專利名稱:酶法測定鎂離子含量的方法及鎂離子診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及酶法測定血漿、血清等樣品中鎂離子含量的方法,以及應(yīng)用該方法配制而成的鎂離子診斷試劑盒,屬于醫(yī)學(xué)檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù):
目前醫(yī)學(xué)上測定血漿、血清等樣品中鎂離子含量(簡稱鎂測定)的手段比較多,概括起來有比色法、熒光法、離子色譜法、離子選擇性電極法(ISE)、酶法、原子吸收分光光度法(AAS)、同位素稀釋質(zhì)譜法(ID-MS)等。其中決定性的方法是ID-MS,其次是AAS,這兩種方法雖然結(jié)果準確,但設(shè)備復(fù)雜、費用昂貴,不適用于常規(guī)實驗室和自動分析。
比色法是應(yīng)用最廣泛的方法,包括甲基麝香草酚藍法(MTB)、達旦黃法、鄰甲酚酞絡(luò)合酮法(OCPC)、鈣鎂試劑法(Calmagite)以及新近報道的2-(8’-羥基喹啉-5’-磺酸-7’-偶氮)-變色酸法(8Q5SAC)。比色法操作簡便、費用低,適合常規(guī)實驗室應(yīng)用,但存在試劑空白吸光度高、易受膽紅素和其它陽離子干擾、試劑穩(wěn)定性差,以及試劑中含有腐蝕性或毒性成分等缺點。離子選擇性電極法(ISE)可以測定生理溶液中鎂離子活度,采用中性載體(ETH7025)液膜離子選擇電極,測定的準確度較高,但仍存在生理范圍內(nèi)的鈣干擾,Ca2+最大干擾達10%。離子色譜法在測定之前需要對樣本進行預(yù)處理,包括酸化稀釋和過濾。Thienpont等使用該方法對五種“國際標準和技術(shù)學(xué)會”用火焰原子吸收分光光度法的定值血清進行了分析,結(jié)果平均偏差僅為0.35%,認為離子色譜法可作為測定鎂元素總量的有價值的參考方法。
酶法測定血漿、血清等樣品中鎂離子(主要是Mg2+)的研究近幾年非?;钴S,取得了較大進展。目前已應(yīng)用于Mg2+測定的酶學(xué)方法有①甘油激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶偶聯(lián)法;②甘油激酶、磷酸甘油氧化酶和過氧化物酶偶聯(lián)法;③葡萄糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶偶聯(lián)法;④酶聯(lián)化學(xué)發(fā)光法;⑤磷酸葡萄糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶偶聯(lián)法;⑥異檸檬酸脫氫酶法;⑦丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶偶聯(lián)法。
總體上看,采用酶法檢測鎂離子結(jié)果準確、干擾小、適合于自動化分析。但是,應(yīng)用不同的檢測試劑和測試路線,檢測的靈敏度、檢測結(jié)果的準確性會有很大差別,直接影響到該方法的使用與推廣,這正是人們在該領(lǐng)域內(nèi)不斷研究、發(fā)展和創(chuàng)新的原因所在。由于有著非常好的應(yīng)用前景,對酶法檢測鎂離子的研究已經(jīng)成為該領(lǐng)域內(nèi)的熱點。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種酶法測定鎂離子含量的方法,以及應(yīng)用該方法配制而成的鎂離子診斷試劑盒。采用該試劑盒中的試劑,能夠利用紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀對血漿、血清等樣品中鎂離子的含量進行快速、準確測定,以便推廣使用酶法檢測鎂離子的方法以及相應(yīng)的診斷試劑盒,使該領(lǐng)域內(nèi)檢測手段得到進一步豐富和發(fā)展。
為實現(xiàn)本發(fā)明的目的,一種酶法測定鎂離子含量的方法,采用以下步驟進行首先,將血漿、血清等需要測定的樣品與含有甘油、腺苷三磷酸、甘油激酶、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶和還原型輔酶的試劑混勻,使之發(fā)生以下反應(yīng),
然后,將反應(yīng)混合物置于紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀下,檢測主波長340nm的吸光度的下降幅度,進而測算出樣品中鎂離子的含量。
測定過程中,被測樣品與試劑的使用比例按體積控制在1∶10~1∶500,反應(yīng)溫度控制在20℃~50℃,反應(yīng)時間控制在2~30分鐘,檢測時設(shè)定副波長在405nm以上。
