專利名稱：棉花乙烯響應(yīng)元件綁定因子蛋白編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物基因工程領(lǐng)域的編碼序列，特別是一種棉花乙烯響應(yīng)元件綁定因子蛋白編碼序列。
背景技術(shù)：
植物激素乙烯調(diào)節(jié)植物多種脅迫反應(yīng)和發(fā)育性適應(yīng)。乙烯參與高等植物的多種生理過程，如促進(jìn)番茄果實(shí)成熟，野生型擬南芥在乙烯處理后表現(xiàn)明顯的細(xì)胞膨大受阻，萌發(fā)的種子在乙烯處理后表現(xiàn)三重效應(yīng)頂端彎曲增大，胚軸向光性膨脹，根瘤生長和細(xì)胞命運(yùn)決定等。傷害，疾病，水淹，高鹽，干旱，低溫等環(huán)境脅迫都能誘導(dǎo)高等植物合成乙烯，通過乙烯信號傳導(dǎo)過程，誘導(dǎo)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，對外界環(huán)境脅迫產(chǎn)生響應(yīng)，在高等植物中都發(fā)現(xiàn)了乙烯信號傳導(dǎo)過程。乙烯響應(yīng)元件綁定因子(ERF2)，是乙烯信號傳導(dǎo)過程中的轉(zhuǎn)錄因子，它接受乙烯信號途徑中上游組成的信號，起始在啟動子區(qū)域含有GCC元件的相關(guān)抗性基因轉(zhuǎn)錄，在乙烯信號傳導(dǎo)過程中起著重要作用。
經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)檢索中發(fā)現(xiàn)雜志《The Plant Cell(植物細(xì)胞)》，在2000，12393-404發(fā)表了文章“Arabidopsis ethylene-responsive element bindingfactors act as transcriptional activators or repressor of GCC box-mediated geneexpression(擬南芥乙烯響應(yīng)元件綁定因子作為GCC盒調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活子或抑止子)”，該文獻(xiàn)雖然對乙烯信號途徑轉(zhuǎn)錄因子激活或者抑止目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄作用做了充分肯定，但截止目前的報(bào)道顯示該基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株的抗病、成熟、耐鹽和溫度脅迫方面的效果沒有明顯提高，此外至今尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明主題有密切聯(lián)系文獻(xiàn)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種棉花乙烯響應(yīng)元件綁定因子蛋白編碼序列，使其在植物細(xì)胞抗病耐鹽上具有明顯的作用，能夠明顯提高植物細(xì)胞在病菌和滲透脅迫條件下的抗性，降低環(huán)境脅迫對植物的損害。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有棉花乙烯響應(yīng)元件綁定因子(ERF2)蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第139-1098位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能與SEQ ID NO.3中從核苷酸第139-1098位的核苷酸序列雜交。
所述的編碼序列具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
所述的編碼序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第139-1098位的核苷酸序列。
本發(fā)明分離出的棉花抗病耐鹽類相關(guān)蛋白質(zhì)多肽ERF2，它包括具有SEQ IDNO.3氨基酸序列的多肽，較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽，該多肽能夠在鹽、低溫、水淹和脫落酸(ABA)處理下均能發(fā)揮作用，而這些逆境脅迫均可誘導(dǎo)植物體產(chǎn)生乙烯。并通過乙烯信號傳導(dǎo)過程，誘導(dǎo)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，抵御外界環(huán)境脅迫。
本發(fā)明提供的載體，它包含上述的DNA分子。一種核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。
本發(fā)明用上述DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它是真核細(xì)胞。