專利名稱：一種鑒定不同養(yǎng)殖海區(qū)的經(jīng)濟(jì)海藻裙帶菜配子體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來(lái)自中國(guó)不同養(yǎng)殖海區(qū)的經(jīng)濟(jì)海藻裙帶菜(Undariapinnatifida)配子體Rubisco基因及兩側(cè)大小亞基(rbcL和rbcS)部分DNA序列的獲得及利用該序列對(duì)不同來(lái)源的裙帶菜配子體進(jìn)行鑒定的方法，也即獲得經(jīng)濟(jì)海藻裙帶菜(Undaria pinnatifida)配子體Rubisco基因全部序列和rbcL及rbcS亞基部分序列，及利用該序列鑒定不同來(lái)源的中國(guó)經(jīng)濟(jì)海藻裙帶菜配子體的方法。
背景技術(shù)：
裙帶菜是海岸植物中個(gè)體較大，質(zhì)柔味美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的一種重要經(jīng)濟(jì)海藻，它是北太平洋特有種，多年來(lái)由于船舶運(yùn)輸?shù)年P(guān)系，它的配子體和幼孢子體被傳播到世界各地?！吨袊?guó)海藻志》記載裙帶菜有無(wú)肋裙帶菜(Undaria peterseniana)、葉囊裙帶菜(U.undarioides)和裙帶菜(U.pinnatifida Harv.Suringar)三種，后一種因有較高的食用價(jià)值而被廣泛養(yǎng)殖。裙帶菜營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，綜合起來(lái)看，裙帶菜干品中蛋白質(zhì)含量在11％以上，最高可達(dá)22％；含糖分35％～40％；脂類0.5％～3％；灰分20％～38％，灰分中含Ca，Mg，Zn，F(xiàn)e，Mn，Co，Ge，Se等各種礦質(zhì)元素；裙帶菜含有19種氨基酸，包括全部人體必需氨基酸；裙帶菜還含有各種維生素，其中維生素K1含量可達(dá)到8μg/g；裙帶菜的多糖組分較復(fù)雜，纖維素易于被人消化吸收。裙帶菜的藥用和保健作用也日益受到人們的重視。裙帶菜還是重要的工業(yè)原料，綜合利用可提取褐藻膠、碘、甘露醇和氯化鉀等多種工業(yè)產(chǎn)品。除此之外，裙帶菜還具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，國(guó)際市場(chǎng)對(duì)裙帶菜需求量的增加也證實(shí)了這一點(diǎn)。20世紀(jì)90年代初的統(tǒng)計(jì)表明，全世界裙帶菜年產(chǎn)量約為9×105t干品，產(chǎn)值為2×108美元。近年來(lái)，裙帶菜的市場(chǎng)需求不斷擴(kuò)大，應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)展，顯示出極好的市場(chǎng)潛力。
裙帶菜是繼海帶和紫菜之后，從20世紀(jì)80年代中期開始在中國(guó)逐步形成的一個(gè)藻類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)。到目前為止，盡管已先后在法國(guó)、英國(guó)、新西蘭和澳大利亞發(fā)現(xiàn)了裙帶菜，但裙帶菜養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)主要集中在中國(guó)、日本和韓國(guó)。中國(guó)自然繁殖的裙帶菜主要分布在浙江省舟山群島的塖山島附近，自然分布在大連附近及山東半島地區(qū)的裙帶菜則是早年從日本和朝鮮移植過(guò)來(lái)的。自從裙帶菜雌雄配子體分離方法建立以來(lái)，隨著養(yǎng)殖和雜交育種技術(shù)的發(fā)展，許多具有優(yōu)良性狀的裙帶菜新品種在生產(chǎn)中得到了廣泛應(yīng)用。但是不同來(lái)源地的裙帶菜或具有不同優(yōu)良性狀的同種裙帶菜的配子體從肉眼是很難區(qū)分開來(lái)的，目前主要是借助顯微鏡觀察。隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，一些分子標(biāo)記技術(shù)諸如隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)、限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)和簡(jiǎn)單序列重復(fù)間區(qū)(ISSR)等已開始應(yīng)用于重要經(jīng)濟(jì)海藻的鑒定和輔助育種。但是這幾種標(biāo)記方法穩(wěn)定性和重復(fù)性不高、耗時(shí)耗力，極大的限制了它們?cè)趯?shí)際中的應(yīng)用。
Rubisco基因(1，5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶)是1947年由Wildmen和Bonnor首先發(fā)現(xiàn)的。它具有催化CO2和RuBP(1，5-二磷酸核酮糖)形成PGA(3-磷酸甘油酸)的功能，是光合作用過(guò)程中一種非常重要的酶。后續(xù)研究證實(shí)在植物與微生物之間、不同植物之間、不同微生物之間Rubisco結(jié)構(gòu)是不同的，其形式是由大亞基(rbcL)和小亞基(rbcS)共同組成的LxSy。Rubisco基因大亞基分子量一般在50～60KD之間，是由葉綠體DNA編碼，小亞基分子量一般在12～18KD之間，是由核DNA編碼。不同植物間和同一物種內(nèi)Rubisco基因及大小亞基DNA同源性程度不同，因此可以用于系統(tǒng)進(jìn)化、親緣關(guān)系分析和物種鑒定等相關(guān)研究領(lǐng)域。近年來(lái)，隨著PCR技術(shù)的發(fā)展和直接測(cè)序技術(shù)在分子生物學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用，Rubisco基因及其兩側(cè)的大小亞基DNA序列必將在植物科內(nèi)屬間、屬下種間的親緣關(guān)系鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化等研究中發(fā)揮重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)便的鑒定中國(guó)不同養(yǎng)殖海區(qū)的經(jīng)濟(jì)海藻裙帶菜配子體的方法，從分子角度出發(fā)，使鑒定結(jié)果更準(zhǔn)確、可靠。本發(fā)明首先建立了一套裙帶菜配子體高質(zhì)量DNA的制備方法，接著對(duì)裙帶菜不同配子體Rubisco基因及兩側(cè)大小亞基DNA序列進(jìn)行了測(cè)序，獲得了Rubisco基因全序列及其大小亞基(rbcL和rbcS)的部分序列(見序列附表)；并與Genbank中已經(jīng)注冊(cè)的裙帶菜Rubisco基因序列進(jìn)行了同源性比較，比較了不同來(lái)源裙帶菜配子體Rubisco基因全序列及其大小亞基核苷酸位點(diǎn)差異，分析了中國(guó)不同養(yǎng)殖地點(diǎn)的裙帶菜起始來(lái)源地。
一種鑒定來(lái)自中國(guó)不同養(yǎng)殖海區(qū)的經(jīng)濟(jì)海藻裙帶菜配子體的方法，其利用海藻裙帶菜配子體Rubisco基因及兩側(cè)大小亞基(rbcL和rbcS)部分的DNA序列對(duì)不同來(lái)源(養(yǎng)殖海區(qū))的裙帶菜配子體進(jìn)行鑒定。
