專(zhuān)利名稱(chēng)：干擾素－τ重組蛋白突變體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及干擾素重組蛋白突變體及其制備方法，更具體地說(shuō)涉及干擾素-τ重組蛋白突變體及其制備方法。
背景技術(shù)：
干擾素(interferon，簡(jiǎn)稱(chēng)IFN)是一種細(xì)胞因子，研究表明其具有I型、II型和III型三種類(lèi)型(劉新垣，第14次全國(guó)干擾素及細(xì)胞因子學(xué)術(shù)會(huì)議，2004。)；I型又分為干擾素-α、干擾素-β、干擾素-ω、干擾素-τ，II型僅有一類(lèi)，即干擾素-γ，III型有λ1、λ2和λ3三種亞型。
干擾素-τ最先在反芻動(dòng)物(以綿羊、山羊、牛為代表)中發(fā)現(xiàn)(Spencer TE，Becker WC，George P，Mirando MA，Ogle TF，Bazer FW.Ovine interferon-tau inhibits estrogenreceptor up-regulation and estrogen-induced luteolysis in cyclic ewes.EndocriNology.1995 Nov；136(11)4932-44.)，同妊娠識(shí)別有關(guān)，具有抗黃體溶解的作用(即能夠延長(zhǎng)黃體壽命)，始稱(chēng)蛋白質(zhì)-X，后來(lái)被命名為滋養(yǎng)層蛋白-1(簡(jiǎn)稱(chēng)TP-1)或滋養(yǎng)素(Trophoblastin)。此后，通過(guò)蛋白質(zhì)及DNA測(cè)序，確認(rèn)為一種新型的I型干擾素，因其由滋養(yǎng)層分泌，被命名為干擾素-τ(interferon-τ，簡(jiǎn)稱(chēng)IFN-τ)。干擾素-τ的蛋白序列(172個(gè)氨基酸的蛋白序列)如SEQ ID NO.18。
干擾素-τ沒(méi)有內(nèi)含子，屬于一個(gè)多基因家族，并與許多其它I型干擾素基因相同。例如，干擾素-τ的基因長(zhǎng)度共972個(gè)堿基對(duì)(Base Pairs，簡(jiǎn)稱(chēng)bp)，并具有一個(gè)基因長(zhǎng)度為595個(gè)bp的開(kāi)讀碼框(ORF)，其編碼內(nèi)含有195個(gè)氨基酸的蛋白前體，經(jīng)加工切除23個(gè)氨基酸的信號(hào)序列后，得到172個(gè)氨基酸的成熟蛋白質(zhì)，這些均與干擾素-ω相同。再例如，干擾素α基因編碼一個(gè)166個(gè)氨基酸的成熟蛋白質(zhì)，在C端(又稱(chēng)羧基端)比干擾素-τ少了6個(gè)氨基酸；最近的研究表明(Ealy AD，Alexenko AP，Keisler DH，Roberts RM.Loss of the signature sixcarboxyl amiNo acid tail from ovine interferon-tau does Not affect biologicalactivity.Biol Reprod.1998 Jun；58(6)1463-8.)，去除這6個(gè)氨基酸既不影響羊干擾素-τ的抗病毒活性，也不影響其延長(zhǎng)黃體壽命的能力。此外，干擾素-τ與與其它I型干擾素(α、β、ω)均具有不同程度的序列相似性，例如與干擾素-α及干擾素-ω的cDNA序列同源性分別為45~55％和70％。
以前對(duì)干擾素-τ的研究多集中于它的羧基端(Li J，Roberts RM.Structure-functionrelationships in the interferon-tau(IFN-tau).Changes in receptor binding and inantiviral and antiproliferative activities resulting from site-directed mutagenesisperformed near the carboxyl terminus.J Biol Chem.1994 Oct 7；269(40)24826-33.)。但是，近期的研究發(fā)現(xiàn)(Pontzer CH，Ott TL，Bazer FW，Johnson HM.Structure/functionstudies with interferon tauevidence for multiple active sites.J Interferon Res.1994 Jun；14(3)133-41.)，干擾素-τ的N末端的特定氨基酸與其活性密切相關(guān)。利用干擾素-τ分子模型檢測(cè)其活性序列，確定了N端A螺旋和AB環(huán)為受體結(jié)合部位。將干擾素-τ序列中的6個(gè)氨基酸殘基用干擾素-α相應(yīng)部位的氨基酸代替，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(Shorts LH，DanczCE，Shupp JW，Pontzer CH.Characterization of N-terminal interferon tau mutantsP26Laffords enhanced activity and lack of toxicity.Exp Biol Med(Maywood).2004 Feb；229(2)194-202.)，26位的脯氨酸(Pro，P)突變成亮氨酸(Leu，L)，增加了干擾素-τ和受體的結(jié)合力，從而增強(qiáng)了其抗病毒和抗黃體溶解的作用，但同時(shí)不改變其體外的細(xì)胞毒性。
另外，綿羊IFN-τ(簡(jiǎn)稱(chēng)o IFN-τ)的全部氨基酸均未被糖基化，而牛IFN-τ(簡(jiǎn)稱(chēng)b IFN-τ)的全部氨基酸均被糖基化，即其N(xiāo)端連接糖蛋白(簡(jiǎn)稱(chēng)Asn78)。b IFN-τ與o IFN-τ氨基酸序列的同源性很高，在編碼區(qū)內(nèi)，二者轉(zhuǎn)錄物大約有90％同源性，由它們推斷的氨基酸序列大約有80％相似性。盡管如此，在早期妊娠過(guò)程中，二者對(duì)前列腺素F2α(Prostaglandin，簡(jiǎn)稱(chēng)PGF2α)分泌動(dòng)力學(xué)的影響有差異，b IFN-τ抑制PGF2α分泌的效果較強(qiáng)。此外，Meyer等在1995年曾報(bào)道，未糖基化的綿羊重組IFN-τ及牛重組IFN-τ在延長(zhǎng)黃體壽命方面均有效，表明牛IFN-τ的糖基化對(duì)其抗黃體溶解功能不是必需的。
與干擾素-α相似，干擾素-τ的不同亞型之間也會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)?，F(xiàn)已確證，干擾素-τ在臨床應(yīng)用上是安全有效的(J.M.Soos.Harvard Univ.)，該蛋白的突變體也是安全的，并適宜于藥物使用，能夠用于制備預(yù)防和治療感染性疾病及治療腫瘤疾病的藥物，既可以單獨(dú)使用，也可以同其他藥物組合使用。從以上分析可以看出，與其他干擾素相比，干擾素-τ具有更好的應(yīng)用前景。
干擾素-τ的基因已被克隆到現(xiàn)有的一些表達(dá)載體中，如大腸桿菌、酵母、桿狀病毒(Reilly，et al.，1992；Beames，et al.，1991；Clontech，Palo Alto Calif.)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞(Clontech，Palo Alto Calif.；Gibco-BRL，Gaithersburg Md.)等，表達(dá)的蛋白既有天然蛋白，也有融合蛋白，純化方法涉及鹽析、離子交換和親和層析等。但這些方法都存在一些共性的問(wèn)題，例如得到的蛋白并非完全天然，純化方法難以大規(guī)模純化等，因此限制了干擾素-τ的臨床應(yīng)用。
例如，專(zhuān)利WO0231178公開(kāi)了在酵母高效表達(dá)羊干擾素-τ的方法，具體操作如下①將編碼干擾素-τ的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)體系的載體，酶切位點(diǎn)是EcoR I和Not I，得到干擾素-τ重組表達(dá)載體；②將該載體轉(zhuǎn)入宿主菌，按常規(guī)方法篩選獲得表達(dá)干擾素-τ的工程菌；③搖瓶培養(yǎng)，即得羊干擾素-τ重組蛋白。
該方法減少羊干擾素-τ基因中的重復(fù)序列，降低基因中的G+C含量，減少或消除回文順序；并以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和Yarrowia sp.作為表達(dá)宿主細(xì)胞，表達(dá)量最高達(dá)690mg/L，但是該方法得到的蛋白并非完全天然，成熟蛋白N末端多了4個(gè)外源性氨基酸，因此限制了該干擾素-τ的臨床應(yīng)用。
迄今為止，尚未見(jiàn)改進(jìn)的制備干擾素-τ重組蛋白方法方面的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種干擾素突變體以及干擾素-τ重組蛋白的制備方法。
本發(fā)明的上述目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明公開(kāi)了一種干擾素-τ的突變體。
優(yōu)選的，本發(fā)明的干擾素-τ的突變體是特定位點(diǎn)的單一點(diǎn)突變；更優(yōu)選的，是5位谷氨酰胺突變成谷氨酸(Gln5Glu)的點(diǎn)突變。