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“棉花乙烯響應(yīng)元件綁定因子蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有棉花ERF2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第139-1098位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框第139-1098位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.3中第139-1098位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.3所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下(70％-85％一致性)，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下(85％以上一致性)與SEQ ID NO.3中從核苷酸第139-1098位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸第139-1098位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與天然的棉花EEF2相同功能的蛋白的SEQ ID NO.3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入-和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，術(shù)語“棉花乙烯響應(yīng)元件綁定因子蛋白或多肽”指具有棉花ERF2蛋白活性的SEQ ID NO.3序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與天然棉花ERF2相關(guān)相同功能的、SEQ ID NO.3序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括棉花ERF2蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發(fā)明的棉花ERF2多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與棉花ERF2相關(guān)DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用棉花ERF2多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。
在本發(fā)明中，“棉花ERF2保守性變異多肽”指與SEQ ID NO.3的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。
表1


表282％identity in 960nt overlapQuery130 agaaagaggaagaaccagtatcgtggaatccggcagcgcccatggggtaaatgggctgct 189||||||||||||| ||||| || || ||| | ||||| || ||||||| ||||| |||Sbjct375 agaaagaggaagaatcagtaccgggggatcagacagcgtccttggggtaagtgggcagct 434Query190 gagatccgtgacccaaggaaaggggttagggtctggttaggaactttcaatactgctgaa 249|| || ||||| ||||||||||| || | |||||| | || ||||||||| | || |||Sbjct435 gaaatacgtgatccaaggaaaggtattcgagtctggcttggtactttcaattcagccgaa 494Query250 gaagctgcgagagcttatgatgctgaggcacggagaattcgtggtaagaaagctaaggtg 309|| || || |||||||||||||||||||| || || || | || |||||||||||||||Sbjct495 gaggcagccagagcttatgatgctgaggcgcgaaggatcagaggcaagaaagctaaggtg 554Query310 aactt 314|||||Sbjct555 aactt 559
Query棉花Ethylene Response Element Binding Factor的核酸序列Sbjct番茄Ethylene Response Element Binding Factor的核酸序列(AY044235)表2為本發(fā)明的棉花ERF2蛋白與番茄ERF蛋白的核苷酸序列的同源比較(GAP)表。
表348％identity in 319aa overlap.65％similarity in 319aa overlapQuery73 GSNSEKSMQFDGQAEKCAKRKRKNQYRGIRQRPWGKWAAEIRDPRKGVRVWLGTFNTXXX 252G S+ S + +A++ +KRKRKNQYRGIRQRPWGKWAAEIRDPRKG+RVWLGTFN+Sbjct78 GPKSVRSGDSNCEADRSSKRKRKNQYRGIRQRPWGKWAAEIRDPRKGIRVWLGTFNSAEE 137Query253 XXXXXXXXXXXIRGKKAKVNFPNETPRTSPKHAVKTNSQKPLSKSNLSPVQLNLDQNYNY 432IRGKKAKVNFP+E P + + A+K N QK L + L+ VQ N+ YSbjct138 AARAYDAEARRIRGKKAKVNFPDEAPVSVSRRAIKQNPQKALREETLNTVQPNM----TY 193Query433 LSQPEQEYFDTMGFVEEKPLVNQFAYVDPVPTSIDAG---SNQSDNAPLYFNSDQGSNSI 603+S +D+ F EEKP Q+ + + T++D G + S +YF+SD+ SN+Sbjct194 ISNLDGGSDDSFSFFEEKPATKQYGFENVSFTAVDMGLGSVSPSAGTNVYFSSDEASNTF 253Query604 