具體過(guò)程為1)提取需要鑒定的海藻裙帶菜總DNA進(jìn)行藻體材料收集、鑒定和保存工作，包括裙帶菜雌雄配子體的分離，從確定的藻體中提取DNA(取培養(yǎng)中的新鮮健康藻體材料，用無(wú)菌水處理以除去雜質(zhì)，在液氮種研磨成粉末，用CTAB抽提法提取總DNA)；2)以獲得的DNA為模板，以寡核苷酸作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的引物，擴(kuò)增Rubisco基因及其兩側(cè)大小亞基(rbcL和rbcS)部分序列，所用的引物參照相近物種Rubisco基因兩側(cè)大小亞基的保守序列進(jìn)行人工合成；利用特異引物P1和P4的序列對(duì)總DNA進(jìn)行Rubisco基因及其兩側(cè)大小亞基PCR擴(kuò)增反應(yīng)，P1和P4的序列分別為正向P1為5’GCCAAATGCACCAACTTCTT3’，位于rbcL上，反向P4為5’AGACCCCATAATTCCC3’，位于rbcS上；并以ddH2O代替模板DNA做空白對(duì)照；3)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化；4)應(yīng)用直接測(cè)序技術(shù)對(duì)對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物測(cè)序；5)對(duì)測(cè)定序列后的DNA序列數(shù)據(jù)分析(系統(tǒng)學(xué)分析)用對(duì)位排列軟件Clustal W和Genedoc進(jìn)行對(duì)位排列，并輔以人工校對(duì)，用系統(tǒng)進(jìn)化分析軟件MEGA2.1和PHYLIP3.57分別分析各樣品DNA序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中各個(gè)序列間的差異，進(jìn)行親緣和進(jìn)化關(guān)系分析。
所述用于Rubisco基因及其兩側(cè)大小亞基擴(kuò)增的反應(yīng)液20μL中含10mmol/L Tris-HCl，pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，Taqpolymerase 1U，4種dNTP各2mmol/L，兩個(gè)引物各4-6mmol/L，DNA模板40-70ng；反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為96℃預(yù)變性3分鐘；94℃2分鐘，53-57℃10秒鐘，72℃1分鐘；2個(gè)循環(huán)；94℃10秒鐘，53-57℃10秒鐘，72℃2分鐘，33-38個(gè)循環(huán)；72℃延伸5分鐘；擴(kuò)增后測(cè)序所設(shè)計(jì)的引物為P15’GCCAAATGCACCAACTTCTT3’，P45’AGACCCCATAATTCCC3’。每一個(gè)樣品至少重復(fù)2～3次。
裙帶菜配子體保種因?yàn)橐恍┲饔^和客觀因素的影響，存在材料起始來(lái)源不明確的問(wèn)題，本發(fā)明從分子水平上對(duì)該問(wèn)題進(jìn)行了解答。本發(fā)明提供了一種獲得經(jīng)濟(jì)海藻裙帶菜配子體的Rubisco基因及其兩側(cè)大小亞基(rbcL和rbcS)部分DNA序列的方法，并利用該序列對(duì)中國(guó)不同來(lái)源的經(jīng)濟(jì)海藻裙帶菜進(jìn)行鑒定和探討這些不同養(yǎng)殖地點(diǎn)所用裙帶菜的初始來(lái)源地。
海帶和裙帶菜都屬于褐藻門，褐子綱，海帶目，分屬于海帶科和翅藻科，它們的生活史比較相似，在養(yǎng)殖過(guò)程中都要經(jīng)過(guò)配子體保種階段，而且它們的配子體從外形上是很難區(qū)分的。本發(fā)明實(shí)施例給出了利用同源性較好的引物P1和P4比較裙帶菜和海帶配子體Rubisco基因擴(kuò)增圖譜差異；為海帶和裙帶菜配子體的鑒定提供了很好的依據(jù)。


圖1為本發(fā)明用Rubisco基因鑒別裙帶菜和海帶配子體的電泳圖譜，其中1-17和19-24均為裙帶菜樣品，18為海帶樣品。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例下面詳細(xì)描述所述方法(1)總DNA提取首先，對(duì)培養(yǎng)的裙帶菜配子體進(jìn)行清洗，除去雜物，然后用吸水紙吸干水份。接著加液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)移到預(yù)熱的提取緩沖液[10mmol L-1Tris.HCl，pH8.0，20mmol L-1ethylenediaminetetra-acetic acid(EDTA)，1.4MNaCl，3％ cetyltrimethyl ammonium bromide(CTAB)]中，加入β巰基乙醇，在65℃水浴1h加入1/3體積的2M(pH5.5)的KAC，冰浴15min后在10000rpm下離心10min。取上清液加氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提兩次，接著取上清液加2/3體積異丙醇沉淀DNA。DNA溶解在TE中，加入Rnase除去RNA后用氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提一次，加2/3體積異丙醇沉淀DNA，干燥后的DNA重新溶解在TE中，-20℃保存。瓊脂糖凝膠電泳后染色顯示提取的基因組DNA大小在23Kb左右，OD260/280比值在1.60-1.90之間。
(2)PCR擴(kuò)增裙帶菜配子體Rubisco基因及其兩側(cè)大小亞基擴(kuò)增的引物為P1和P4，序列如下P1(正向)為5’GCCAAATGCACCAACTTCTT3’，位于rbcL上，P4(反向)為5’AGACCCCATAATTCCC3’，位于rbcS上。PCR反應(yīng)擴(kuò)增反應(yīng)在20μL的體系中完成，反應(yīng)液含10mmol/L Tris-HCl，pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/LMgCl2，Taq polymerase 1U，4種dNTP各2mmol/L，兩個(gè)引物各5mmol/L，DNA模板約50ng。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為96℃預(yù)變性3分鐘；94℃2分鐘，55℃10秒鐘，72℃2分鐘，2個(gè)循環(huán)；94℃10秒鐘，55℃10秒鐘，72℃2分鐘，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5分鐘。以ddH2O代替模板DNA做空白對(duì)照。
(3)PCR產(chǎn)物純化PCR產(chǎn)物用EZ spin column PCR product purification kit(生工，上海)進(jìn)行純化，具體操作按試劑盒使用指南進(jìn)行。
(4)DNA序列測(cè)定用BigDyeTM測(cè)序試劑盒進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，測(cè)序反應(yīng)參數(shù)為Mix 1μL，純化后的DNA約30-50ng，Primer 1.5pmol，buffer 1.2μL，ddH2O適量。測(cè)序反應(yīng)條件為95℃1min，95℃30s，50℃30s，60℃4min，總共35各循環(huán)。用ABIPRISM377-96全自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行序列測(cè)定。
