯合度達(dá)到80％時(shí)，在轉(zhuǎn)染前2～6小時(shí)，給細(xì)胞換液，換上新鮮的含有10％FBS的DMEM；2.2用攜帶有外源基因序列且含有l(wèi)oxP位點(diǎn)的穿梭質(zhì)粒和本發(fā)明所述的骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞；2.34～11天后，細(xì)胞全部被感染、脫落并崩解，培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液中即含有攜帶有外源基因序列的Ad5F35型重組腺病毒。
實(shí)施例3帶有編碼GFP的外源基因序列及l(fā)oxP位點(diǎn)的穿梭質(zhì)粒與本發(fā)明所述的骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，包裝出表達(dá)外源基因GFP的Ad5F35型重組腺病毒1.將HEK-293細(xì)胞復(fù)蘇1.1取凍存于液氮中的HEK-293細(xì)胞一支，迅速于35～42℃溫水中融化；1.2將細(xì)胞在室溫，1000rpm下離心5分鐘；1.3棄掉上清，加入1mL含有10％FBS的DMEM，輕輕吹打重懸細(xì)胞；1.4將重懸的細(xì)胞加入裝有5mL含有10％FBS的DMEM的25cm2培養(yǎng)瓶中，在5％CO2，37℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜；2.HEK-293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染2.1細(xì)胞培養(yǎng)至匯合度達(dá)到80％時(shí)，在轉(zhuǎn)染前2～6小時(shí)，給細(xì)胞換液，換上新鮮的含有10％FBS的DMEM；2.2用攜帶有編碼GFP基因序列且含有l(wèi)oxP位點(diǎn)的穿梭質(zhì)粒和本發(fā)明所述的骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞；3.3～7天后，開(kāi)始有重組腺病毒Ad5F35-GFP包裝成功，在相差顯微鏡下觀察可看到部分細(xì)胞發(fā)生聚集、細(xì)胞間出現(xiàn)毒斑(圖5A)，在熒光顯微鏡下可觀察到有Ad5F35-GFP包裝的細(xì)胞產(chǎn)生綠色熒光(圖5B)。
實(shí)施例4利用實(shí)施例3所述的方法包裝出的Ad5F35-GFP重組腺病毒感染CD34+造血干細(xì)胞1.CD34+造血干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)1.1采集臍帶血；1.2用德國(guó)Miltenyi Biotech公司生產(chǎn)的CD34+起源細(xì)胞分離試劑盒分離CD34+造血干細(xì)胞；1.3用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分離得到的CD34+造血干細(xì)胞純度達(dá)到95％以上；1.4將分離得到的CD34+造血干細(xì)胞以2×105/孔的數(shù)量置于細(xì)胞培養(yǎng)用24孔板中，用美國(guó)BioWhittaker公司生產(chǎn)的X-vivo 15無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基用量為每孔600微升；1.5培養(yǎng)CD34+造血干細(xì)胞的培養(yǎng)基中還含有1％的加拿大StemCellTechnologies公司產(chǎn)牛血清白蛋白、2mM的L-谷氨酰胺、100uM的β-巰基乙醇、100單位/mL的青霉素、100ug/mL的鏈霉素。
1.6在CD34+造血干細(xì)胞培養(yǎng)的生存期，上述培養(yǎng)基中加入人巨核細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育因子至50ng/mL、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子至100ng/mL、Flt3配基至50ng/mL；1.7在CD34+造血干細(xì)胞培養(yǎng)的增殖期，上述培養(yǎng)基中加入人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子至100ng/mL。
2.Ad5F35-GFP重組腺病毒感染CD34+造血干細(xì)胞2.1CD34+造血干細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜后，用實(shí)施例3中所述的方法包裝出的Ad5F35-GFP分別以MOI為20、100、500感染細(xì)胞，混合均勻，同時(shí)以同樣的條件用Ad5-GFP感染細(xì)胞作為對(duì)照；2.2三小時(shí)后，洗去未感染細(xì)胞的殘留病毒，細(xì)胞換新鮮的培養(yǎng)基。