實現(xiàn)本發(fā)明方法的鎂離子診斷試劑盒可以是單劑,由以下成分組成緩沖液40~200mmol/l,甘油 1~40mmol/l,腺苷三磷酸0.2~20mmol/l,磷酸烯醇式丙酮酸 1~5mmol/l,還原型輔酶0.2~0.3mmol/l,丙酮酸激酶2000~20000U/l,乳酸脫氫酶2000~50000U/l,甘油激酶 2000~50000U/l,穩(wěn)定劑/試劑總體積 10~80%。
也可以將以上單劑中的各種成分進行組合配制成雙劑,以利于消除內(nèi)、外源物質(zhì)的污染,比如
雙劑的配方不僅僅限于上述表中所列,其中試劑I的成分腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、還原型輔酶、丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶等,可以放在試劑II;試劑II中的成分甘油、甘油激酶等,也可以放到試劑I,如此可以形成多種配方,不再一一列舉。
還可以將試劑配成如下三試劑,不但更有利于消除內(nèi)、外源物質(zhì)的污染,還有利于試劑更穩(wěn)定
與雙劑類似,三劑的配方也不僅僅限于上述配方,其中試劑I中的腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸和還原型輔酶可以放在試劑II或試劑III中,試劑II中的丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶和甘油激酶可以放在試劑I或試劑III中,試劑III中的甘油也可以放到試劑I或者試劑II中,如此可以形成多種配方,不再一一列舉。
上述診斷試劑盒的成分當(dāng)中,選擇緩沖液的基本要求是PH值在6.0~11.0范圍之內(nèi),可以是“三羥甲基氨基甲烷~鹽酸(Tris-HCl)緩沖液”、“三乙醇胺(Triethanolamine)緩沖液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)緩沖液”、“咪唑~鹽酸(Imidazole-HCl)緩沖液”、“雙甘氨肽(Glycylglycine)緩沖液”、“檸檬酸~檸檬酸鈉緩沖液”、“巴比妥鈉~鹽酸緩沖液”、“硼酸~硼砂緩沖液”、“甘氨酸~氫氧化鈉緩沖液”、“硼砂~氫氧化鈉緩沖液”、“磷酸(Phosphate)緩沖液”或者“磷酸鹽(Phosphate-Sodium Chloride,PBS)緩沖液”中的至少一種,但選擇范圍并不受這些列舉所限制。
此外,為減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性,以便長期儲存,以上單劑、雙劑的試劑I/試劑II、三劑的試劑I/試劑II/試劑III當(dāng)中通常加入穩(wěn)定劑,其用量約占所在試劑總體積的10~80%(或者濃度在10~50mmol/l范圍之內(nèi))。
用作穩(wěn)定劑的物質(zhì)可以是乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸銨、硫基乙醇、牛血清白蛋白、碳酸鹽、膽酸鹽、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、黃素單核苷酸、葡萄糖、谷氨酸鹽、還原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸鹽或者氯化鈉中的至少一種。
上述鎂離子診斷試劑盒的試劑成分當(dāng)中,所述氧化型輔酶是——氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)、氧化型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(thio-NAD+)或者氧化型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(thio-NADP+);所述還原型輔酶是——還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、還原型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(thio-NADH)或者還原型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(thio-NADPH)。