或者優(yōu)選的，本發(fā)明的干擾素-τ的突變體，是特定位點(diǎn)的兩點(diǎn)突變；更優(yōu)選的，是5(谷氨酰胺突變成谷氨酸，Gln5Glu)，13(谷氨酸突變成精氨酸，Glu13Arg)，16(賴(lài)氨酸突變成甲硫氨酸，Lys16Met)，19(天冬氨酸突變成丙氨酸，Asp19Ala)，24(亮氨酸突變成異亮氨酸，Leu24Ile)，26(脯氨酸突變成亮氨酸，Pro26Leu)，34(賴(lài)氨酸突變成組氨酸，Lys34His)位點(diǎn)中任意兩點(diǎn)的突變；進(jìn)一步優(yōu)選的，是5，26位點(diǎn)的突變。
或者優(yōu)選的，本發(fā)明的干擾素-τ的突變體，是特定位點(diǎn)的三點(diǎn)突變；更優(yōu)選的，是5(谷氨酰胺突變成谷氨酸，Gln5Glu)，13(谷氨酸突變成精氨酸，Glu13Arg)，16(賴(lài)氨酸突變成甲硫氨酸，Lys16Met)，19(天冬氨酸突變成丙氨酸，Asp19Ala)，24(亮氨酸突變成異亮氨酸，Leu24Ile)，26(脯氨酸突變成亮氨酸，Pro26Leu)，34(賴(lài)氨酸突變成組氨酸，Lys34His)位點(diǎn)中任意三點(diǎn)的突變。
或者優(yōu)選的，本發(fā)明的干擾素-τ的突變體，是特定位點(diǎn)的四點(diǎn)突變；更優(yōu)選的，是5(谷氨酰胺突變成谷氨酸，Gln5Glu)，13(谷氨酸突變成精氨酸，Glu13Arg)，16(賴(lài)氨酸突變成甲硫氨酸，Lys16Met)，19(天冬氨酸突變成丙氨酸，Asp19Ala)，24(亮氨酸突變成異亮氨酸，Leu24Ile)，26(脯氨酸突變成亮氨酸，Pro26Leu)，34(賴(lài)氨酸突變成組氨酸，Lys34His)位點(diǎn)中任意四點(diǎn)的突變。
或者優(yōu)選的，本發(fā)明的干擾素-τ的突變體，是特定位點(diǎn)的五點(diǎn)突變；更優(yōu)選的，是5(谷氨酰胺突變成谷氨酸，Gln5Glu)，13(谷氨酸突變成精氨酸，Glu13Arg)，16(賴(lài)氨酸突變成甲硫氨酸，Lys16Met)，19(天冬氨酸突變成丙氨酸，Asp19Ala)，24(亮氨酸突變成異亮氨酸，Leu24Ile)，26(脯氨酸突變成亮氨酸，Pro26Leu)，34(賴(lài)氨酸突變成組氨酸，Lys34His)位點(diǎn)中任意五點(diǎn)的突變。
或者優(yōu)選的，本發(fā)明的干擾素-τ的突變體，是特定位點(diǎn)的六點(diǎn)突變；更優(yōu)選的，是5(谷氨酰胺突變成谷氨酸，Gln5Glu)，13(谷氨酸突變成精氨酸，Glu13Arg)，16(賴(lài)氨酸突變成甲硫氨酸，Lys16Met)，19(天冬氨酸突變成丙氨酸，Asp19Ala)，24(亮氨酸突變成異亮氨酸，Leu24Ile)，26(脯氨酸突變成亮氨酸，Pro26Leu)，34(賴(lài)氨酸突變成組氨酸，Lys34His)位點(diǎn)中任意六點(diǎn)的突變。
或者優(yōu)選的，本發(fā)明的干擾素-τ的突變體，是特定位點(diǎn)的七點(diǎn)突變；更優(yōu)選的，是5(谷氨酰胺突變成谷氨酸，Gln5Glu)，13(谷氨酸突變成精氨酸，Glu13Arg)，16(賴(lài)氨酸突變成甲硫氨酸，Lys16Met)，19(天冬氨酸突變成丙氨酸，Asp19Ala)，24(亮氨酸突變成異亮氨酸，Leu24Ile)，26(脯氨酸突變成亮氨酸，Pro26Leu)，34(賴(lài)氨酸突變成組氨酸，Lys34His)位點(diǎn)的突變。
本發(fā)明還公開(kāi)了一種干擾素-τ重組蛋白的制備方法，該方法包括如下步驟①將編碼干擾素-τ的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)體系的載體，得到干擾素-τ重組表達(dá)載體；②將該載體轉(zhuǎn)入宿主菌，按常規(guī)方法篩選獲得表達(dá)干擾素-τ的工程菌；③在適合所述蛋白表達(dá)的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)該工程菌；④從該工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)物中，分離、純化出所述的目的蛋白即干擾素-τ重組蛋白。
優(yōu)選的，所述的干擾素-τ是包括干擾素-τ或其變體、片段，或其與其它蛋白融合的蛋白中的一種；更優(yōu)的，所述的干擾素-τ或其變體、片段選自上述特定位點(diǎn)突變的序列和SEQID No17所示的序列。
所述的表達(dá)體系優(yōu)選包括酵母、大腸桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞中的一種；再優(yōu)選的，所述的表達(dá)體系是酵母表達(dá)體系；更優(yōu)選的，所述的酵母表達(dá)體系是甲醇酵母表達(dá)體系；進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的甲醇酵母表達(dá)體系的甲醇酵母是包括所有能夠利用甲醇作為唯一碳源的酵母；其中再進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的甲醇酵母是畢赤酵母；再進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的畢赤酵母是pichia pastoris或pichia methanolica中的一種。
當(dāng)所述的表達(dá)體系是酵母表達(dá)體系時(shí)，所述的表達(dá)載體優(yōu)選美國(guó)Invitrogen公司的商業(yè)化的載體，即包括pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC、pPIC9、pMETαA、pMETαB、pMETαC、pGAPZαA、pGAPZαB、pGAPZαC、pHIL-D2、pHIL-S1和pPIC3.5K。本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思如下1.一種氨基酸可以有多種密碼子編碼，但密碼子編碼獲得的干擾素-τ的氨基酸序列不變。在某些實(shí)施方案中，可以根據(jù)實(shí)際需要對(duì)核酸密碼子進(jìn)行突變，以便得到活性更高、毒性更低的干擾素-τ重組蛋白，一般選用甲醇酵母偏愛(ài)密碼子，本發(fā)明也可以考慮優(yōu)選之。
2.干擾素的表達(dá)體系包括酵母、大腸桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞以及昆蟲(chóng)細(xì)胞等表達(dá)體系，其中酵母表達(dá)體系特別是甲醇酵母表達(dá)體系是近幾年發(fā)展起來(lái)的高效表達(dá)系統(tǒng)，它能利用很強(qiáng)的啟動(dòng)子，具有極快的細(xì)胞生長(zhǎng)速度，所以表達(dá)量相對(duì)很高，本發(fā)明也可以考慮選用之。
3.以前人們構(gòu)建的重組質(zhì)粒存在的主要問(wèn)題是得到的蛋白并非完全天然、難以大規(guī)模純化等，因此，如果改變酶切位點(diǎn)，就有可能得到完全天然的干擾素-τ；而且如果將干擾素-τ基因克隆到一個(gè)合適的表達(dá)載體和方法中，例如轉(zhuǎn)化甲醇酵母，篩選出高表達(dá)菌株，然后摸索發(fā)酵、純化等有關(guān)工藝，就能夠?qū)崿F(xiàn)干擾素-τ蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)，從而為其臨床應(yīng)用奠定產(chǎn)業(yè)化基礎(chǔ)。
本發(fā)明對(duì)以上的構(gòu)思進(jìn)行了逐一驗(yàn)證，研究結(jié)果均證明本構(gòu)思的正確性。
采用表達(dá)體系表達(dá)干擾素-τ重組蛋白，并進(jìn)行分離純化的方法，包括如下步驟①將編碼干擾素-τ的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)體系的載體，酶切位點(diǎn)是Xho I和Xba I/SnaB I/EcoR I，得到干擾素-τ重組表達(dá)載體；②將該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主菌，按常規(guī)方法篩選獲得表達(dá)干擾素-τ的工程菌；這里所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主菌的轉(zhuǎn)入方法是包括轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染等中的一種，所述的轉(zhuǎn)化方法是包括電轉(zhuǎn)化或原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化等方法。
③搖瓶培養(yǎng)，得到目的蛋白即所述的干擾素-τ重組蛋白。
這里所述的干擾素-τ是包括干擾素-τ或其變體、片段等衍生物，或其與其它蛋白融合的蛋白或其變體、片段中的一種。其中，干擾素-τ或變體、片段選自以下A.SEQ ID No18(172個(gè)氨基酸的蛋白序列)所示的干擾素-τ序列(Charlier M，Hue D，Martal J.，Gaye P..Cloning and expression of cDNA encoding ovine trophoblastinitsidentity with a class-II alpha interferon.Gene，1989，77，2341-348.)B.SEQ ID No18所示的干擾素-τ的點(diǎn)突變序列(Shorts LH，Dancz CE，Shupp JW，Pontzer CH.Characterization of N-terminal interferon tau mutantsP26L affordsenhanced activity and lack of toxicity.Exp Biol Med(Maywood).2004 Feb；229(2)194-202.)，其中包括(a)5位谷氨酰胺突變成谷氨酸(Gln5Glu)的序列