NCSDYGWGEQGARTPEISSILEASVVGEE--FLEDANPSKKLKPSSDNVMPAEDNSAKTL 777+CSD+GW E ARTPEISS+L + E F +D +P KKLK S + + N+ TLSbjct254 DCSDFGWAEPCARTPEISSVLSEVLETNETHFDDDSRPEKKLKSCSSTSLTVDGNTVNTL 313Query778 SDELLALDNQMKYFQMPPFIEGNWDATIDAFLNGDATQDGGNPMDLWNFDDFPTMAEGVF 957S+EL A ++QMK+ Q+ P++EGNWDA++DAFLN A QDGGN MDLW+FDD P++ G +Sbjct314 SEELSAFESQMKFLQI-PYLEGNWDASVDAFLNTSAIQDGGNAMDLWSFDDVPSLMGGAY 372Query棉花Ethylene Response Element Binding Factor的氨基酸序列Sbjct番茄Ethylene Response Element Binding Factor的氨基酸序列(AAK95687)表3為本發(fā)明的棉花ERF2蛋白與番茄ERF蛋白的氨基酸序列的同源比較(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用氨基酸單字符標(biāo)出。
發(fā)明棉花ERF2蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然棉花ERF2相關(guān)多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的棉花ERF2多肽時，可以將棉花ERF2編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成棉花ERF2蛋白表達(dá)載體。
如本發(fā)明所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”為真核細(xì)胞。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、煙草細(xì)胞和其它植物細(xì)胞。
還可用Northern印跡法技術(shù)分析棉花ERF2基因產(chǎn)物的表達(dá)，即分析棉花ERF2的RNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。
此外，本發(fā)明提供的可用作探針的核酸分子，該分子通常具有棉花ERF2核苷酸編碼序列的8-100個連續(xù)核苷酸，較佳地具有15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼棉花ERF2相關(guān)的核酸分子。
本發(fā)明的檢測樣品中是否存在棉花ERF2相關(guān)核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于棉花ERF2相關(guān)核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。
此外，根據(jù)本發(fā)明的棉花ERF2核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選棉花ERF2相關(guān)同源基因或同源蛋白。
為了得到與棉花ERF2相關(guān)基因相關(guān)的棉花cDNAs的點(diǎn)陣，可以用DNA探針篩選棉花cDNA文庫，這些探針是在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下，用32P對棉花ERF2相關(guān)的全部或部分做放射活性標(biāo)記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫是來自棉花的文庫。構(gòu)建來自感興趣的細(xì)胞或者組織的cDNA文庫的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如購自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。這種篩選方法可以識別與棉花ERF2相關(guān)相關(guān)的基因家族的核苷酸序列。
本發(fā)明的棉花ERF2相關(guān)核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WHFreeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動進(jìn)行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來自動合成肽。可以分別化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。
利用本發(fā)明的棉花ERF2蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與棉花ERF2相關(guān)發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或拮抗劑等。
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種棉花乙烯響應(yīng)元件綁定因子(ERF2)蛋白編碼序列，使其在植物細(xì)胞抗病耐鹽上具有明顯的作用，本發(fā)明具有實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著進(jìn)步，本發(fā)明在植物細(xì)胞抗病耐鹽上具有明顯的作用，能夠明顯提高植物細(xì)胞在逆境條件下的抗性，降低環(huán)境脅迫對植物的損害。因此，本發(fā)明具有很大的應(yīng)用價值。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)具體數(shù)據(jù)，以具體實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1棉花ERF2基因的克隆1.組織分離(isolation)將棉花種子置于37℃發(fā)芽24小時，然后播種于溫室中，待棉花葉片為3-5片時，準(zhǔn)備抽取DNA或RNA。