(5)DNA序列數(shù)據(jù)分析Rubisco基因序列的起止范圍參照Genbank中已經(jīng)注冊(cè)的部分海帶和裙帶菜Rubisco基因序列，所得序列輸入計(jì)算機(jī)后用Clustal W和Genedoc軟件進(jìn)行比對(duì)排列，并輔以人工校對(duì)。用MEGA2.1和PHYLIP3.57分析軟件包分別分析各樣品DNA序列之間的差異，并構(gòu)建親緣關(guān)系樹，根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹和每個(gè)個(gè)體之間的遺傳分化距離，結(jié)合Genbank中已有的數(shù)列，推測(cè)中國(guó)不同養(yǎng)殖地點(diǎn)的裙帶菜初始起源地。
發(fā)明人從中國(guó)沿海不同養(yǎng)殖海域獲得包括遼寧大連，山東青島、威海、榮成和日照，日本南型和北型，大連水產(chǎn)學(xué)院及課題組自己分離得到的裙帶菜(Undaria pinnatifida)配子體共18個(gè)樣品(包括野生型和養(yǎng)殖品系)，它們各自具有不同的生產(chǎn)性狀，含蓋了目前中國(guó)國(guó)內(nèi)的裙帶菜所有養(yǎng)殖類型，所有樣品都經(jīng)過(guò)相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜业蔫b定。
1)采用上述方法對(duì)18個(gè)待檢測(cè)植物的樣品總DNA提取將待檢樣品用無(wú)菌水沖洗干凈，除去雜質(zhì)，在液氮中研成粉末，根據(jù)本專利提供的CTAB法提取基因組總DNA；2)模板DNA的質(zhì)量檢測(cè)運(yùn)用引物P1和P4(P1、P4序列見上述方法步驟2中)對(duì)待檢樣品總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)是否能擴(kuò)增出目的片斷，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)片段的亮度和片段分子量大小，以驗(yàn)證模板DNA的質(zhì)量、調(diào)整模板DNA的濃度及PCR反應(yīng)體系的組成；PCR擴(kuò)增反應(yīng)在20μL的體系中完成，反應(yīng)液含10mmol/L Tris-HCl，pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，Taqpolymerase 1U，4種dNTP各2mmol/L，兩個(gè)引物各5mmol/L，DNA模板約50ng。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為96℃預(yù)變性3分鐘；94℃1分鐘，53-57℃10秒鐘，72℃1分鐘；2個(gè)循環(huán)；94℃10秒鐘，53-57℃10秒鐘，72℃1分鐘，30-38個(gè)循環(huán)；72℃延伸5分鐘。以ddH2O代替模板DNA做空白對(duì)照。
3)運(yùn)用同源性引物P1和P4對(duì)模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增；電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物非常理想(如圖1所示)，所以同源性引物P1和P4能用于海帶目海藻海帶和裙帶菜的鑒定分離。
(不同來(lái)源的中國(guó)經(jīng)濟(jì)海藻裙帶菜配子體Rubisco基因的全序列(包括rbcL和rbcS部分序列))1.序列表SEQ ID NO.1的信息特征長(zhǎng)度539堿基對(duì)類型核酸鏈型雙鏈分子類型cDNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形來(lái)源生長(zhǎng)在水溫較高、水層較淺處的耐高溫種，源于日本南型(明門)的裙帶菜(Undaria pinnatifida Harv.Suringar)雄配子體Rubisco基因全序列(1-244，rbcL；245-512；Rubisco；513-539，rbcS)序列描述TACTATAGGTCACCCTGATGGTATTCAATCTGGTGCAACAGCAAACCGTGTTGCTCTAGAATCTATGGTTCTAGCTCGTAATGAAGGTCGTGATTATGTTGGAGAAGGTC
CTGAAATCTTACGTAATGCAGCGGCTACTTGTGGTCCTTTAAAAGCAGCGTTAGATTTATGGAAAGATATTACTTTTGAGTACACTTCAACAGATACACCTGATTTCGTTGAACTTCCAACTGAAAGCAAATAGTATACTGAAATTAAACTCATAAAAGATTAAGTTAAATTAATTCTAGTTATATTTAAATAGCTAGAAAATATATCTAATAATTTTATCTACTTTATTATTTAAAGTGATATTGTTATAAAATTAAGACTTAACTTTAAATTTATTATAATTTTAGAAAAATACTTAATACCCCAGATTATTTTAAGTGAAAGTAGAGAGTAAATAAAAATTTTAGTATATAACTAAAAATAAAATTTCTATAATTTATCTTTAAGGAATTTGAATAGTG ATGAGAGTTACACAAGGATGTTTTTCG2.序列表SEQ ID NO.1的信息特征長(zhǎng)度579堿基對(duì)類型核酸鏈型雙鏈分子類型cDNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形來(lái)源生長(zhǎng)在水溫較高、水層較淺處的耐高溫種，源于日本南型(明門)的裙帶菜(Undaria pinnatifida Harv.Suringar)雌配子體Rubisco基因全序列(1-268，rbcL；269-536；Rubisco；537-579，rbcS)序列描述TGTGGTTCTACAATTTGGTGGTGGTACTATTGGTCACCCTGATGGTATTCAATCTGGTGCAACAGCAAACCGTGTTGCTCTAGAATCTATGGTTCTAGCTCGTAATGAAGGTCGTGATTATGTTGGAGAAGGTCCTGAAATCTTACGTAATGCAGCGGCTACTTGTGGTCCTTTAAAAGCAGCGTTAGATTTATGGAAAGATATTACTTTTGAGTACACTTCAACAGATACACCTGATTTCGTTGAACTTCCAACTGAAAGCAAATAGTATACTGAAATTAAACTCATAAAAGATTAAGTTAAATTAATTCTAGTTATATTTAAATAGCTAGAAAATATATCTAATAATTTTATCTACTTTATTATTTAAAGTGATATTGTTATAAAATTAAGACTTAACTTTAAATTTATTATAATTTTAGAAAAATACTTAATACCCCAGATTATTTTAAGTGAAAGTAGAGAGTAAATAAAAATTTTAGTATATAACTAAAAATAAAATTTCTATAATTTATCTTTAAGGAATTTGAATAGTGATGAGAGTTACACAAGGATGTTTTTCGTTTTTACCAGATTTAA3.序列表SEQ ID NO.1的信息特征長(zhǎng)度582堿基對(duì)類型核酸鏈型雙鏈分子類型cDNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形來(lái)源藻體較大，葉片上毛囊多，源于山東青島野生種的裙帶菜(Undaria pinnatifida Harv.Suringar)雄配子體Rubisco基因全序列(1-219，rbcL；220-487；Rubisco；488-582，rbcS)序列描述CAATCTGGTGCAACAGCAAACCGTGTTGCTCTAGAATCTATGGTTCTAGCTCGTAATGAAGGTCGTGATTATGTTGGAGAAGGTCCTGAAATCTTACGTAATGCAGCGGCTACTTGTGGTCCTTTAAAAGCAGCGTTAGATTTATGGAAAGATATTACTTTTGAGTACACTTCAACAGATACACCTGATTTCGTTGAACTTCCAACTGAAAGCAAATAGTATACTGAAATTAAACTCATAAAAGATTAAGTTAAATTAATTCTAGTTATATTTAAAT