(b)13位谷氨酸突變成精氨酸(Glu13Arg)的序列(c)16位賴(lài)氨酸突變成甲硫氨酸(Lys16Met)的序列(d)19位天冬氨酸突變成丙氨酸(Asp19Ala)的序列(e)24位亮氨酸突變成異亮氨酸(Leu24Ile)的序列(f)26位脯氨酸突變成亮氨酸(Pro26Leu)的序列(g)34位賴(lài)氨酸突變成組氨酸(Lys34His)的序列(h)以上所有點(diǎn)突變的2點(diǎn)突變，3點(diǎn)突變，4點(diǎn)突變，5點(diǎn)突變，6點(diǎn)突變和7點(diǎn)突變的突變組合。
C.SEQ ID No17(516個(gè)堿基的核苷酸序列)所示的干擾素-τ序列這里所述的表達(dá)體系是包括酵母、大腸桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、病毒等表達(dá)體系中的一種。
所述的酵母表達(dá)體系是包括甲醇酵母表達(dá)體系、啤酒酵母表達(dá)體系等中的一種，甲醇酵母表達(dá)體系是包括所有能夠利用甲醇作為唯一碳源的酵母，例如包括畢赤氏酵母、H.Polymorpha、Candida Bodinii等中的一種，畢赤氏酵母是包括pichia pastoris或pichiamethanolica等(Cregg J M，et al.Pichia pastoris as a host system.for transformations.Mol.Cell.Biol，1985(5)3376～3385.)；啤酒酵母表達(dá)體系是Saccharomycescerevisiae。酵母表達(dá)體系特別是甲醇酵母表達(dá)體系是近幾年發(fā)展起來(lái)的高效表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)這套系統(tǒng)表達(dá)的蛋白很多都達(dá)到克級(jí)，比其它系統(tǒng)高10倍至100倍，而目前常用的表達(dá)系統(tǒng)一般在毫克級(jí)，這無(wú)疑是一個(gè)大突破。所述的甲醇酵母則是包括所有能夠利用甲醇作為唯一碳源的酵母，例如，畢赤酵母能夠以甲醇作為唯一碳源，進(jìn)行快速繁殖生長(zhǎng)，報(bào)答蛋白具有很好的表達(dá)可控制性，而且能夠分泌表達(dá)，具有蛋白易于純化、表達(dá)量高、成本較低等優(yōu)點(diǎn)(陳償.甲醇畢赤氏酵母表達(dá)體系.熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999.2，36-43.)。
所述的大腸桿菌表達(dá)體系是包括BL21(DE3)表達(dá)體系、BL21(DE3)pLysS表達(dá)體系、Rose表達(dá)系統(tǒng)、M15表達(dá)系統(tǒng)等中的一種。
所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系是包括CHO表達(dá)體系、NSO表達(dá)系統(tǒng)、COS表達(dá)系統(tǒng)、HeLa表達(dá)系統(tǒng)、MCF-7表達(dá)體系等中的一種。
所述的病毒表達(dá)體系是包括桿狀病毒表達(dá)體系、腺病毒表達(dá)體系、慢病毒表達(dá)系統(tǒng)、逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)系統(tǒng)等中的一種。
表達(dá)體系所使用的表達(dá)載體是包括各種商業(yè)化的表達(dá)載體，例如美國(guó)Invitrogen公司的商業(yè)化的載體如pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC、pPIC9、pPIC9K、pMETαA、pMETαB、pMETαC、pGAPZαA、pGAPZαB、pGAPZαC、pHIL-D2、pHIL-S1、pPIC3.5K、pAO815等。
但是，為了大規(guī)模培養(yǎng)和純化目的蛋白，則需改進(jìn)該制備方法，即在步驟①、②的基礎(chǔ)上，增加步驟④、⑤，具體操作是④在適合所述蛋白表達(dá)的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)該工程菌；⑤從該工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)物中，分離、純化出所述的目的蛋白即干擾素-τ重組蛋白。步驟④所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法是包括以下步驟A.將經(jīng)篩選的工程菌株活化后，接入培養(yǎng)基中制備種子液；所述的培養(yǎng)基是包括緩沖甘油復(fù)合培養(yǎng)基(Buffered Glycerol-complex Medium，簡(jiǎn)稱(chēng)BMGY培養(yǎng)基)、酵母抽提物蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，簡(jiǎn)稱(chēng)YPD培養(yǎng)基)等中的一種。
B.將種子液培養(yǎng)過(guò)夜后，接種至發(fā)酵罐中，發(fā)酵用培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(例如基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基)，發(fā)酵條件控制為pH4.0~8.0，溫度20℃~37℃，溶氧控制在30％以上，優(yōu)選pH4.5~7.0、溫度28℃~37℃，進(jìn)一步優(yōu)選pH5.0、溫度30℃。
C.種子液培養(yǎng)4~24小時(shí)后，開(kāi)始補(bǔ)料，加入甘油或葡萄糖等；當(dāng)菌體光密度值(opticaldensity，簡(jiǎn)稱(chēng)OD)達(dá)到高密度(OD600為15~200)，加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)，控制pH3.0~7.0，誘導(dǎo)12~84小時(shí)結(jié)束；優(yōu)選pH3~4.0、誘導(dǎo)14~34小時(shí)，進(jìn)一步優(yōu)選pH3.0、誘導(dǎo)24小時(shí)。
這里所述的誘導(dǎo)劑是甲醇。
步驟⑤所述的分離、純化方法是包括以下步驟A.收集發(fā)酵產(chǎn)物，干擾素-τ表達(dá)產(chǎn)物存在于培養(yǎng)基中或菌體中；如果表達(dá)產(chǎn)物在菌體中，則需破菌；B.采用常規(guī)純化方法，經(jīng)多步純化獲得產(chǎn)物。
這里所述的常規(guī)純化方法是包括Chelating金屬螯合柱層析(GE Healthcare)、離子柱層析(GE Healthcare)、反向?qū)游?GE Healthcare)、透析(GE Healthcare)、超濾(GE Healthcare)或凝膠過(guò)濾(GE Healthcare)等中的一種。
用十二烷基磺酸納—聚丙稀酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和反相—高效液相(RP-HPLC)檢驗(yàn)，獲得純度大于95％的干擾素-τ重組蛋白。
本發(fā)明具有以下有益效果本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了干擾素-τ重組蛋白在表達(dá)體系中的高效表達(dá)，表達(dá)量達(dá)1000mg/L~1500mg/L，并建立了蛋白質(zhì)大規(guī)模純化的方法，使生產(chǎn)成本大幅度降低，能夠?qū)崿F(xiàn)該重組蛋白的批量生產(chǎn)，為其實(shí)際應(yīng)用打下了良好的基礎(chǔ)。采用本發(fā)明的方法制備干擾素-τ重組蛋白，方法簡(jiǎn)單，操作性強(qiáng)，回收率高，并且不損傷蛋白活性，其體外抗病毒活性高。


圖1是本發(fā)明重組質(zhì)粒1的構(gòu)建示意圖；
圖2是本發(fā)明干擾素-τ在甲醇酵母中的表達(dá)；圖3是本發(fā)明重組質(zhì)粒2的構(gòu)建示意圖；圖4是本發(fā)明重組質(zhì)粒3的示意圖其中“Ampicillin”表示氨芐抗性基因，“a factor”表示“a因子”；圖5是本發(fā)明重組質(zhì)粒4的示意圖；圖6是本發(fā)明重組質(zhì)粒5的示意圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
本發(fā)明公開(kāi)干擾素-τ特定位點(diǎn)突變的突變體及其重組蛋白的制備方法，以滿(mǎn)足人們疾病治療、科學(xué)研究、藥物開(kāi)發(fā)等方面的需要。
下面以使用甲醇酵母表達(dá)體系為例，詳細(xì)闡述本發(fā)明干擾素-τ重組蛋白的制備方法。該方法包括如下具體步驟①將編碼干擾素-τ的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)體系的載體，得到干擾素-τ重組表達(dá)載體；②將該載體轉(zhuǎn)入宿主菌，按常規(guī)方法篩選獲得表達(dá)干擾素-τ的工程菌；③搖瓶培養(yǎng)，即所述的目的蛋白即干擾素-τ重組蛋白。
為了大規(guī)模培養(yǎng)和純化目的蛋白，在步驟①、②的基礎(chǔ)上，增加步驟④、⑤，具體操作是④在適合所述蛋白表達(dá)的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)該工程菌；⑤從該工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)物中，分離、純化出所述的目的蛋白即干擾素-τ重組蛋白。