2.RNA的分離(RNA isolation)取部分組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至1.5mL EP管中，抽提總RNA(CTAB法)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計(jì)上測定RNA含量。
3.基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA)根據(jù)番茄ERF基因的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(GibcoBRL試劑盒)進(jìn)行cDNA全長克隆，分三個階段進(jìn)行(1)RT-PCRPCR[EA001(SEQ ID NO.1)+EA002(SEQ ID NO.2)]得到185bp的片段，回收，連接到pGEMT-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行測序。測序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(GenBank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知茄科植物如番茄(Solanum tuberosum)ERF基因的同源性很高，故初步認(rèn)為它是一個ERF基因。
(2)3’-RACEPCR[AP+EA301(5’-AGAAAGAGGAAGAACCAGTA-3’)]得到EA3’(1138bp)，回收，連接到T-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行測序。測序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(GenBank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知茄科植物如番茄(Lycopersicon esculentum)ERF基因的同源性很高，故初步認(rèn)為它是一個與ERF相關(guān)的基因。
(3)5’-RACE第一輪PCR[AAP+EA501(5’-AAGTTCACCTTAGCTTTCTT-3’)]第二輪PCR[(AUAP+EA502(5’-TCATAAGCTCTCGCAGCTTC-3’))得到EA5’(約407bp)(過程同(1))將測序結(jié)果的重疊區(qū)拼接，發(fā)現(xiàn)過程(1)得到的片段既是該基因的完整編碼區(qū)。
BLAST的結(jié)果證明從棉花中新得到的基因確為一個與番茄ERF相關(guān)的基因。
通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的棉花ERF2蛋白的全長編碼序列(SEQ ID NO.3)。
實(shí)施例2棉花ERF2基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的棉花ERF2全長cDNA的長度為1405bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于139-1098位核苷酸(960個核苷酸)。根據(jù)全長cDNA推導(dǎo)出棉花ERF2的氨基酸序列，共319個氨基酸殘基，分子量為36187.35道爾頓，等電點(diǎn)(pI)為4.87。詳細(xì)序列見SEQ ID NO.3。
將棉花ERF2的全長cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與番茄基因ERF(AY044235)在核苷酸水平上具有82％的相同性，(附表2)；在氨基酸水平上，它與番茄基因ERF(AAK95687)也有48％的相同性(附表3)。由此可見，棉花基因ERF2與番茄基因ERF無論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性。番茄基因ERF(AY044235)已經(jīng)被證明在病原菌、高鹽脅迫條件下明顯增強(qiáng)表達(dá)，并發(fā)揮著重要的作用，可以認(rèn)為棉花基因ERF2在抗病耐鹽方面也具有相似的作用。
實(shí)施例3棉花基因ERF2蛋白或多肽在煙草中進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植株的抗病耐鹽鑒定含目的基因(棉花基因ERF2)的表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)棉花基因ERF2的全長序列(SEQ ID NO.3)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將棉花基因ERF2 cDNA克隆至中間載體(如pBluescript)，進(jìn)一步克隆到雙元表達(dá)載體(如pBI121和改進(jìn)的pCAMBIA2300)，在保證閱讀框架正確的前提下鑒定好的表達(dá)載體，再將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，利用葉盤法技術(shù)轉(zhuǎn)化模式植物煙草。