研究表明,從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮,無論是單劑、雙劑還是三劑,如下配方成分關(guān)系的鎂離子診斷試劑盒較為理想,也是本發(fā)明的優(yōu)選方案緩沖液80~120mmol/l,甘油 10~20mmol/l,腺苷三磷酸2~8mmol/l,磷酸烯醇式丙酮酸 1~5mmol/l,還原型輔酶0.2~0.3mmol/l,丙酮酸激酶6000~12000U/l,乳酸脫氫酶10000~30000U/l,甘油激酶 10000~30000U/l,穩(wěn)定劑/試劑總體積 10~50%。
本發(fā)明應(yīng)用鎂離子激活甘油激酶活性的特點,甘油激酶活性激化的程度與血漿、血清等被測樣品中鎂離子的含量成正比,在腺苷三磷酸的存在下與甘油反應(yīng)生成腺苷二磷酸,再偶聯(lián)丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶,將還原型輔酶反應(yīng)成氧化型輔酶。由于還原型輔酶在340nm有非常明顯的吸收峰,而它們對應(yīng)的氧化型輔酶在340nm沒有吸收峰,反應(yīng)所產(chǎn)生的吸光度的變化與樣品中鎂離子的含量成正比。因此,在固定時間間隔內(nèi)測定主波長340nm處吸光度的下降幅度,便能很好地反映出樣品中鎂離子的含量。
本發(fā)明技術(shù)方案的突出的實質(zhì)性特點和顯著的進步主要表現(xiàn)在(1)本發(fā)明糾正了現(xiàn)有技術(shù)中的誤解,ZL 98123138.1中認為“樣品中鎂離子的存在使丙酮酸激酶的活性顯著增強”,實際上并非如此,而是樣品中的鎂離子激化甘油激酶的活性,這才使測試過程得以進行;(2)本發(fā)明完全利用酶學(xué)方法,酶解反應(yīng)具有特異性高的特點,通過將還原型輔酶反應(yīng)成氧化型輔酶,定量反映出被測樣品中鎂離子的含量,測試結(jié)果準確;(3)參與酶偶聯(lián)反應(yīng)的成分都是外加的,不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染,測試過程精確度高;(4)該方法簡便、易操作,可快速得到檢測結(jié)果,而且反應(yīng)是在緩沖液條件下進行,不會污染環(huán)境;(5)該方法在普通紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀上便可快速檢測,不需要特殊或額外儀器,測試成本低廉,便于行業(yè)內(nèi)推廣應(yīng)用;(6)應(yīng)用本發(fā)明提供的測定方法可以制成液態(tài)試劑、干粉試劑、干試劑等多種形式的試劑,主要用于測定人體和其它動物體內(nèi)鎂離子的含量,也可以結(jié)合稀釋、濃縮等輔助手段來測定其它樣品中的鎂離子;(7)本發(fā)明提供的液態(tài)鎂離子診斷試劑盒,穩(wěn)定性好,存在于其中的各種酶的三維空間結(jié)構(gòu)保持完整,很好地保證了應(yīng)用測試效果。做成雙劑或者三劑以后,能夠進一步降低各種成分之間的交叉影響,檢測結(jié)果更加可信,試劑更為穩(wěn)定,可以長時間儲存。
圖1是本發(fā)明提供的診斷試劑(三劑)用于測試鎂離子樣品的檢測結(jié)果示意圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明技術(shù)方案作進一步說明。這些例子僅是一些應(yīng)用范例,不能理解為對本發(fā)明權(quán)利要求保護范圍的一種限制。
實施例一(單劑)按以下成分和用量配制血清中鎂離子診斷試劑盒
雙甘氨肽緩沖液 80mmol/l,甘油10mmol/l,腺苷三磷酸 2mmol/l,磷酸烯醇式丙酮酸1mmol/l,thio-NAD+0.2mmol/l,丙酮酸激酶 6000U/l,乳酸脫氫酶 10000U/l,甘油激酶10000U/l,乙二醇 50%(占試劑總體積)。
在全自動生化分析儀(日立-7080)上設(shè)定溫度37℃、反應(yīng)時間10分鐘、測試主波長340nm、測試副波長405nm以上,被測樣品與試劑的體積比例為1∶25,反應(yīng)方向為負反應(yīng)(吸光度下降,下同)。
加入血清樣品和配成的單劑,兩者在分析儀內(nèi)部自動混勻,檢測、記錄340nm吸光度的下降情況。一共檢測讀點31次,大約每隔20秒記錄一次數(shù)據(jù),根據(jù)速率法、終點法等方法,對照相應(yīng)的標準曲線測算出血清樣品中鎂離子的含量。對同一批樣品多次重復(fù)以上過程,測試結(jié)果重復(fù)性好、精確度高。
實施例二(雙劑)按以下成分和用量配制血清中鎂離子診斷試劑盒試劑I——咪唑~鹽酸緩沖液100mmol/l,甘油15mmol/l,腺苷三磷酸 5mmol/l,磷酸烯醇式丙酮酸3mmol/l,NADP+0.25mmol/l,