AGCTAGAAAATATATCTAATAATTTTATCTACTTTATTATTTAAAGTGATATTGTTATAAAATTAAGACTTAACTTTAAATTTGTTATAATTTTAGAAAAATACTTAATACCCCAGATTATTTTAAGTGAAAGTAGAGAGTAAATAAAAATTTTAGTATATAACTAAAAATAAAATTCCTATAATTTATCTTTAAGGAATTTGAATAGTGGATGAGAGTTACACAAGGATGTTTTTCGTTTTTACCAGATTTAACTGATGAGCAAATTAAAAAACAAGTTGCTTATGCTATGTCAAAAGGGTGGG4.序列表SEQ TD NO.1的信息特征長(zhǎng)度638堿基對(duì)類型核酸鏈型雙鏈分子類型cDNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形來(lái)源適合于低水溫水域生長(zhǎng)，不耐高溫的養(yǎng)殖品系，源于日本北方的裙帶菜(Undaria pinnatifida Harv.Suringar)雄配子體Rubisco基因全序列(1-265，rbcL；266-533；Rubisco；534-638，rbcS)序列描述GGTTCTACAATTTGGTGGTGGTACTATTGGTCACCCTGATGGTATTCAATCTGGTGCAACAGCAAACCGTGTTGCTCTAGAATCTATGGTTCTAGCTCGTAATGAAGGTCGTGATTATGTTGGAGAAGGTCCTGAAATCTTACGTAATGCAGCGGCTACTTGTGGTCCTTTAAAAGCAGCGTTAGATTTATGGAAAGATATTACTTTTGAGTACACTTCAACAGATACACCTGATTTCGTTGAACTTCCAACTGAAAGCAAATAGTATACTGAAATTAAACTCATAAAAGATTAAGTTAAATTAATTCTAGTTATATTTAAATAGCTAGAAAATATATCTAATAATTTTATCTACTTTATTATTTAAAGTGATATTGTTATAAAATTAAGACTTAACTTTAAATTTGTTATAATTTTAGAAAAATACTTAATACCCCAGATTATTTTAAGTGAAAGTAGAGAGTAAATAAAAATTTTAGTATATAACTAAAAATAAAATTTCTATAATTTATCTTTAAGGAATTTGAATAGTGATGAGAGTTACACAAGGATGTTTTTCGTTTTTACCAGATTTAACTGATGAGCAAATTAAAAAACAAGTTGCTTATGCTATGTCAAAAGGGTGGGCTGTTAGTGTA5.序列表SEQ ID NO.1的信息特征長(zhǎng)度609堿基對(duì)類型核酸鏈型雙鏈分子類型cDNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形來(lái)源適合于低水溫水域生長(zhǎng)，不耐高溫的養(yǎng)殖品系，源于日本北方的裙帶菜(Undaria pinnatifida Harv.Suringar)雌配子體Rubisco基因全序列(1-255，rbcL；256-523；Rubisco；524-609，rbcS)序列描述GGTGTGGGTACTATTGGTCCACCCTGATGGTATTCAATCTGGGTGCAACCAGCAAACCGTGTTGCTCTAGAATCTATGGTTCTAGCTCGTAATGAAGGTCGTGATTATGTTGGAGAAGGTCCTGAAATCTTACGTAATGCAGCGGCTACTTGTGGTCCTTTAAAAGCAGCGTTAGATTTATGGAAAGATATTACTTTTGAGTACACTTCAACAGATACACCTGATTTCGTTGAACTTCCAACTGAAAGCAAATAGTATACTGAAATTAAACTCATAAAAGATTAAGTTAAATTAATTCTAGTTATATTTAAATAGCTAGAAAATATATCTA
ATAATTTTATCTACTTTATTATTTAAAGTGATATTGTTATAAAATTAAGACTTAACTTTAAATTTGTTATAATTTTAGAAAAATACTTAATACCCCAGATTATTTTAAGTGAAAGTAGAGAGTAAATAAAAATTTTAGTATATAACTAAAAATAAAATTTCTATAATTTATCTTTAAGGAATTTGAATAGTGATGAGAGTTACACAAGGATGTTTTTCGTTTTTACCAGATTTAACTGATGAGCAAATTAAAAAACAAGTTGCTTATGCTATGTCAAA6.序列表SEQ ID NO.1的信息特征長(zhǎng)度621堿基對(duì)類型核酸鏈型雙鏈分子類型cDNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形來(lái)源孢子葉成熟早，低溫養(yǎng)殖品系，源于中國(guó)大連的裙帶菜(Undaria pinnatifida Harv.Suringar)雄配子體Rubisco基因全序列(1-270，rbcL；271-538；Rubisco；539-621，rbcS)序列描述GATGTGGTTCTACAATTTGGTGGTGGTACTATTGGTCACCCTGATGGTATTCAATCTGGTGCAACAGCAAACCGTGTTGCTCTAGAATCTATGGTTCTAGCTCGTAATGAAGGTCGTGATTATGTTGGAGAAGGTCCTGAAATCTTACGTAATGCAGCGGCTACTTGTGGTCCTTTAAAAGCAGCGTTAGATTTATGGAAAGATATTACTTTTGAGTACACTTCAACAGATACACCTGATTTCGTTGAACTTCCAACTGAAAGCAAATAGTATACTGAAATTAAACTCATAAAGATTAAGTTAAATTAATTCTAGTTATATTTAAATAGCTAGAAAATATATCTAATAATTTTATCTACTTTATTATTTAAAGTGATATTGTTATAAAATTAAGACTTAACTTTAAATTTGTTATAATTTTAGAAAAATACTTAATACCCCAGATTATTTTAAGTGAAAGTAGAGAGTAAATAAAAATTTTAGTATATAACTAAAAATAAAATTTCTATAATTTATCTTTAAGGAATTTGAATAGTGATGAGAGTTACACAAGGATGTTTTTCGTTTTTACCAGATTTAACTGATGAGCAAATTAAAAAACAAGTTGCTTATGCTATGTC7.序列表SEQ ID NO.1的信息特征長(zhǎng)度674堿基對(duì)類型核酸鏈型雙鏈分子類型cDNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形來(lái)源孢子葉成熟早，低溫養(yǎng)殖品系，源于中國(guó)大連的裙帶菜(Undaria pinnatifida Harv.Suringar)雌配子體Rubisco基因全序列(1-276，rbcL；277-544；Rubisco；545-674，rbcS)序列描述GGGGATGATGTGGTTCTACAATTTGGTGGTGGTACTATTGGTCACCCTGATGGTATTCAATCTGGTGCAACAGCAAACCGTGTTGCTCTAGAATCTATGGTTCTAGCTCGTAATGAAGGTCGTGATTATGTTGGAGAAGGTCCTGAAATCTTACGTAATGCAGCGGCTACTTGTGGTCCTTTAAAAGCAGCGTTAGATTTATGGAAAGATATTACTTTTGAGTACACTTCAACAGATACACCTGATTTCGTTGAACTTCCAACTGAAAGCAAATAGTATACTGAAATTAAACTCATAAAAGATTAAGTTAAATTAATTCTAGTTATATTTAAATAGCTAGAAAATATATCTAATAATTTTATCTACTTTATTATTTAAAGTGATATTG