1.發(fā)苗種子用無菌水漂洗15-20分鐘，再用70％的乙醇消毒1分鐘，然后用0.1％升汞消毒10-12分鐘。最后再用無菌水沖洗5遍。將洗好的種子用吸水紙吸干，放入MS培養(yǎng)基。光照培養(yǎng)5天，待苗長到4-5厘米便可以剪苗。
2.剪苗剪取0.5-1厘米的下胚軸小片段放入預(yù)培養(yǎng)基，培養(yǎng)2天。
預(yù)培養(yǎng)基MS+6BA(0.2mg/l)+2.4D(1.2mg/l)3.轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)將預(yù)培養(yǎng)2天的下胚軸放入事先培養(yǎng)好的菌液中(OD值0.4-0.6)侵染3-5分鐘。接著取出放入預(yù)培養(yǎng)基暗培養(yǎng)2天。
4.篩選培養(yǎng)共培養(yǎng)結(jié)束后，將外植體放入篩選培養(yǎng)基。2周繼代一次。2-4周有愈傷組織形成和芽的分化。待綠芽長到2厘米后，切下生根。
篩選培養(yǎng)基MS+6BA(4.5mg/l)+NAA(0.1mg/l)+AgNO3(6mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(20mg/l)生根培養(yǎng)基MS+NAA(0.5mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(5mg/l)5.轉(zhuǎn)化植株培養(yǎng)；待根系發(fā)達(dá)后，將植株取出，用無菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，剛開始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，溫室中培養(yǎng)。
含棉花基因ERF2的轉(zhuǎn)基因煙草植株的抗病耐鹽鑒定鑒于編碼ERF，如番茄的ERF基因已被證明在抗病耐鹽方面發(fā)揮作用，而棉花基因ERF2轉(zhuǎn)錄水平與番茄的ERF具有較高的同源性，可進(jìn)一步對含棉花基因ERF2的轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行抗病耐鹽鑒定。用病原菌、水淹、ABA和高溫(45℃)處理轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)基因植株的種子(3小時、7小時、12小時、24小時、48小時、72小時)后研究ERF2基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)情況以及各種處理對植株的生長情況。Northern blot分析結(jié)果證明，轉(zhuǎn)基因植株ERF2轉(zhuǎn)錄水平在病原菌、水淹、ABA和高溫處理后其表達(dá)量均有明顯變化，而對照非轉(zhuǎn)基因植株雖表達(dá)量也有變化，但明顯低于轉(zhuǎn)基因植株。此外非轉(zhuǎn)基因植株生長緩慢，最后在病原菌、水淹、ABA和高溫處理下枯萎而死，轉(zhuǎn)基因植物依然能正常生長，只是比未經(jīng)處理的植株生長稍慢。這證明棉花基因ERF2比番茄的ERF基因具有更有效的和更廣泛的抗逆境的功能，將可用于利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良植物抗病耐鹽的研究和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中。
實(shí)施例4棉花基因ERF2在棉花中的拷貝數(shù)分析采用常規(guī)方法從棉花葉片中提取DNA(參考《分子克隆》，Sambrook等，1989)，分別用BamH、KpnI、SacI和XbaI酶切DNA[20μg(微克)/樣品]后，將DNA轉(zhuǎn)至雜交膜(尼龍膜)上后。使用Amersham Pharmacia公司Gene ImagesTMContentsCDP-StarTMlabelling module(PRN3540)，我們將ERF2基因編碼區(qū)標(biāo)記為探針，然后進(jìn)行雜交(于60℃雜交16小時)。取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于60℃漂洗3次，每次15分鐘。轉(zhuǎn)入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于60℃漂洗3次，每次同樣15分鐘。用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影(方法參照Roche DIG labeled試劑盒說明書)。結(jié)果(Southern blot)發(fā)現(xiàn)在雜交膜上不同酶切泳道上各出現(xiàn)二至五條雜交條帶，說明ERF2基因在棉花中是低拷貝基因。
實(shí)施例5棉花基因ERF2在病原菌、水淹、ABA和高溫脅迫條件下的不同時間處理的表達(dá)譜分析1.RNA的提取將生長了3-5片葉的棉花幼苗經(jīng)病原菌、水淹、ABA和高溫(45℃)處理(3小時、7小時、12小時、24小時、48小時、72小時)，然后用TRIzol試劑盒(GIBCO BRL，USA)提取并參考《分子克隆》有關(guān)RNA的制備章節(jié)(Sambrook等，1989)。
2.RNA的定量參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度計(jì)測OD260；RNA含量計(jì)算1 OD260＝40μg/ml。