3.外源基因表達(dá)的檢測(cè)及作圖3.1病毒感染細(xì)胞48小時(shí)后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞中GFP的表達(dá)量；3.2以能夠表達(dá)GFP的CD34+造血干細(xì)胞占細(xì)胞總量的百分比為縱坐標(biāo)，對(duì)不同MOI條件下Ad5-GFP感染細(xì)胞與Ad5F35-GFP感染細(xì)胞的情況做柱狀圖，計(jì)算方差。結(jié)果如圖6所示，與Ad5-GFP相比，Ad5F35-GFP能夠更高效感染CD34+造血干細(xì)胞，并實(shí)現(xiàn)GFP在其中更大量的表達(dá)。
實(shí)施例5帶有編碼人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF的外源基因序列及l(fā)oxP位點(diǎn)的穿梭質(zhì)粒與本發(fā)明所述的骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，包裝出表達(dá)外源基因VEGF的Ad5F35型重組腺病毒1.將HEK-293細(xì)胞復(fù)蘇
1.1取凍存于液氮中的HEK-293細(xì)胞一支，迅速于35～42℃溫水中融化；1.2將細(xì)胞在室溫，1000rpm下離心5分鐘；1.3棄掉上清，加入1mL含有10％FBS的DMEM，輕輕吹打重懸細(xì)胞；1.4將重懸的細(xì)胞加入裝有5mL含有10％FBS的DMEM的25cm2培養(yǎng)瓶中，在5％CO2，37℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜；2.HEK-293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染2.1細(xì)胞培養(yǎng)至匯合度達(dá)到80％時(shí)，在轉(zhuǎn)染前2～6小時(shí)，給細(xì)胞換液，換上新鮮的含有10％FBS的DMEM；2.2用攜帶有編碼人VEGF基因序列且含有l(wèi)oxP位點(diǎn)的穿梭質(zhì)粒和本發(fā)明所述的骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞；3.3～7天后，開(kāi)始有重組腺病毒Ad5F35-VEGF包裝成功，在相差顯微鏡下觀察可看到部分細(xì)胞發(fā)生聚集、細(xì)胞間出現(xiàn)毒斑(圖7)。
實(shí)施例6帶有編碼人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF的外源基因序列的重組腺病毒Ad5F35-VEGF感染CHO細(xì)胞后，在細(xì)胞中表達(dá)VEGF1.將CHO細(xì)胞復(fù)蘇1.1取凍存于液氮中的CHO細(xì)胞一支，迅速于35～42℃溫水中融化；1.2將細(xì)胞在室溫，1000rpm下離心5分鐘；1.3棄掉上清，加入1mL含有10％FBS的DMEM，輕輕吹打重懸細(xì)胞；1.4將重懸的細(xì)胞加入裝有5mL含有10％FBS的DMEM的25cm2培養(yǎng)瓶中，在5％CO2，37℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜；2.CHO細(xì)胞的感染細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增至2×108個(gè)細(xì)胞時(shí)，以MOI＝10的劑量加入Ad5F35-VEGF，感染12～16小時(shí)。
3.CHO細(xì)胞中表達(dá)VEGF的檢測(cè)3.1CHO細(xì)胞被感染24小時(shí)后，收集細(xì)胞，加入2×SDS-PAGE上樣緩沖液，進(jìn)行SDS-PAGE，同時(shí)以未被感染的細(xì)胞為對(duì)照組；3.2對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的樣品同時(shí)以抗VEGF抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)；3.3Western blot檢測(cè)結(jié)果用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。由圖8結(jié)果可看出，Ad5F35-VEGF感染的細(xì)胞中VEGF的表達(dá)量大大多于對(duì)照組細(xì)胞。
序列表<110>本元正陽(yáng)基因技術(shù)股份有限公司<120>新型重組腺病毒載體骨架質(zhì)粒及其用途<130>200412171<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2280<212>DNA<213>Human adenovirus type 5<220>
<221>被替換的Ad5的序列<222>(44)..(2181)<223>
<400>1gtctggtaaa gcaggccaaa gtcacctacg acagtaatac caccggacac cgccttagct 60acaagttgcc aaccaagcgt cagaaattgg tggtcatggt gggagaaaag cccattacca120taactcagca ctcggtagaa accgaaggct gcattcactc accttgtcaa ggacctgagg180atctctgcac ccttattaag accctgtgcg gtctcaaaga tcttattccc tttaactaat240