步驟④所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法是包括以下步驟A.將經(jīng)篩選的工程菌株活化后，接入培養(yǎng)基中制備種子液；本發(fā)明所述的培養(yǎng)基是包括緩沖甘油復(fù)合培養(yǎng)基(Buffered Glycerol-complex Medium，簡(jiǎn)稱(chēng)BMGY培養(yǎng)基)、酵母抽提物蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基(Yeast Extract Peptone DextroseMedium，簡(jiǎn)稱(chēng)YPD培養(yǎng)基)等中的一種。
B.將種子液培養(yǎng)過(guò)夜后，接種至發(fā)酵罐中，發(fā)酵用培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(例如基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基)，發(fā)酵條件控制為pH4.0~8.0，溫度20℃~37℃，溶氧控制在30％以上，優(yōu)選pH4.5~7.0、溫度28℃~37℃，進(jìn)一步優(yōu)選pH5.0、溫度30℃。
C.種子液培養(yǎng)4~24小時(shí)后，開(kāi)始補(bǔ)料，加入甘油或葡萄糖等，當(dāng)菌體光密度值(opticaldensity，簡(jiǎn)稱(chēng)OD)達(dá)到高密度(OD600為15~200)，加入誘導(dǎo)劑甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，控制pH3.0~7.0，誘導(dǎo)12~84小時(shí)結(jié)束；優(yōu)選pH3~4.0、誘導(dǎo)14~34小時(shí)，進(jìn)一步優(yōu)選pH3.0、誘導(dǎo)24小時(shí)。
步驟⑤所述的分離、純化方法是包括以下步驟
A.收集發(fā)酵產(chǎn)物，干擾素-τ表達(dá)產(chǎn)物存在于培養(yǎng)基中或菌體中；如果表達(dá)產(chǎn)物在菌體中，則需破菌；B.采用常規(guī)純化方法，經(jīng)多步純化獲得產(chǎn)物。用十二烷基磺酸納—聚丙稀酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和反相—高效液相(RP-HPLC)檢驗(yàn)，獲得純度大于95％的干擾素-τ重組蛋白。
這里所述的常規(guī)純化方法是包括Chelating金屬螯合柱層析(GE Healthcare)、離子柱層析(GE Healthcare)、反向?qū)游?GE Healthcare)、透析(GE Healthcare)、超濾(GE Healthcare)或凝膠過(guò)濾(GE Healthcare)等中的一種。
本發(fā)明提供的干擾素-τ重組蛋白的制備方法所得到的是天然的干擾素-τ蛋白，表達(dá)量1200~1500mg/L，該蛋白N端和C端不存在任何修飾，表達(dá)量高，純化工藝簡(jiǎn)單，易于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。同時(shí)，我們用人的干擾素-α相應(yīng)位置氨基酸點(diǎn)突變的干擾素-τ，不但得到了高效、低毒、突變的干擾素-τ重組蛋白，并且不增加機(jī)體的異源反應(yīng)，具有廣泛的醫(yī)用前景。
下面通過(guò)實(shí)施例來(lái)具體說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，所述的實(shí)施例是為了更好地闡述本發(fā)明，并不是用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1干擾素-τ基因的獲得設(shè)計(jì)并合成P1，P2(見(jiàn)序列表中的SEQ ID No.1、2)，以P1、P2為引物，引物P1中引入Xho I酶切位點(diǎn)和酵母α信號(hào)肽切割位點(diǎn)(KEX2酶識(shí)別位點(diǎn))，引物P2中引入Xba I酶切位點(diǎn)。以從山羊滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞中抽提的總RNA為模板合成的第一鏈cDNA為模板，PCR(聚合酶鏈反應(yīng)，Polymerase Chain Reaction)擴(kuò)增干擾素-τ基因，5’端和3’端分別引入XhoI和Xba I位點(diǎn)。其中PCR條件為94℃1分鐘，52℃1分鐘，72℃1分30秒，共35輪循環(huán)。PCR產(chǎn)物回收后克隆至pGEM-T載體中，得到重組質(zhì)粒pGEM-T-干擾素-τ，經(jīng)測(cè)序確定為干擾素-τ的基因序列。
實(shí)施例2用PCR的方法直接構(gòu)建突變體2.1單一點(diǎn)突變的構(gòu)建設(shè)計(jì)并合成引物P3，P4，P5，P6，P7，P8，P9，P10，P11，P12，P13，P14，P15，P16(見(jiàn)序列表中的SEQ ID No3、4、5、6、7、8、9、10、11、13、14、15、16)，以重組質(zhì)粒pGEM-T-干擾素-τ為模板，分別以P1和P3/P5/P7/P9/P11/P13/P15，P2和P4/P6/P8/P10/P12/P14/P16為引物進(jìn)行PCR，回收后得產(chǎn)物A1/A2/A3/A4/A5/A6/A7和B1/B2/B3/B4/B5/B6/B7。分別以A1和B1、A2和B2、A3和B3、A4和B4、A5和B5、A6和B6、A7和B7為模板，以P1和P2為引物，進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)物回收后克隆至pGEM-T載體中，得到重組質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序確定分別為干擾素-τ的Gln5Glu、Glu13Arg、Lys16Met、Asp19Ala、Leu24Ile、Pro26Leu、Lys34His點(diǎn)突變的基因序列，分別標(biāo)記為pGEM-T-干擾素-τ-5，pGEM-T-干擾素-τ-13，pGEM-T-干擾素-τ-16，pGEM-T-干擾素-τ-19，pGEM-T-干擾素-τ-24，pGEM-T-干擾素-τ-26，pGEM-T-干擾素-τ-34。
2.2多個(gè)點(diǎn)突變的構(gòu)建以重組質(zhì)粒pGEM-T-干擾素-τ-5為模板，分別以P1和P5/P7/P9/P11/P13/P15，P2和P6/P8/P10/P12/P14/P16為引物進(jìn)行PCR，回收后得產(chǎn)物C1/C2/C3/C4/C5/C6和D1/D2/D3/D4/D5/D6。分別以C1和D1、C2和D2、C3和D3、C4和D4、C5和D5、C6和D6為模板，以P1和P2為引物，進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)物回收后克隆至pGEM-T載體中，得到重組質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序確定分別為干擾素-τ-5的Glu13Arg、Lys16Met、Asp19Ala、Leu24Ile、Pro26Leu、Lys34His點(diǎn)突變的基因序列，分別標(biāo)記為pGEM-T-干擾素-τ-5，13，pGEM-T-干擾素-τ-5，16，pGEM-T-干擾素-τ-5，19，pGEM-T-干擾素-τ-5，24，pGEM-T-干擾素-τ-5，26，pGEM-T-干擾素-τ-5，34。
按以上方法，分別選擇不同的模板和引物，得到干擾素-τ的Gln5Glu、Glu13Arg、Lys16Met、Asp19Ala、Leu24Ile、Pro26Leu、Lys34His位點(diǎn)突變的從單一點(diǎn)突變到7點(diǎn)都突變的所有突變序列。
因?yàn)楦蓴_素-τ的原始序列和點(diǎn)突變后的序列都不存在Xho I、Xba I、Sna BI、EcoR I及Not I的酶切位點(diǎn)，所以以下的實(shí)驗(yàn)操作對(duì)所設(shè)計(jì)的序列普遍適用，實(shí)驗(yàn)操作以原始序列為例，但不僅限于原始序列。
實(shí)施例3用PCR的方法在載體中構(gòu)建突變體3.1單一點(diǎn)突變的構(gòu)建以重組質(zhì)粒pGEM-T-干擾素-τ為模板，分別以P3和P4、P5和P6、P7和P8、P9和P10、P11和P12、P13和P14、P15和P16為引物，用STRATAGENE的PfuTurbo DNApolymerase進(jìn)行PCR。PCR條件95℃ 1分鐘，60℃ 50秒，68℃ 4分，共18輪循環(huán)。PCR產(chǎn)物用Dpn I消化1小時(shí)，轉(zhuǎn)化DH5α，經(jīng)測(cè)序確定分別為干擾素-τ的5、13、16、19、24、26、34點(diǎn)突變的基因序列，分別標(biāo)記為pGEM-T-干擾素-τ-5，pGEM-T-干擾素-τ-13，pGEM-T-干擾素-τ-16，pGEM-T-干擾素-τ-19，pGEM-T-干擾素-τ-24，pGEM-T-干擾素-τ-26，pGEM-T-干擾素-τ-34。