3總RNA瓊脂糖凝膠電泳分離1)取6ml 25*(倍)電泳緩沖液，加入117ml無菌水，混勻。2)稱取1.5g瓊脂糖，加入到上述溶液中，于微波爐里加熱融化，轉(zhuǎn)入55℃水浴中。3)于通風(fēng)櫥中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝膠溶液中，混勻。4)迅速倒入制膠板中，室溫水平放置30分鐘，待膠凝固。5)將提取的RNA(20μg)溶解于RNA變性溶液中，在65℃下加熱10分鐘，然后立即放在冰上。6)在樣品中加入2ul 10*上樣緩沖液，混勻。7)在電泳液未蓋過膠的條件下點(diǎn)樣，5V/cm電壓電泳5小時左右。
4.RNA尼龍膜上轉(zhuǎn)移1)轉(zhuǎn)移之前，將尼龍膜用10*SSC浸泡。2)將濕潤的膜準(zhǔn)確地蓋在膜上，將兩張與膜大小相同的濾紙置2*SSC溶液中濕潤，蓋在膜上，排除氣泡。3)濾紙上放一疊與膜大小相同的吸水紙，在吸水紙上放一玻璃板和一重物，水平放置，轉(zhuǎn)移12-20小時。4)轉(zhuǎn)移后，將膜于80℃烘烤2小時。
5.膜上雜交信號的檢出1)將膜浸在5×Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鮭魚精DNA]，65℃下預(yù)雜交2小時。2)將用Gene ImagesTMContents CDP-StarTMlabelling module標(biāo)記的探針在沸水中變性5分鐘，直接加入1)的雜交液中，于65℃雜交16-24小時。3)取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于65℃漂洗3次，每次15分鐘。轉(zhuǎn)入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于65℃漂洗3次，每次15分鐘。4)用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影(方法參照Roche DIGlabeled試劑盒說明書)。Northern雜交表明隨著病原菌、水淹、ABA和高溫處理時間的延長，ERF2的表達(dá)均有明顯變化，說明ERF2是逆境信號如病原菌、水淹、ABA和高溫等誘導(dǎo)表達(dá)的，在棉花抗病耐鹽中扮演重要的角色。
本發(fā)明涉及的序列及記號分列如下
(1)SEQ ID NO.1的信息(i).序列特征(A)長度20bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.1AGA AAG AGG AAG AA(C/T)CAG TAA AT(2)SEQ ID NO.2的信息(i).序列特征(A)長度20bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.2AAG TTC ACC TTA GCT TTC TT(3)SEQ ID NO.3的信息(i).序列特征(A)長度1405bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.3<110>上海交通大學(xué)
<120>棉花乙烯響應(yīng)元件綁定因子蛋白編碼序列<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1405<212>DNA<213>棉花(Gossypium barbadense)<220>
<221>CDS<222>(139)..(1098)<223>
<400>1atttgagaat cgatgcccgg attaataatt tctgggatgt agtcactaaa aaggcctttc 60tcatgatttt cttgcagtta aaggtcttaa attatatttc cttgtgacag ttatgttgtg120atttgtagtt tttcatgg atg agt aat gtt tat tta tgg ttc atg tat ccg 171Met Ser Asn Val Tyr Leu Trp Phe Met Tyr Pro15 10tac gat att aaa ttt ttc ttt ttg tgc tct atc att gaa ggt tcg aac 219Tyr Asp Ile Lys Phe Phe Phe Leu Cys Ser Ile Ile Glu Gly Ser Asn15 20 25
tct gaa aag tcc atg cag ttc gat ggt caa gct gag aaa tgt gcg aaa267Ser Glu Lys Ser Met Gln Phe Asp Gly Gln Ala Glu Lys Cys Ala Lys30 35 40aga aag agg aag aac cag tat cgt gga atc cgg cag cgc cca tgg ggt315Arg Lys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg Gly Ile Arg Gln Arg Pro Trp Gly45 50 55aaa tgg gct gct gag atc cgt gac cca agg aaa ggg gtt agg gtc tgg363Lys Trp Ala Ala Glu Ile Arg Asp Pro Arg Lys Gly Val Arg Val Trp60 65 70 75tta gga act ttc aat act gct gaa gaa gct gcg aga gct tat gat gct411Leu Gly Thr Phe Asn Thr Ala Glu Glu Ala Ala Arg Ala Tyr Asp Ala80 85 90gag gca cgg aga att cgt ggt aag aaa gct aag gtg aac ttc cct aac459Glu Ala Arg Arg Ile Arg Gly Lys Lys