TTATAAAATTAAGACTTAACTTTAAATTTGTTATAATTTTAGAAAAATACTTAATACCCCAGATTATTTTAAGTGAAAGTAGAGAGTAAATAAAAATTTTAGTATATAACTAAAAATAAAATTTCTATAATTTATCTTTAAGGAATTTGAATAGTGATGAGAGTTACACAAGGATGTTTTTCGTTTTTACCAGATTTAACTGATGAGCAAATTAAAAAACAAGTTGCTTATGCTATGTCAAAAGGGTGGGCTGTTAGTGTAGAATGGACAGATGATCCACATCCAC8.序列表SEQ ID NO.1的信息特征長(zhǎng)度641堿基對(duì)類型核酸鏈型雙鏈分子類型cDNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形來(lái)源藻體生長(zhǎng)快，成熟早，低溫養(yǎng)殖品系，源于山東威海的的裙帶菜(Undaria pinnatifida Harv.Suringar)雄配子體Rubisco基因全序列(1-275，rbcL；276-543；Rubisco；544-641，rbcS)序列描述GGGGATGATGTGGTCTACAATTTGGTGGTGGTACTATTGGTCACCCTGATGGTATTCAATCTGGTGCAACAGCAAACCGTGTTGCTCTAGAATCTATGGTTCTAGCTCGTAATGAAGGTCGTGATTATGTTGGAGAAGGTCCTGAAATCTTACGTAATGCAGCGGCTACTTGTGGTCCTTTAAAAGCAGCGTTAGATTTATGGAAAGATATTACTTTTGAGTACACTTCAACAGATACACCTGATTTCGTTGAACTTCCAACTGAAAGCAAATAGTATACTGAAATTAAACTCATAAAAGATTAAGTTAAATTAATTCTAGTTATATTTAAATAGCTAGAAAATATATCTAATAATTTTATCTACTTTATTATTTAAAGTGATATTGTTATAAAATTAAGACTTAACTTTAAATTTGTTATAATTTTAGAAAAATACTTAATACCCCAGATTATTTTAAGTGAAAGTAGAGAGTAAATAAAAATTTTAGTATATAACTAAAAATAAAATTTCTATAATTTATCTTTAAGGAATTTGAATAGTGATGAGAGTTACACAAGGATGTTTTTCGTTTTTACCAGATTTAACTGATGAGCAAATTAAAAAACAAGTTGCTTATGCTATGTCAAAAGGGTGGGCTGG9.序列表SEQ ID NO.1的信息特征長(zhǎng)度675堿基對(duì)類型核酸鏈型雙鏈分子類型cDNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形來(lái)源藻體葉片較寬，成熟早，低溫養(yǎng)殖品系，源于山東榮成的裙帶菜(Undaria pinnatifida Harv.Suringar)雄配子體Rubisco基因全序列(1-277，rbcL；278-545；Rubisco；546-675，rbcS)序列描述GGGGATGATGTGGTTCTACAATTTGGTGGTGGTACTATTGGTCACCCTGGATGGTATTCAATCTGGTGCAACAGCAAACCGTGTTGCTCTAGAATCTATGGTTCTAGCTCGTAATGAAGGTCGTGATTATGTTGGAGAAGGTCCTGAAATCTTACGTAATGCAGCGGCTACTTGTGGTCCTTTAAAAGCAGCGTTAGATTTATGGAAAGATATTACTTTTGAGTACACTTCAACAGATACACCTGATTTCGTTGAACTTCCAACTGAAAGCAAATAGTATACTGAAATTAAACTCATAAAAGATTAAGTTAAATTAATTCTAGTTATATTTA
AATAGCTAGAAAATATATCTAATAATTTTATCTACTTTATTATTTAAAGTGATATTGTTATAAAATTAAGACTTAACTTTAAATTTGTTATAATTTTAGAAAAATACTTAATACCCCAGATTATTTAAGTGAAAGTAGAGAGTAAATAAAAATTTTAGTATATAACTAAAAATAAAATTTCTATAATTTATCTTTAAGGAATTTGAATAGTGATGAGAGTTACACAAGGATGTTTTTCGTTTTTACCAGATTTAACTGATGAGCAAATTAAAAAACAAGTTGCTTATGCTATGTCAAAAGGGTGGGCTGTTAGTGTAGAATGGACAGATGATCCACATCCAC10.序列表SEQ ID NO.1的信息特征長(zhǎng)度669堿基對(duì)類型核酸鏈型雙鏈分子類型cDNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形來(lái)源藻體葉片較寬，成熟早，低溫養(yǎng)殖品系，源于山東榮成的裙帶菜(Undaria pinnatifida Harv.Suringar)雌配子體Rubisco基因全序列(1-276，rbcL；277-544；Rubisco；545-669，rbcS)序列描述GGGGATGATGTGGTTCTACAATTTGGTGGGGGTACTATTGGTCACCCTGATGGTATTCAATCTGGTGCAACAGCAAACCGTGTTGCTCTAGAATCTATGGTTCTAGCTCGTAATGAAGGTCGTGATTATGTTGGAGAAGGTCCTGAAATCTTACGTAATGCAGCGGCTACTTGTGGTCCTTTAAAAGCAGCGTTAGATTTATGGAAAGATATTACTTTTGAGTACACTTCAACAGATACACCTGATTTCGTTGAACTTCCAACTGAAAGCAAATAGTATACTGAAATTAAACTCATAAAAGATTAAGTTAAATTAATTCTAGTTATATTTAAATAGCTAGAAAATATATCTAATAATTTTATCTACTTTATTATTTAAAGTGATATTGTTATAAAATTAAGACTTAACTTTAAATTTGTTATAATTTTAGAAAAATACTTAATACCCCAGATTATTTTAAGTGAAAGTAGAGAGTAAATAAAAATTTTAGTATATAACTAAAAATAAAATTTCTATAATTTATCTTTAAGGAATTTGAATAGTGATGAGAGTTACACAAGGATGTTTTTCGTTTTTACCAGATTTAACTGATGAGCAAATTAAAAAACAAGTTGCTTATGCTATGTCAAAAGGGTGGGCTGTTAGTGTAGGATGGACAGATGATCCACA11.序列表SEQ ID NO.1的信息特征長(zhǎng)度603堿基對(duì)類型核酸鏈型雙鏈分子類型cDNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形來(lái)源藻體較寬，成熟晚，較耐高溫的養(yǎng)殖品系，源于山東日照的裙帶菜(Undaria pinnatifida Harv.Suringar)雄配子體Rubisco基因全序列(1-271，rbcL；272-539；Rubisco；540-603，rbcS)序列描述GATGTGGTTCTACAATTTGGTGGTGGTACTATTGGTCACCCTGGATGGTATTCAATCTGGTGCAACAGCAAACCGTGTTGCTCTAGAATCTATGGTTCTAGCTCGTAATGAAGGTCGTGATTATGTTGGAGAAGGTCCTGAAATCTTACGTAATGCAGCGGCTACTTGTGGTCCTTTAAAAGCAGCGTTAGATTTATGGAAAGATATTACTTTTGAGTACA