3.2多個(gè)點(diǎn)突變的構(gòu)建以重組質(zhì)粒pGEM-T-干擾素-τ-5為模板，分別以P5和P6，P7和P8，P9和P10，P11和P12，P13和P14，P15和P16為引物進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物用Dpn I消化1小時(shí)，轉(zhuǎn)化DH5α，經(jīng)測(cè)序確定分別為干擾素-τ-5的13、16、19、24、26、34點(diǎn)突變的基因序列，分別標(biāo)記為pGEM-T-干擾素-τ-5，13，pGEM-T-干擾素-τ-5，16，pGEM-T-干擾素-τ-5，19，pGEM-T-干擾素-τ-5，24，pGEM-T-干擾素-τ-5，26，pGEM-T-干擾素-τ-5，34。
按以上方法，分別選擇不同的模板和引物，得到干擾素-τ的Gln5Glu、Glu13Arg、Lys16Met、Asp19Ala、Leu24Ile、Pro26Leu、Lys34His位點(diǎn)突變的從單一點(diǎn)突變到7點(diǎn)都突變的所有突變體序列pGEM-T載體。
因?yàn)楦蓴_素-τ的原始序列和點(diǎn)突變后的序列都不存在Xho I、Xba I、Sna BI、EcoR I及Not I的酶切位點(diǎn)，所以以下的實(shí)驗(yàn)操作對(duì)所設(shè)計(jì)的序列普遍適用，實(shí)驗(yàn)操作以原始序列為例，但不僅限于原始序列。
實(shí)施例4表達(dá)載體為pPICZαC的工程菌的構(gòu)建工程菌的構(gòu)建包括本發(fā)明所述制備方法的步驟①和②，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
本實(shí)施例使用美國(guó)Invitrogen公司的EasySelectTMPichia表達(dá)系統(tǒng)，利用pPICZαC為表達(dá)載體，將干擾素-τ基因克隆于α因子信號(hào)肽基因后，來(lái)表達(dá)干擾素-τ重組蛋白。
用Xho I和Xba I切開(kāi)表達(dá)質(zhì)粒pPICZαC，然后與Xho I和Xba I處理后的干擾素-τ基因片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10F’(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)，涂布含有25ug/mlZeocinTM的低鹽LB平板上。篩選轉(zhuǎn)化子得到重組質(zhì)粒，然后用Xho I和Xba I切開(kāi)重組質(zhì)粒，與Xho I和Xba I處理后的Fc基因片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10F’，涂布含有25ug/mlZeocinTM的低鹽LB平板上，篩選轉(zhuǎn)化子得到重組質(zhì)粒1(圖1)。經(jīng)DNA序列分析與設(shè)計(jì)序列相同。
4.1將重組質(zhì)粒1以轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入宿主菌X-33大量抽提重組質(zhì)粒1，用Sac I線(xiàn)性化，然后用無(wú)水乙醇沉淀，70％乙醇洗滌后晾干，溶于適量的TE溶液中(濃度約為1μg/μL)。然后電轉(zhuǎn)化制備好的X-33宿主菌，涂布在含有100ug/ml ZeocinTM的YPDS篩選培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3天，得到酵母轉(zhuǎn)化子。
4.2表達(dá)篩選工程菌從轉(zhuǎn)化子中挑選20個(gè)單克隆，分別接種到25ml的BMGY培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至OD600到5.0，離心收集菌體，懸浮到150ml的BMMY培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)，每24小時(shí)加入1.5ml甲醇，誘導(dǎo)表達(dá)72小時(shí)，取樣進(jìn)行SDS-PAGE，看到在27kd左右有明顯的表達(dá)條帶，為干擾素-τ，篩選高表達(dá)菌株為工程菌(圖2)。
4.3抑制細(xì)胞病變活性測(cè)定檢測(cè)了干擾素-τ，干擾素-τ-26和干擾素-τ-5，26的活性。檢測(cè)干擾素的方法有多種。基本的方法是利用干擾素保護(hù)細(xì)胞微量細(xì)胞病變法。將培養(yǎng)的Wish細(xì)胞轉(zhuǎn)入96孔細(xì)胞板，按照30000-40000個(gè)細(xì)胞加入孔內(nèi)，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層。待測(cè)樣本用完全培養(yǎng)基按照10倍或100倍稀釋?zhuān)♂寴颖炯尤爰?xì)胞板過(guò)夜培養(yǎng)(大致為18-24小時(shí))，同一稀釋度做3個(gè)復(fù)孔，吸去上清培養(yǎng)基，加入VSV病毒(1∶100)進(jìn)行攻擊。根據(jù)細(xì)胞病變狀態(tài)，終止培養(yǎng)前3～4h加入5mg/ml MTT，每孔15μL，加入適量生理鹽水，用滴管輕輕吹吸棄去懸浮病變細(xì)胞和死細(xì)胞，加入200μl二甲亞砜(DMSO)，作用10min測(cè)OD(570nm)，判斷干擾素對(duì)活細(xì)胞的保護(hù)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干擾素-τ同現(xiàn)有干擾素抗病毒活性相當(dāng)(表1)。
表1、干擾素-τ重組蛋白的抑制細(xì)胞病變活性

注此次IFN-τ重組蛋白的效價(jià)經(jīng)過(guò)目測(cè)與病毒對(duì)照、細(xì)胞對(duì)照比較，其效價(jià)在1∶64000~128000之間。標(biāo)準(zhǔn)干擾素的效價(jià)是1∶64000。在此后的稀釋度已不能保護(hù)細(xì)胞，換句話(huà)，即病毒對(duì)細(xì)胞出現(xiàn)病變作用。
實(shí)施例5表達(dá)載體為pPIC9的工程菌的構(gòu)建本實(shí)施例使用美國(guó)Invitrogen公司Pichia表達(dá)系統(tǒng)，利用pPIC9為表達(dá)載體，來(lái)表達(dá)干擾素-τ重組蛋白。
5.1重組質(zhì)粒2的構(gòu)建設(shè)計(jì)并合成引物P19(見(jiàn)下文的序列表中的SEQ ID No19)，P19引物引入Sna BI，以P1和P19為引物，重組質(zhì)粒pGEM-T-干擾素-τ為模板，PCR擴(kuò)增干擾素-τ基因，電泳回收基因片段，用Xho I和Sna BI酶切處理并回收。同時(shí)用Xho I和Sna BI酶切pPIC9質(zhì)粒，電泳回收后與Xho I和Sna BI處理的干擾素-τ基因片段連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)，涂布在含有100ug/ml的氨芐青霉素的LB平板上，篩選轉(zhuǎn)化子得重組質(zhì)粒pPIC9-干擾素-τ。DNA序列分析證明基因序列正確，標(biāo)為重組質(zhì)粒2(圖3)。
5.2將重組質(zhì)粒2以轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入宿主菌GS115大量抽提重組質(zhì)粒2，用Sal I線(xiàn)性化，然后用無(wú)水乙醇沉淀，70％乙醇洗滌后晾干，溶于適量的TE溶液中(濃度約為1μg/μL)。然后電轉(zhuǎn)化制備好的GS115宿主菌，涂布在MD篩選培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3天，得到酵母轉(zhuǎn)化子。
5.3表達(dá)篩選工程菌從MD平板上選20個(gè)單克隆分別接種到3ml MGY培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48小時(shí)后加入27ml的MM培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)，表達(dá)72小時(shí)，取樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，篩選高表達(dá)的菌株為工程菌株。
實(shí)施例6表達(dá)載體為pMETαA的工程菌的構(gòu)建本實(shí)施例使用美國(guó)Invitrogen公司pichia methanolica表達(dá)系統(tǒng)，利用pMETαA為表達(dá)載體，來(lái)表達(dá)干擾素-τ重組蛋白。
6.1重組質(zhì)粒3的構(gòu)建用Xho I和Not I雙酶切實(shí)施例2中的重組質(zhì)粒2，回收干擾素-τ蛋白基因片段，與XhoI和Not I酶切處理的pMETαA質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布在含有100ug/ml的氨芐青霉素的LB平板上，篩選轉(zhuǎn)化子得重組質(zhì)粒3(圖4)。
6.2將重組質(zhì)粒3以轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入宿主菌PMAD11大量抽提重組質(zhì)粒3，用Apa I線(xiàn)性化，然后用無(wú)水乙醇沉淀，70％乙醇洗滌后晾干，溶于適量的TE溶液中(濃度約為1μg/μL)。然后電轉(zhuǎn)化制備好PMAD11宿主菌，涂布在MD篩選培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3天，得到酵母轉(zhuǎn)化子。