丙酮酸激酶9000U/l,乳酸脫氫酶20000U/l,乙二醇50%(占試劑I總體積);試劑II——咪唑~鹽酸緩沖液 100mmol/l,甘油激酶 20000U/l,乙二醇50%(占試劑II總體積)。
在全自動生化分析儀(日立-7080)上設(shè)定溫度30℃、反應(yīng)時間15分鐘、測試主波長340nm、測試副波長405nm以上,被測樣品與試劑I和試劑II的總體積之比為1∶25,試劑I與試劑II的用量之比為4∶1,反應(yīng)方向為負反應(yīng)。
先加入血清樣品和試劑I,5分鐘之后加入試劑II,三者在分析儀內(nèi)部自動混勻,檢測、記錄340nm吸光度的下降情況。根據(jù)速率法、終點法等方法,對照相應(yīng)的標準曲線測算出血清樣品中鎂離子的含量。對同一批樣品多次重復(fù)以上過程,測試結(jié)果重復(fù)性好、精確度高。
實施例三(三劑)按以下成分和用量配制血清中鎂離子診斷試劑盒試劑I——三乙醇胺緩沖液120mmol/l,腺苷三磷酸8mmol/l,磷酸烯醇式丙酮酸 5mmol/l,thio-NADP+0.3mmol/l,丙二醇20mmol/l試劑II——三乙醇胺緩沖液120mmol/l,丙酮酸激酶12000U/l,
乳酸脫氫酶30000U/l,丙二醇50%(占試劑II總體積);試劑III——三乙醇胺緩沖液120mmol/l,甘油 20mmol/l,甘油激酶 30000U/l,乙二醇50%(占試劑III總體積)。
在全自動生化分析儀(日立-7080)上設(shè)定溫度25℃、反應(yīng)時間20分鐘、測試主波長340nm、測試副波長405nm以上,被測樣品與試劑I、試劑II和試劑III的總體積之比為1∶25,試劑I、試劑II和試劑III的用量為8∶1∶1,反應(yīng)方向為負反應(yīng)。
先加入血清樣品和試劑I、試劑II,5分鐘之后加入試劑III,它們在分析儀內(nèi)部自動混勻,檢測、記錄340nm吸光度的下降情況。根據(jù)速率法、終點法等方法,對照相應(yīng)的標準曲線測算出血清樣品中鎂離子的含量。對同一批樣品多次重復(fù)以上過程,測試結(jié)果重復(fù)性好、精確度高。
圖1是本具體實施例的測試結(jié)果示意圖。圖中A點是血清樣品和試劑I、試劑II同時加入的時間點,B點是第一次檢測記錄點,C點是試劑III的加入點,A點和B點之間的時間間隔大于儀器的檢測啟動時間(一般在1分鐘左右)。從圖中可以看出,試劑III加入之后儀器檢測數(shù)據(jù)才有了明顯的變化,這說明正是樣品中的鎂離子激化了甘油激酶的活性,這才使測試過程得以進行;中國專利ZL 98123138.1中認為的“樣品中鎂離子的存在使丙酮酸激酶的活性顯著增強”實際上是一種誤解。
實施例四(雙劑優(yōu)選例)按以下成分和用量配制血磷診斷試劑盒試劑I——Tris-HCl緩沖液100mmol/l,
磷酸烯醇式丙酮酸 1mmol/l,NAD+0.25mmol/l,丙酮酸激酶 12000U/l,乳酸脫氫酶 18000U/l,硫酸銨 20mmol/l;試劑II——Tris-HCl緩沖液 100mmol/l,甘油 20mmol/l,腺苷三磷酸 2mmol/l,甘油激酶 18000U/l,硫酸銨 20mmol/l。
在全自動生化分析儀(日立-7080)上設(shè)定溫度37℃、反應(yīng)時間10分鐘、測試主波長340nm、測試副波長405nm以上,被測樣品與試劑I和試劑II的總體積之比為1∶25,試劑I與試劑II的用量之比為4∶1,反應(yīng)方向為負反應(yīng)。
先加入血清樣品和試劑I,5分鐘之后加入試劑II,三者在分析儀內(nèi)部自動混勻,發(fā)生以下原理性反應(yīng)
檢測、記錄340nm吸光度的下降情況。根據(jù)速率法、終點法等方法,對照相應(yīng)的標準曲線測算出血清樣品中鎂離子的含量。對同一批樣品多次重復(fù)以上過程,測試結(jié)果重復(fù)性好、精確度高。
本發(fā)明的顯著特色之一是可以消除內(nèi)、外源腺苷二磷酸、丙酮酸的污染。消除內(nèi)、外源腺苷二磷酸、丙酮酸的作用發(fā)生在整個反應(yīng)時間段的前半部分,在后半段時間,受污染的內(nèi)、外源腺苷二磷酸、丙酮酸已經(jīng)被消耗殆盡,而后半段時間檢測所需要的腺苷二磷酸、丙酮酸都是源自樣品中含有的鎂離子。
總之,實驗證明采用本發(fā)明的測定方法,完全可以通過紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀器,測定出血漿、血清等樣品中鎂離子的含量,測試靈敏度高、精確度好,不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染。而且,本發(fā)明提供的鎂離子診斷試劑盒,穩(wěn)定性好,長時間存放之后仍然能夠準確檢測各種類型樣品中的鎂離子含量。