CTTCAACAGATACACCTGATTTCGTTGAACTTCCAACTGAAAGCAAATAGTATACTGAAATTAAACTCATAAAAGATTAAGTTAAATTAATTCTAGTTATATTTAAATAGCTAGAAAATATATCTAATAATTTTATCTACTTTATTATTTAAAGTGATATTGTTATAAAATTAAGACTTAACTTTAAATTTGTTATAATTTTAGAAAAATACTTAATACCCCAGATTATTTTAAGTGAAAGTAGAGAGTAAATAAAAATTTTAGTATATAACTAAAAATAAAATTTCTATAATTTATCTTTAAGGAATTTGAATAGTGATGAGAGTTACACAAGGATGTTTTTCGTTTTTACCAGATTTAACTGATGAGCAAATTAAAAAAC12.序列表SEQ ID NO.1的信息特征長(zhǎng)度663堿基對(duì)類型核酸鏈型雙鏈分子類型cDNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形來(lái)源藻體較寬，成熟晚，較耐高溫的養(yǎng)殖品系，源于山東日照的裙帶菜(Undaria pinnatifida Harv.Suringar)雌配子體Rubisco基因全序列(1-284，rbcL；285-552；Rubisco；553-663，rbcS)序列描述TCTATTTAGGGGATGATGTGGTTCTACAATTTGGTGGTGGTACTATTGGTCACCCTGATGGTATTCAATCTGGTGCAACAGCAAACCGTGTTGCTCTAGAATCTATGGTTCTAGCTCGTAATGAAGGTCGTGATTATGTTGGAGAAGGTCCTGAAATCTTACGTAATGCAGCGGCTACTTGTGGTCCTTTAAAAGCAGCGTTAGATTTATGGAAAGATATTACTTTTGAGTACACTTCAACAGATACACCTGATTTCGTTGAACTTCCAACTGAAAGCAAATAGTATACTGAAATTAAACTCATAAAAGATTAAGTTAAATTAATTCTAGTTATATTTAAATAGCTAGAAAATATATCTAATAATTTTATCTACTTTATTATTTAAAGTGATATTGTTATAAAATTAAGACTTAACTTTAAATTTGTTATAATTTTAGAAAAATACTTAATACCCCAGATTATTTTAAGTGAAAGTAGAGAGTAAATAAAAATTTTAGTATATAACTAAAAATAAAATTTCTATAATTTATCTTTAAGGAATTTGAATAGTGATGAGAGTTACACAAGGATGTTTTTCGTTTTTACCAGATTTAACTGATGAGCAAATTAAAAAACAAGTTGCTTATGCTATGTCAAAAGGGTGGGCTGTTAGTGTAGAATGG13.序列表SEQ ID NO.1的信息特征長(zhǎng)度659堿基對(duì)類型核酸鏈型雙鏈分子類型cDNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形來(lái)源引進(jìn)的日本北方養(yǎng)殖品系，在中國(guó)養(yǎng)殖，通過(guò)采孢子分離獲得的裙帶菜雄配子體(Undaria pinnatifida Harv.Suringar)Rubisco基因全序列(1-273，rbcL；274-541；Rubisco；542-659，rbcS)序列描述ATGATGTGGTTCTACAATTTGGTGGTGGTACTATTGGTCACCCTGAATGGTATTCAATCTGGTGCAACAGCAAACCGTGTTGCTCTAGAATCTATGGTTCTAGCTCGTAATGAAGGTCGTGATTATGTTGGAGAAGGTCCTGAAATCTTACGTAATGCAGCGGCTACTTGTGGTCCTTTAAAAGCAGCGTTAGATTTATGGAAAGATATTACTTTTGAGTACACTTCAACAGATACACCTGATTTCGTTGAACTTCCAACTGAAAGCAAATAGTATA
CTGAAATTAAACTCATAAAAGATTAAGTTAAATTAATTCTAGTTATATTTAAATAGCTAGAAAATATATCTAATAATTTTATCTACTTTATTATTTAAAGTGATATTGTTATAAAATTAAGACTTAACTTTAAATTTGTTATAATTTTAGAAAAATACTTAATACCCCAGATTATTTTAAGTGAAAGTAGAGAGTAAATAAAAATTTTAGTATATAACTAAAAATAAAATTTCTATAATTTATCTTTAAGGAATTTGAATAGTGATGAGAGTTACACAAGGATGTTTTTCGTTTTTACCAGATTTAACTGATGAGCAAATTAAAAAACAAGTTGCTTATGCTATGTCAAAAGGGTGGGCTGTTAGTGTAGAATGGACAGATG14.序列表SEQ ID NO.1的信息特征長(zhǎng)度636堿基對(duì)類型核酸鏈型雙鏈分子類型cDNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形來(lái)源引進(jìn)的日本北方養(yǎng)殖品系，在中國(guó)養(yǎng)殖，通過(guò)采孢子分離獲得的裙帶菜雌配子體(Undaria pinnatifida Harv.Suringar)Rubisco基因全序列(1-246，rbcL；247-514；Rubisco；515-636，rbcS)序列描述GGTACTATTGGTCACCCTGATGGTATTCAATCTGGTGCAACAGCAAACCGTGTTGCTCTAGAATCTATGGTTCTAGCTCGTAATGAAGGTCGTGATTATGTTGGAGAAGGTCCTGAAATCTTACGTAATGCAGCGGCTACTTGTGGTCCTTTAAAAGCAGCGTTAGATTTATGGAAAGATATTACTTTTGAGTACACTTCAACAGATACACCTGATTTCGTTGAACTTCCAACTGAAAGCAAATAGTATACTGAAATTAAACTCATAAAAGATTAAGTTAAATTAATTCTAGTTATATTTAAATAGCTAGAAAATATATCTAATAATTTTATCTACTTTATTATTTAAAGTGATATTGTTATAAAATTAAGACTTAACTTTAAATTTGTTATAATTTTAGAAAAATACTTAATACCCCAGATTATTTTAAGTGAAAGTAGAGAGTAAATAAAAATTTTAGTATATAACTAAAAATAAAATTTCTATAATTTATCTTTAAGGAATTTGAATAGTGATGAGAGTTACACAAGGATGTTTTTCGTTTTTACCAGATTTAACTGATGAGCAAATTAAAAAACAAGTTGCTTATGCTATGTCAAAAGGGTGGGCTGTTAGTGTAGAATGGACAGATGATCC15.