6.3表達(dá)篩選工程菌從MD平板上挑選20個(gè)單克隆分別接種到50ml的BMDY培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)到OD600為6.0，離心收集菌體，重新懸浮到5ml的BMMY培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)，每24小時(shí)補(bǔ)加50ul的甲醇，誘導(dǎo)表達(dá)72小時(shí)，取樣SDS-PAGE，篩選高表達(dá)菌株為工程菌。
實(shí)施例7表達(dá)載體為pGAPZαA的工程菌的構(gòu)建本實(shí)施例使用美國(guó)Invitrogen公司表達(dá)系統(tǒng)，利用連續(xù)表達(dá)載體pGAPZα為表達(dá)載體，來(lái)表達(dá)干擾素-τ重組蛋白。
7.1重組質(zhì)粒4的構(gòu)建用Xho I和Not I雙酶切實(shí)施例2中的重組質(zhì)粒2，回收干擾素-τ蛋白基因片段，與XhoI和Not I酶切處理的pGAPZαA質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10F’，涂布含有25ug/ml ZeocinTM的低鹽LB平板上，篩選轉(zhuǎn)化子得到重組質(zhì)粒4(圖5)。
7.2將重組質(zhì)粒4以轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入宿主菌X-33大量抽提重組質(zhì)粒4，用Avr II線(xiàn)性化，然后用無(wú)水乙醇沉淀，70％乙醇洗滌后晾干，溶于適量的TE溶液中(濃度約為1μg/μL)。然后電轉(zhuǎn)化制備好X-33宿主菌，涂布含有100ug/ml ZeocinTM的YPDS篩選培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3天，得到酵母轉(zhuǎn)化子。
7.3表達(dá)篩選工程菌從轉(zhuǎn)化子中挑選20個(gè)單克隆，分別接種到50ml的YPD培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)表達(dá)72小時(shí)，取樣SDS-PAGE，篩選高表達(dá)菌株為工程菌。
實(shí)施例8表達(dá)載體為pHIL-S1的工程菌的構(gòu)建本實(shí)施例使用美國(guó)Invitrogen公司Pichia表達(dá)系統(tǒng)，利用pHIL-S1為表達(dá)載體，來(lái)表達(dá)干擾素-τ重組蛋白。
8.1重組質(zhì)粒5的構(gòu)建設(shè)計(jì)并合成引物P20(見(jiàn)下文的序列表中的SEQ ID No20)，P20引物引入EcoR I，以P1和P20為引物，重組質(zhì)粒pGEM-T-干擾素-τ為模板，PCR擴(kuò)增干擾素-τ基因，電泳回收基因片段，用Xho I和EcoR I酶切處理并回收。同時(shí)用Xho I和EcoR I酶切pHIL-S1質(zhì)粒，電泳回收后與Xho I和EcoR I處理的干擾素-τ基因片段連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)，涂布在含有100ug/ml的氨芐青霉素的LB平板上，篩選轉(zhuǎn)化子得重組質(zhì)粒pHIL-S1-干擾素-τ。DNA序列分析證明基因序列正確，標(biāo)為重組質(zhì)粒5(圖6)。
8.2將重組質(zhì)粒5以轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入宿主菌GS115大量抽提重組質(zhì)粒5，用Sac I線(xiàn)性化，然后用無(wú)水乙醇沉淀，70％乙醇洗滌后晾干，溶于適量的TE溶液中(濃度約為1μg/μL)。然后電轉(zhuǎn)化制備好的GS115宿主菌，涂布在MD篩選培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3天，得到酵母轉(zhuǎn)化子。
8.3表達(dá)篩選工程菌從MD平板上選20個(gè)單克隆分別接種到3ml BMGY培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48小時(shí)后加入27ml的MM培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)，表達(dá)72小時(shí)，取樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，篩選高表達(dá)的菌株為工程菌株。
實(shí)施例9工程菌的發(fā)酵將實(shí)施例1中獲得的工程菌株接種于BMGY培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24小時(shí)后，作為種子液接種于發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入微量元素的溶液，發(fā)酵溫度30℃，pH5.0，控制溶解氧不低于30％，菌體生長(zhǎng)24小時(shí)后開(kāi)始補(bǔ)加甘油，同時(shí)將pH下調(diào)到3.0。菌體OD達(dá)到200時(shí)開(kāi)始加入甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。起始甲醇添加量控制為每升每小時(shí)1~2ml，隨后逐漸增大每升每小時(shí)至15~20ml，通過(guò)調(diào)節(jié)攪拌速度和通氣量保持溶氧值大于30％，必要時(shí)通入純氧。連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)72小時(shí)后收獲培養(yǎng)液，離心收集上清，4.0℃保存。
實(shí)施例10發(fā)酵產(chǎn)物的純化將實(shí)施例5獲得的發(fā)酵液用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH至7.4~7.6，用MWCO20KD的超濾膜濃縮至原體積的1/5，上樣至Chelating螯合層析柱，穿出上G25Desault柱，流出樣品直接上SP柱，在280nm紫外檢測(cè)儀監(jiān)測(cè)下，收集流出。取樣分析，SDS-PAGE顯示蛋白純度大于95％。
就以上具體的實(shí)施例而言，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了干擾素-τ在甲醇酵母中的表達(dá)，并建立了蛋白質(zhì)純化的方法，使得大批量、低成本的生產(chǎn)成為可能，為干擾素-τ重組蛋白的臨床應(yīng)用打下了良好基礎(chǔ)。
實(shí)施例11制備的干擾素-τ重組蛋白與其他干擾素的毒性實(shí)驗(yàn)對(duì)比將細(xì)胞懸液加入滅菌的96孔板，每孔200μl。內(nèi)含細(xì)胞2×104、10％新生牛血清及RP-MI1640培養(yǎng)液，同時(shí)加入不同濃度的干擾素-τ。在37℃5％CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)48小時(shí)后，加入12.07mmol/L的MTT 20μl/孔，繼續(xù)在前述條件下培養(yǎng)4小時(shí)，2000r/min離心10分鐘，棄上清。加入二甲基亞砜150μl/孔，溶解沉淀，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀540nm波長(zhǎng)條件測(cè)定每孔的A值(吸光度)。取3孔A值的平均數(shù)，按下式計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率(％)細(xì)胞抑制率(％)＝(1-試驗(yàn)孔A平均值/對(duì)照孔A平均值)×100％體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)表明，干擾素-τ在高劑量時(shí)也不會(huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)(見(jiàn)表2)。
表2、干擾素體外和體內(nèi)的毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

注“+”表示和對(duì)照相比差異顯著；“-”表示無(wú)明顯差異。
序列表<110>上海富純中南生物技術(shù)有限公司<120>干擾素-τ重組蛋白突變體及其制備方法<160>20<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1gtatctctcg agaagagatg ttacctatct cagagac 37<210>2<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2cgctctagat taaggtgagt tcagatctcc ac 32<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3cagcatgagt ctctcagata ggtaaca 27<210>4<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4tgttacctat ctgagagact catgctg27<210>5<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5gtccaggagc ttgaggtttc tcctggcatc cagcatga38<210>6<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6