aaaaaaaaat aataaagcat cacttactta aaatcagtta gcaaatttct gtccagttta300ttcagcagca cctccttgcc ctcctcccag ctctggtatt gcagcttcct cctggctgca360aactttctcc acaatctaaa tggaatgtca gtttcctcct gttcctgtcc atccgcaccc420actatcttca tgttgttgca gatgaagcgc gcaagaccgt ctgaagatac cttcaacccc480gtgtatccat atgacacgga aaccggtcct ccaactgtgc cttttcttac tcctcccttt540gtatccccca atgggtttca agagagtccc cctggggtac tctctttgcg cctatccgaa600cctctagtta cctccaatgg catgcttgcg ctcaaaatgg gcaacggcct ctctctggac660gaggccggca accttacctc ccaaaatgta accactgtga gcccacctct caaaaaaacc720aagtcaaaca taaacctgga aatatctgca cccctcacag ttacctcaga agccctaact780gtggctgccg ccgcacctct aatggtcgcg ggcaacacac tcaccatgca atcacaggcc840ccgctaaccg tgcacgactc caaacttagc attgccaccc aaggacccct cacagtgtca900gaaggaaagc tagccctgca aacatcaggc cccctcacca ccaccgatag cagtaccctt960actatcactg cctcaccccc tctaactact gccactggta gcttgggcat tgacttgaaa1020gagcccattt atacacaaaa tggaaaacta ggactaaagt acggggctcc tttgcatgta1080acagacgacc taaacacttt gaccgtagca actggtccag gtgtgactat taataatact1140
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<221>插入到骨架質(zhì)粒中的Ad35序列<222>(129)..(972)<223>
<400>2atgaccaaga gagtccggct cagtgactcc ttcaaccctg tctaccccta tgaagatgaa 60agcacctccc aacacccctt tataaaccca gggtttattt ccccaaatgg cttcacacaa120agcccagacg gagttcttac tttaaaatgt ttaaccccac taacaaccac aggcggatct180ctacagctaa aagtgggagg gggacttaca gtggatgaca ctgatggtac cttacaagaa240aacatacgtg ctacagcacc cattactaaa aataatcact ctgtagaact atccattgga300aatggattag aaactcaaaa caataaacta tgtgccaaat tgggaaatgg gttaaaattt360aacaacggtg acatttgtat aaaggatagt attaacacct tatggactgg aataaaccct420ccacctaact gtcaaattgt ggaaaacact aatacaaatg atggcaaact tactttagta480ttagtaaaaa atggagggct tgttaatggc tacgtgtctc tagttggtgt atcagacact540gtgaaccaaa tgttcacaca aaagacagca aacatccaat taagattata ttttgactct600tctggaaatc tattaactga ggaatcagac ttaaaaattc cacttaaaaa taaatcttct660acagcgacca gtgaaactgt agccagcagc aaagccttta tgccaagtac tacagcttat720cccttcaaca ccactactag ggatagtgaa aactacattc atggaatatg ttactacatg780actagttatg atagaagtct atttcccttg aacatttcta taatgctaaa cagccgtatg840