序列表SEQ ID NO.1的信息特征長(zhǎng)度624堿基對(duì)類型核酸鏈型雙鏈分子類型cDNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形來(lái)源藻體小，比較嫩，源于山東青島的野生種的裙帶菜(Undariapinnatifida Harv.Suringar)雄配字體Rubisco基因全序列(1-228，rbcL；229-496；Rubisco；497-624，rbcS)序列描述GATGGTATTCAATCTGGTGCAACAGCAAACCGTGTTGCTCTAGAATCTATGGTTCTAGCTCGTAATGAAGGTCGTGATTATGTTGGAGAAGGTCCTGAAATCTTACGTAATGCAGCGGCTACTTGTGGTCCTTTAAAAGCAGCGTTAGATTTATGGAAAGATATTACTTTTGAGTACACTTCAACAGATACACCTGATTTCGTTGAACTTCCAACTGAAAGCAAATAGTATACTGAAATTAAACTCATAAAAGATTAAGTTAAATTAATTCTAGT
TATATTTAAATAGCTAGAAAATATATCTAATAATTTTATCTACTTTATTATTTAAAGTGATATTGTTATAAAATTAAGACTTAACTTTAAATTTGTTATAATTTTAGAAAAATACTTAATACCCCAGATTATTTTAAGTGAAAGTAGAGAGTAAATAAAAATTTTAGTATATAACTAAAAATAAAATTTCTATAATTTATCTTTAAGGAATTTGAATAGTGATGAGAGTTACACAAGGATGTTTTTCGTTTTTACCAGATTTAACTGATGAGCAAATTAAAAAACAAGTTGCTTATGCTATGTCAAAAGGGTGGGCTGTTAGTGTAGAATGGACAGATGATCCACATCC16.序列表SEQ ID NO.1的信息特征長(zhǎng)度620堿基對(duì)類型核酸鏈型雙鏈分子類型cDNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形來(lái)源藻體小，比較嫩，源于山東青島的野生種的裙帶菜(Undariapinnatifida Harv.Suringar)雌配字體Rubisco基因全序列(1-252，rbcL；253-520；Rubisco；521-620，rbcS)序列描述GGTGGTGGTACTATTGGTCACCCTGATGGTATTCAATCTGGTGCAACAGCAAACCGTGTTGCTCTAGAATCTATGGTTCTAGCTCGTAATGAAGGTCGTGATTATGTTGGAGAAGGTCCTGAAATCTTACGTAATGCAGCGGCTACTTGTGGTCCTTTAAAAGCAGCGTTAGATTTATGGAAAGATATTACTTTTGAGTACACTTCAACAGATACACCTGATTTCGTTGAACTTCCAACTGAAAGCAAATAGTATACTGAAATTAAACTCATAAAAGATTAAGTTAAATTAATTCTAGTTATATTTAAATAGCTAGAAAATATATCTAATAATTTTATCTACTTTATTATTTAAAGTGATATTGTTATAAAATTAAGACTTAACTTTAAATTTGTTATAATTTTAGAAAAATACTTAATACCCCAGATTATTTTAAGTGAAAGTAGAGAGTAAATAAAAATTTTAGTATATAACTAAAAATAAAATTTCTATAATTTATCTTTAAGGAATTTGAATAGTGATGAGAGTTACACAAGGATGTTTTCGTTTTTACCAGATTTAACTGATGAGCAAATTAAAAAACAAGTTGCTTATGCTATGTCAAAAGGGTGGGCTGTTA17.序列表SEQ ID NO.1的信息特征長(zhǎng)度534堿基對(duì)類型核酸鏈型雙鏈分子類型cDNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形來(lái)源藻體較大，產(chǎn)量高，源于大連水產(chǎn)學(xué)院的裙帶菜(Undariapinnatifid Harv.Suringar)雄配子體的Rubisco基因全序列(1-219，rbcL；220-487；Rubisco；488-534，rbcS)序列描述CAATCTGGTGCAACAGCAAACCGTGTTGCTCTAGAATCTATGGTTCTAGCTCGTAATGAAGGTCGTGATTATGTTGGAGAAGGTCCTGAAATCTTACGTAATGCAGCGGCTACTTGTGGTCCTTTAAAAGCAGCGTTAGATTTATGGAAAGATATTACTTTTGAGTACACTTCAACAGATACACCTGATTTCGTTGAACTTCCAACTGAAAGCAAATAGTATACTGAAATTAAACTCATAAAAGATTAAGTTAAATTAATTCTAGTTATATTTAAAT
AGCTAGAAAATATATCTAATAATTTTATCTACTTTATTATTTAAAGTGATATTGTTATAAAATTAAGACTTAACTTTAAATTTGTTATAATTTTAGAAGAATACTTAATACCCCAGATTATTTTAAGTGAAAGTAGAGAGTAAATAACGATTTTAGTATATAACTAAAAATAAAATTTCTATAATTTATCTTTAAGGAATTTGAATAGTGATGGAGAGTTACACAAGGATGTTTTTCGTTTTTACCAGATTTAACTG18.序列表SEQ ID NO.1的信息特征長(zhǎng)度571堿基對(duì)類型核酸鏈型雙鏈分子類型cDNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形來(lái)源藻體較大，產(chǎn)量高，源于大連水產(chǎn)學(xué)院的裙帶菜(Undariapinnatifida Harv.Suringar)雌配子體的Rubisco基因全序列(1-243，rbcL；244-512；Rubisco；513-571，rbcS)序列描述ACTATTGGTCACCCTGATGGTATTCAATCTGGTGCAACAGCAAACCGTGTTGCTCTAGAATCTATGGTTCTAGCTCGTAATGAAGGTCGTGATTATGTTGGAGAAGGTCCTGAAATCTTACGTAATGCAGCGGCTACTTGTGGTCCTTTAAAAGCAGCGTTAGATTTATGGAAAGATATTACTTTTGAGTACACTTCAACAGATACACCTGATTTCGTTGAACTTCCAACTGAAAGCAAATAGTATACTGAAATTAAACTCATAAAAGATTAAGTTAAATTAATTCTAGTTATATTTAAATAGCTAGAAAATATATCTAATAATTTTATCTACTTTATTATTTAAAGTGATATTGTTATAAAATTAAGACTTAACTTTAAATTTGTTATAATTTTAGAAAAATACTTAATAGCCCAGATTATTTTAAGTGAAAGTAGAGAGTAAATAAAAATTTTAGTATATAACTAAAAATAAAATTTCTATAATTTATCCTTTAAGGAATTTGAATAGTGATGAGAGTTACACAAGGATGTTTTTCGTTTTTACCAGATTTAACTGGATGAGCAAATTA