tcatgctgga tgccaggaga aacctcaagc tcctggac 38<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>7attcggtcca ggagcatgag gttctccctg30<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>8cagggagaac ctcatgctcc tggaccgaat 30<210>9<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>9gagagtctgt tcattcgcgc caggagcttg aggttc 36<210>10
<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>10gaacctcaag ctcctggcgc gaatgaacag actctc 36<210>11<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>11acaggaatga ggggagattc tgttcattcg gtcc 34<210>12<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>12ggaccgaatg aacagaatct cccctcattc ctgt 34<210>13<211>34<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>13ctgcagacag gaatgaaggg agagtctgtt catt34<210>14<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>14aatgaacaga ctctcccttc attcctgtct gcag34<210>15<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>15ggggaagacc aaagtcgtgt ctgtcctgca gaca 34<210>16<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature
<223>引物<400>16tgtctgcagg acagacacga ctttggtctt cccc 34<210>17<211>516<212>DNA<213>Ovine<220>
<221>CDS<222>(1)..(516)<400>17tgt tac cta tct cag aga ctc atg ctg gat gcc agg gag aac ctc aag 48Cys Tyr Leu Ser Gln Arg Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys1 5 10 15ctc ctg gac cga atg aac aga ctc tcc cct cat tcc tgt ctg cag gac 96Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp20 25 30aga aaa gac ttt ggt ctt ccc cag gag atg gtg gag ggc gac cag ctc 144Arg Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Asp Gln Leu35 40 45cag aag gac cag gcc ttc cct gtg ctc tac gag atg ctc cag cag agc 192Gln Lys Asp Gln Ala Phe Pro Val Leu Tyr Glu Met Leu Gln Gln Ser50 55 60ttc aac ctc ttc tac aca gag cac tcc tct gct gcc tgg gac acc acc 240Phe Asn Leu Phe Tyr Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr65 70 75 80ctc ctg gac cag ctc tgc act gga ctc caa cag cag ctg gac cac ctg 288Leu Leu Asp Gln Leu Cys Thr Gly Leu Gln Gln Gln Leu Asp His Leu85 90 95gac acc tgc agg ggt caa gtg atg gga gag gaa gac tct gaa ctg ggt 336Asp Thr Cys Arg Gly Gln Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Glu Leu Gly100 105 110aac atg gac ccc att gtg acc gtg aag aag tac ttc cag ggc atc tat 384
Asn Met Asp Pro Ile Val Thr Val Lys Lys Tyr Phe Gln Gly Ile Tyr115 120 125gac tac ctg caa gag aag gga tac agc gac tgc gcc tgg gaa atc gtc 432Asp Tyr Leu Gln Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val130 135 140aga gtc gag atg atg aga gcc ctc act gta tca acc acc ttg caa aaa 480Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu Thr Val Ser Thr Thr Leu Gln Lys145 150 155 160agg tta aca aag atg ggt gga gat ctg aac tca cct 516Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp Leu Asn Ser Pro165 170<210>18<211>172<212>PRT<213>0vine<400>18Cys Tyr Leu Ser Gln Arg Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys1 5 10 15Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Asp Gln Leu35 40 45Gln Lys Asp Gln Ala Phe Pro Val Leu Tyr Glu Met Leu Gln Gln Ser50 55 60Phe Asn Leu Phe Tyr Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr65 70 75 80Leu Leu Asp Gln Leu Cys Thr Gly Leu Gln Gln Gln Leu Asp His Leu85 90 95
Asp Thr Cys Arg Gly Gln Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Glu Leu Gly100 105 110Asn Met Asp Pro Ile Val Thr Val Lys Lys Tyr Phe Gln Gly Ile Tyr115 120 125Asp Tyr Leu Gln Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val130 135 140Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu Thr Val Ser Thr Thr Leu Gln Lys145 150 155 160Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp Leu Asn Ser Pro165 170<210>19<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>19ttctacgtat caaggtgagt tcagatctcc 30<210>20<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物
<400>20ggggaattct taaggtgagt tcagatc 2權(quán)利要求