atttcttcca atgttgccta tgccatacaa tttgaatgga atctaaatgc aagtgaatct 900ccagaaagca acatagctac gctgaccaca tccccctttt tcttttctta cattacagaa 960gacgacaact aaaataaagt ttaagtgttt ttatttaaaa tcacaaaatt cgagtagtta1020ttttgcctcc accttcccat ttgacagaat acaccaatct ctccccacgc acagctttaa1080acatttggat cc109權(quán)利要求
1.新型重組腺病毒載體骨架質(zhì)粒pBHG-fiber5/35。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述之骨架質(zhì)粒，其特征在于，所述骨架質(zhì)粒是以pBHGlox(delta)E1，3Cre骨架質(zhì)粒為材料改造而成的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述之改造，其特征在于，所述改造是通過(guò)用編碼Ad35纖突柄及Ad35纖突結(jié)的基因序列替換了pBHGlox(delta)E1，3Cre骨架質(zhì)粒上編碼Ad5纖突柄及Ad5纖突結(jié)的基因序列所完成的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述之骨架質(zhì)粒，其特征在于，所述骨架質(zhì)粒上的PacI酶切位點(diǎn)是外源基因插入的位點(diǎn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述之骨架質(zhì)粒，其特征在于，所述骨架質(zhì)粒上含有SV40 AN位點(diǎn)和pIX基因，SV40 AN位點(diǎn)和pIX基因之間含有Cre位點(diǎn)、HCMV IE立早啟動(dòng)子、氨芐青霉素抗性基因和loxP位點(diǎn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述之骨架質(zhì)粒，其特征在于，所述骨架質(zhì)?？梢耘c有l(wèi)oxP位點(diǎn)的穿梭質(zhì)粒、能夠提供腺病毒E1區(qū)的細(xì)胞組成新型重組腺病毒包裝系統(tǒng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述之骨架質(zhì)粒，其特征在于，所述骨架質(zhì)?？梢耘c有l(wèi)oxP位點(diǎn)的穿梭質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生病毒基因組同源重組，產(chǎn)生能夠表達(dá)外源基因的Ad5F35型重組腺病毒。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述之骨架質(zhì)粒，其特征在于，所述骨架質(zhì)粒與有l(wèi)oxP位點(diǎn)的穿梭質(zhì)粒、能夠提供腺病毒E1區(qū)的細(xì)胞組成的新型重組腺病毒包裝系統(tǒng)，包裝出的重組腺病毒是E1缺失的復(fù)制缺陷型腺病毒。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述之骨架質(zhì)粒，其特征在于，所述骨架質(zhì)粒與有l(wèi)oxP位點(diǎn)的穿梭質(zhì)粒、能夠提供腺病毒E1區(qū)的細(xì)胞組成的新型重組腺病毒包裝系統(tǒng)，包裝出的重組腺病毒上能夠帶有外源基因序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述之骨架質(zhì)粒，其特征在于，所述骨架質(zhì)粒的用途是用于新型重組腺病毒的包裝。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了新型重組腺病毒載體骨架質(zhì)粒及其用途，利用此載體構(gòu)建用骨架質(zhì)粒能夠快速、高效率、簡(jiǎn)便地獲得攜帶有外源基因的Ad5F35型重組腺病毒，并且明顯提高病毒的產(chǎn)率。本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)用編碼Ad35纖突的基因序列替換pBHGlox(delta)E1，3Cre骨架質(zhì)粒上編碼Ad5纖突的基因序列。本發(fā)明的主要用途是快速、穩(wěn)定、高產(chǎn)的包裝出攜帶外源基因的Ad5F35型重組腺病毒載體，感染很難用傳統(tǒng)病毒載體感染的惡性腫瘤細(xì)胞、人外周血細(xì)胞和造血干細(xì)胞等靶細(xì)胞，進(jìn)而應(yīng)用于基因治療、基因功能性研究、反義治療、疫苗開(kāi)發(fā)領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12N15/861GK1796566SQ20041010150
公開(kāi)日2006年7月5日 申請(qǐng)日期2004年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月22日
發(fā)明者吳小兵, 袁振華, 劉寧, 趙革新, 高金華, 董小巖 申請(qǐng)人:本元正陽(yáng)基因技術(shù)股份有限公司