Ala Lys Val Asn Phe Pro Asn95 100 105gag act ccg cgt acc tct cca aag cat gca gtc aag aca aat tct cag507Glu Thr Pro Arg Thr Ser Pro Lys His Ala Val Lys Thr Asn Ser Gln110 l15 120aaa cca ctt tcc aag tcg aat ttg agc cct gtt cag cta aat ctc gac555Lys Pro Leu Ser Lys Ser Asn Leu Ser Pro Val Gln Leu Asn Leu Asp125 130 135cag aat tac aat tac ttg agc cag cct gag cag gaa tac ttc gat acc603
Gln Asn Tyr Asn Tyr Leu Ser Gln Pro Glu Gln Glu Tyr Phe Asp Thr140 145 150 155atg ggt ttc gta gaa gag aag cca ctg gtc aat cag ttt gca tat gtg651Met Gly Phe Val Glu Glu Lys Pro Leu Val Asn Gln Phe Ala Tyr Val160 165 170gac cct gtt cct acg tct ata gat gct gga tct aat caa tca gat aat699Asp Pro Val Pro Thr Ser Ile Asp Ala Gly Ser Asn Gln Ser Asp Asn175 180 185gcc ccc ttg tac ttc aat tcg gac cag gga agt aac tcc atc aat tgt747Ala Pro Leu Tyr Phe Asn Ser Asp Gln Gly Ser Asn Ser Ile Asn Cys190 195 200tcc gac tat ggc tgg gga gaa cag ggt gcc aga act cct gaa ata tca795Ser Asp Tyr Gly Trp Gly Glu Gln Gly Ala Arg Thr Pro Glu Ile Ser205 210 215tcc att ctt gaa gct tct gta gtg ggt gaa gag ttt ctt gag gat gct843Ser Ile Leu Glu Ala Ser Val Val Gly Glu Glu Phe Leu Glu Asp Ala220 225 230 235aac cct agc aag aag ctg aaa cca agt tct gac aat gtt atg cct gcc891Asn Pro Ser Lys Lys Leu Lys Pro Ser Ser Asp Asn Val Met Pro Ala240 245 250gaa gac aac tcc gcg aag acc ttg tcg gac gag ctg ttg gct ttg gac939Glu Asp Asn Ser Ala Lys Thr Leu Ser Asp Glu Leu Leu Ala Leu Asp
255 260 265aac cag atg aaa tac ttc caa atg ccg cca ttt att gaa gga aac tgg987Asn Gln Met Lys Tyr Phe Gln Met Pro Pro Phe Ile Glu Gly Asn Trp270 275 280gac gcc act att gat gct ttc ctc aat gga gat gca aca cag gat ggt1035Asp Ala Thr Ile Asp Ala Phe Leu Asn Gly Asp Ala Thr Gln Asp Gly285 290 295gga aac ccg atg gat ctt tgg aac ttt gat gat ttc cct acc atg gcg1083Gly Asn Pro Met Asp Leu Trp Asn Phe Asp Asp Phe Pro Thr Met Ala300 305 310 315gag ggt gtt ttc tga gcgaactttc cataataact agtgtttgta aataaagcaa1138Glu Gly Val Phecatgaatttg gtcaaaatct gttgtgaagt tgaagtaaaa accaagctat atgcatgctt 1198aagccttgcc tgcactgctt tcagaggttt ttagtatgta cccctttttt atgtgttttt 1258ttgtagactt tggactaaat tttaaatttg agtgactgtataagtaattg tgtc tgaatt 1318tgtttatgtt tgaatactga aaaacatatg aatgttttaa actctgctat ttgtttctcc 1378caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa1405