SEQUENCE LISTING<110>中國(guó)科學(xué)院海洋研究所<120>一種鑒定不同養(yǎng)殖海區(qū)的經(jīng)濟(jì)海藻裙帶菜配子體的方法<130>
<160>18<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>539<212>DNA<213>裙帶菜(Undaria pinnatifida Harv.Suringar)<220>
<221>rbcL<222>(1)..(244)<223>
<220>
<221>Rubisco<222>(245)..(512)<223>
<220>
<221>rbcS<222>(513)..(539)<223>
<400>1tactataggt caccctgatg gtattcaatc tggtgcaaca gcaaaccgtg ttgctctaga60atctatggtt ctagctcgta atgaaggtcg tgattatgtt ggagaaggtc ctgaaatctt120acgtaatgca gcggctactt gtggtccttt aaaagcagcg ttagatttat ggaaagatat180tacttttgag tacacttcaa cagatacacc tgatttcgtt gaacttccaa ctgaaagcaa240atagtatact gaaattaaac tcataaaaga ttaagttaaa ttaattctag ttatatttaa300atagctagaa aatatatcta ataattttat ctactttatt atttaaagtg atattgttat360aaaattaaga cttaacttta aatttattat aattttagaa aaatacttaa taccccagat420
tattttaagt gaaagtagag agtaaataaa aattttagta tataactaaa aataaaattt480ctataattta tctttaagga atttgaatag tgatgagagt tacacaagga tgtttttcg 539<210>2<211>579<212>DNA<213>裙帶菜(Undaria pinnatifida Harv.Suringar)<220>
<221>rbcL<222>(1)..(268)<223>
<220>
<221>Rubisco<222>(269)..(536)<223>
<220>
<221>rbcS<222>(537)..(579)<223>
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1.一種鑒定不同養(yǎng)殖海區(qū)的經(jīng)濟(jì)海藻裙帶菜配子體的方法，其特征在于利用海藻裙帶菜配子體Rubisco基因及兩側(cè)大小亞基部分的DNA序列對(duì)不同來(lái)源的裙帶菜配子體進(jìn)行鑒定。
2.按照權(quán)利要求1所述的鑒定不同養(yǎng)殖海區(qū)的經(jīng)濟(jì)海藻裙帶菜配子體的方法，其特征在于1)提取需要鑒定的海藻裙帶菜總DNA；2)利用特異引物P1和P4的序列對(duì)總DNA進(jìn)行Rubisco基因及其兩側(cè)大小亞基PCR擴(kuò)增反應(yīng)，P1和P4的序列分別為正向P1為5’GCCAAATGCACCAACTTCTT3’，位于rbcL上，反向P4為5’AGACCCCATAATTCCC 3’，位于rbcS上；3)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化；4)對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；5)對(duì)獲得的DNA序列進(jìn)行數(shù)據(jù)分析用對(duì)位排列軟件Clustal W和Genedoc進(jìn)行對(duì)位排列，并輔以人工校對(duì)，用系統(tǒng)進(jìn)化分析軟件MEGA2.1和PHYLIP 3.57分別分析各樣品DNA序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中各個(gè)序列間的差異，進(jìn)行親緣和進(jìn)化關(guān)系分析。
3.按照權(quán)利要求2所述的鑒定不同養(yǎng)殖海區(qū)的經(jīng)濟(jì)海藻裙帶菜配子體的方法，其特征在于用于Rubisco基因及其兩側(cè)大小亞基擴(kuò)增的反應(yīng)液20μL中含10mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/LMgCl2，Taq polymerase 1U，4種dNTP各2mmol/L，兩個(gè)引物各4-6mmol/L，DNA模板40-70ng。
4.按照權(quán)利要求2所述的鑒定不同養(yǎng)殖海區(qū)的經(jīng)濟(jì)海藻裙帶菜配子體的方法，其特征在于用于Rubisco基因及其兩側(cè)大小亞基擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為96℃預(yù)變性3分鐘；94℃2分鐘，53-57℃10秒鐘，72℃1分鐘；2個(gè)循環(huán)；94℃10秒鐘，53-57℃10秒鐘，72℃2分鐘，33-38個(gè)循環(huán)；72℃延伸5分鐘。
5.按照權(quán)利要求2所述的鑒定不同養(yǎng)殖海區(qū)的經(jīng)濟(jì)海藻裙帶菜配子體的方法，其特征在于用于Rubisco基因及其兩側(cè)大小亞基擴(kuò)增后測(cè)序所設(shè)計(jì)的引物為P15’GCCAAATGCACCAACTTCTT3’，P45’AGACCCCATAATTCCC3’。
6.按照權(quán)利要求2所述的鑒定不同養(yǎng)殖海區(qū)的經(jīng)濟(jì)海藻裙帶菜配子體的方法，其特征在于用P1和P4進(jìn)行裙帶菜配子體Rubisco基因擴(kuò)增后，獲得的序列長(zhǎng)度在534-675bp之間，其中Rubisco基因序列長(zhǎng)度為268bp。
全文摘要
本發(fā)明涉及來(lái)自中國(guó)不同養(yǎng)殖海區(qū)的經(jīng)濟(jì)海藻裙帶菜(Undariapinnatifida)配子體Rubisco基因及兩側(cè)大小亞基(rbcL和rbcS)部分DNA序列的獲得及利用該序列對(duì)不同來(lái)源的裙帶菜配子體進(jìn)行鑒定的方法。本發(fā)明首先建立了一套裙帶菜配子體高質(zhì)量DNA的制備方法，接著對(duì)裙帶菜不同配子體Rubisco基因及兩側(cè)大小亞基DNA序列進(jìn)行了測(cè)序，獲得了Rubisco基因全序列及其大小亞基(rbcL和rbcS)的部分序列(見序列附表)；并與Genbank中已經(jīng)注冊(cè)的裙帶菜Rubisco基因序列進(jìn)行了同源性比較，比較了不同來(lái)源裙帶菜配子體Rubisco基因全序列及其大小亞基核苷酸位點(diǎn)差異，分析了中國(guó)不同養(yǎng)殖地點(diǎn)的裙帶菜起始來(lái)源地，方法簡(jiǎn)便，從分子角度出發(fā)，使鑒定結(jié)果更準(zhǔn)確、可靠。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1796574SQ20041010046
公開日2006年7月5日 申請(qǐng)日期2004年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月24日
發(fā)明者段德麟, 王迪, 胡自民 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所