1.一種干擾素-τ的突變體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干擾素-τ的突變體，其特征在于，是特定位點(diǎn)的單一點(diǎn)突變。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的干擾素-τ的突變體，其特征在于，是5位谷氨酰胺突變成谷氨酸(Gln5Glu)的點(diǎn)突變。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干擾素-τ的突變體，其特征在于，是特定位點(diǎn)的兩點(diǎn)突變。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的干擾素-τ的突變體，其特征在于，是5(谷氨酰胺突變成谷氨酸，Gln5Glu)，13(谷氨酸突變成精氨酸，Glu13Arg)，16(賴(lài)氨酸突變成甲硫氨酸，Lys16Met)，19(天冬氨酸突變成丙氨酸，Asp19Ala)，24(亮氨酸突變成異亮氨酸，Leu24Ile)，26(脯氨酸突變成亮氨酸，Pro26Leu)，34(賴(lài)氨酸突變成組氨酸，Lys34His)位點(diǎn)中任意兩點(diǎn)的突變。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的干擾素-τ的突變體，其特征在于，是5(谷氨酰胺突變成谷氨酸，Gln5Glu)，26(脯氨酸突變成亮氨酸，Pro26Leu)位點(diǎn)的突變。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干擾素-τ的突變體，其特征在于，是特定位點(diǎn)的三點(diǎn)突變。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的干擾素-τ的突變體，其特征在于，是5(谷氨酰胺突變成谷氨酸，Gln5Glu)，13(谷氨酸突變成精氨酸，Glu13Arg)，16(賴(lài)氨酸突變成甲硫氨酸，Lys16Met)，19(天冬氨酸突變成丙氨酸，Asp19Ala)，24(亮氨酸突變成異亮氨酸，Leu24Ile)，26(脯氨酸突變成亮氨酸，Pro26Leu)，34(賴(lài)氨酸突變成組氨酸，Lys34His)位點(diǎn)中任意三點(diǎn)的突變。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干擾素-τ的突變體，其特征在于，是特定位點(diǎn)的四點(diǎn)突變。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的干擾素-τ的突變體，其特征在于，是5(谷氨酰胺突變成谷氨酸，Gln5Glu)，13(谷氨酸突變成精氨酸，Glu13Arg)，16(賴(lài)氨酸突變成甲硫氨酸，Lys16Met)，19(天冬氨酸突變成丙氨酸，Asp19Ala)，24(亮氨酸突變成異亮氨酸，Leu24Ile)，26(脯氨酸突變成亮氨酸，Pro26Leu)，34(賴(lài)氨酸突變成組氨酸，Lys34His)位點(diǎn)中任意四點(diǎn)的突變。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干擾素-τ的突變體，其特征在于，是特定位點(diǎn)的五點(diǎn)突變。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的干擾素-τ的突變體，其特征在于，是5(谷氨酰胺突變成谷氨酸，Gln5Glu)，13(谷氨酸突變成精氨酸，Glu13Arg)，16(賴(lài)氨酸突變成甲硫氨酸，Lys16Met)，19(天冬氨酸突變成丙氨酸，Asp19Ala)，24(亮氨酸突變成異亮氨酸，Leu24Ile)，26(脯氨酸突變成亮氨酸，Pro26Leu)，34(賴(lài)氨酸突變成組氨酸，Lys34His)位點(diǎn)中任意五點(diǎn)的突變。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干擾素-τ的突變體，其特征在于，是特定位點(diǎn)的六點(diǎn)突變。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的干擾素-τ的突變體，其特征在于，是5(谷氨酰胺突變成谷氨酸，Gln5Glu)，13(谷氨酸突變成精氨酸，Glu13Arg)，16(賴(lài)氨酸突變成甲硫氨酸，Lys16Met)，19(天冬氨酸突變成丙氨酸，Asp19Ala)，24(亮氨酸突變成異亮氨酸，Leu24Ile)，26(脯氨酸突變成亮氨酸，Pro26Leu)，34(賴(lài)氨酸突變成組氨酸，Lys34His)位點(diǎn)中任意六點(diǎn)的突變。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干擾素-τ的突變體，其特征在于，是特定位點(diǎn)的七點(diǎn)突變。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的干擾素-τ的突變體，其特征在于，是5(谷氨酰胺突變成谷氨酸，Gln5Glu)，13(谷氨酸突變成精氨酸，Glu13Arg)，16(賴(lài)氨酸突變成甲硫氨酸，Lys16Met)，19(天冬氨酸突變成丙氨酸，Asp19Ala)，24(亮氨酸突變成異亮氨酸，Leu24Ile)，26(脯氨酸突變成亮氨酸，Pro26Leu)，34(賴(lài)氨酸突變成組氨酸，Lys34His)位點(diǎn)的突變。
17.一種干擾素-τ重組蛋白的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟①將編碼干擾素-τ的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)體系的載體，得到干擾素-τ重組表達(dá)載體；②將該載體轉(zhuǎn)入宿主菌，按常規(guī)方法篩選獲得表達(dá)干擾素-τ的工程菌；③在適合所述蛋白表達(dá)的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)該工程菌；④從該工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)物中，分離、純化出所述的目的蛋白即干擾素-τ重組蛋白。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的干擾素-τ重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述的干擾素-τ是包括干擾素-τ或其變體、片段，或其與其它蛋白融合的蛋白中的一種。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的干擾素-τ重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述的干擾素-τ或其變體、片段選自權(quán)利要求3，5，8，10，12，14，16的序列和SEQ ID No17所示的序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求17或18任一項(xiàng)所述的干擾素-τ重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述的表達(dá)體系是包括酵母、大腸桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞中的一種。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的干擾素-τ重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述的表達(dá)體系是酵母表達(dá)體系。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的干擾素-τ重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述的酵母表達(dá)體系是甲醇酵母表達(dá)體系。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的干擾素-τ重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述的甲醇酵母表達(dá)體系的甲醇酵母是包括所有能夠利用甲醇作為唯一碳源的酵母。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的干擾素-τ重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述的甲醇酵母是畢赤酵母。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的干擾素-τ重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述的畢赤酵母是pichia pastoris或pichia methanolica中的一種。
26.根據(jù)權(quán)利要求21所述的干擾素-τ重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述的表達(dá)載體是美國(guó)Invitrogen公司的商業(yè)化的載體，即包括pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC、pPIC9、pMETαA、pMETαB、pMETαC、pGAPZαA、pGAPZαB、pGAPZαC、pHIL-D2、pHIL-S1和pPIC3.5K。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)干擾素－τ特定位點(diǎn)突變的突變體及其重組蛋白的制備方法。所述特定位點(diǎn)為是5(谷氨酰胺突變成谷氨酸)，13(谷氨酸突變成精氨酸)，16(賴(lài)氨酸突變成甲硫氨酸)，19(天冬氨酸突變成丙氨酸)，24(亮氨酸突變成異亮氨酸)，26(脯氨酸突變成亮氨酸)，34(賴(lài)氨酸突變成組氨酸)位點(diǎn)中任意單點(diǎn)至七點(diǎn)的突變。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了干擾素－τ重組蛋白在表達(dá)體系中的高效表達(dá)；采用本發(fā)明的方法制備干擾素－τ重組蛋白，方法簡(jiǎn)單，操作性強(qiáng)，回收率高，并且不損傷蛋白活性，其體外抗病毒活性高。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1796415SQ20041009335
公開(kāi)日2006年7月5日 申請(qǐng)日期2004年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月22日
發(fā)明者倪健, 何瑋, 楊子義, 羅鵬, 楊武劍 申請(qǐng)人:上海富純中南生物技術(shù)有限公司