<210>2<211>319<212>PRT<213>棉花(Gossypium barbadense)<400>2Met Ser Asn Val Tyr Leu Trp Phe Met Tyr Pro Tyr Asp Ile Lys Phe15 10 15Phe Phe Leu Cys Ser Ile Ile Glu Gly Ser Asn Ser Glu Lys Ser Met20 25 30Gln Phe Asp Gly Gln Ala Glu Lys Cys Ala Lys Arg Lys Arg Lys Asn35 40 45Gln Tyr Arg Gly Ile Arg Gln Arg Pro Trp Gly Lys Trp Ala Ala Glu50 55 60Ile Arg Asp Pro Arg Lys Gly Val Arg Val Trp Leu Gly Thr Phe Asn65 70 75 80Thr Ala Glu Glu Ala Ala Arg Ala Tyr Asp Ala Glu Ala Arg Arg Ile85 90 95Arg Gly Lys Lys Ala Lys Val Asn Phe Pro Asn Glu Thr Pro Arg Thr100 105 110
Ser Pro Lys His Ala Val Lys Thr Asn Ser Gln Lys Pro Leu Ser Lys115 120 125Ser Asn Leu Ser Pro Val Gln Leu Asn Leu Asp Gln Asn Tyr Asn Tyr130 135 140Leu Ser Gln Pro Glu Gln Glu Tyr Phe Asp Thr Met Gly Phe Val Glu145 150 155 160Glu Lys Pro Leu Val Asn Gln Phe Ala Tyr Val Asp Pro Val Pro Thr165 170 175Ser Ile Asp Ala Gly Ser Asn Gln Ser Asp Asn Ala Pro Leu Tyr Phe180 185 190Asn Ser Asp Gln Gly Ser Asn Ser Ile Asn Cys Ser Asp Tyr Gly Trp195 200 205Gly Glu Gln Gly Ala Arg Thr Pro Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu Ala210 215 220Ser Val Val Gly Glu Glu Phe Leu Glu Asp Ala Asn Pro Ser Lys Lys225 230 235 240Leu Lys Pro Ser Ser Asp Asn Val Met Pro Ala Glu Asp Asn Ser Ala245 250 255Lys Thr Leu Ser Asp Glu Leu Leu Ala Leu Asp Asn Gln Met Lys Tyr260 265 270
Phe Gln Met Pro Pro Phe Ile Glu Gly Asn Trp Asp Ala Thr Ile Asp275 280 285Ala Phe Leu Asn Gly Asp Ala Thr Gln Asp Gly Gly Asn Pro Met Asp290 295 300Leu Trp Asn Phe Asp Asp Phe Pro Thr Met Ala Glu Gly Val Phe305 310 31權(quán)利要求
1.一種棉花乙烯響應(yīng)元件綁定因子蛋白編碼序列，其特征在于，分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有棉花乙烯響應(yīng)元件綁定因子蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第139-1098位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能與SEQ ID NO.3中從核苷酸第139-1098位的核苷酸序列雜交。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棉花乙烯響應(yīng)元件綁定因子蛋白編碼序列，其特征是，所述的編碼序列具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的棉花乙烯響應(yīng)元件綁定因子蛋白編碼序列，其特征是，所述的編碼序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第139-1098位的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棉花乙烯響應(yīng)元件綁定因子蛋白編碼序列，其特征是，包含DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或者4所述的棉花乙烯響應(yīng)元件綁定因子蛋白編碼序列，其特征是，所述的DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它是真核細(xì)胞。
全文摘要
一種棉花乙烯響應(yīng)元件綁定因子蛋白編碼序列，屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有棉花ERF2蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第139－1098位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能與SEQ ID NO.3中從核苷酸第139－1098位的核苷酸序列雜交。本發(fā)明在植物抗病耐鹽方面具有明顯的作用，具有很大的應(yīng)用價值，能夠明顯減少農(nóng)作物在干旱、鹽堿、高溫和病菌感染等環(huán)境脅迫條件下生物產(chǎn)量的損失。
文檔編號C12N15/79GK1600861SQ200410066430
公開日2005年3月30日 申請日期2004年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月16日
發(fā)明者秦捷, 趙靜雅, 左開井, 唐克軒 申請人:上海交通大學(xué)