權(quán)利要求
1.一種酶法測定鎂離子含量的方法,包括以下步驟①將待測樣品與含有甘油、腺苷三磷酸、甘油激酶、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶和還原型輔酶的試劑混勻,使之發(fā)生以下反應(yīng),②將反應(yīng)混合物置于紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀下,檢測主波長340nm的吸光度的下降幅度,測算出樣品中鎂離子的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法測定鎂離子含量的方法,其特征在于待測樣品與試劑的使用比例按體積控制在1∶10~1∶500。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶法測定鎂離子含量的方法,其特征在于反應(yīng)溫度控制在20℃~50℃,反應(yīng)時間控制在2~30分鐘,檢測時設(shè)定副波長在405nm以上。
4.一種鎂離子診斷試劑盒,盒中試劑由以下成分組成緩沖液 40~200mmol/l,甘油 1~40mmol/l,腺苷三磷酸 0.2~20mmol/l,磷酸烯醇式丙酮酸 1~5mmol/l,還原型輔酶0.2~0.3mmol/l,丙酮酸激酶2000~20000U/l,乳酸脫氫酶2000~50000U/l,甘油激酶 2000~50000U/l,穩(wěn)定劑/試劑總體積 10~80%。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鎂離子診斷試劑盒,其特征在于所述緩沖液的PH范圍是6.0~11.0。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鎂離子診斷試劑盒,其特征在于所述緩沖液是“三羥甲基氨基甲烷~鹽酸緩沖液”、“三乙醇胺緩沖液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液”、“咪唑~鹽酸緩沖液”、“雙甘氨肽緩沖液”、“檸檬酸~檸檬酸鈉緩沖液”、“巴比妥鈉~鹽酸緩沖液”、“硼酸~硼砂緩沖液”、“甘氨酸~氫氧化鈉緩沖液”、“硼砂~氫氧化鈉緩沖液”、“磷酸緩沖液”或者“磷酸鹽緩沖液”中的至少一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鎂離子診斷試劑盒,其特征在于所述穩(wěn)定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸銨、硫基乙醇、牛血清白蛋白、碳酸鹽、膽酸鹽、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、黃素單核苷酸、葡萄糖、谷氨酸鹽、還原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸鹽或者氯化鈉中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鎂離子診斷試劑盒,其特征在于所述氧化型輔酶是——氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+、氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADP+、氧化型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸t(yī)hio-NAD+或者氧化型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸t(yī)hio-NADP+;所述還原型輔酶是——還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH、還原型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸t(yī)hio-NADH或者還原型硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸t(yī)hio-NADPH。
9.權(quán)利要求4~8中任意一項鎂離子診斷試劑盒,其特征在于所述試劑配成單劑、雙劑或者三劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及酶法測定鎂離子含量的方法以及鎂離子診斷試劑盒。應(yīng)用血漿、血清等樣品中鎂離子激活甘油激酶活性的特點,在腺苷三磷酸的存在下與甘油反應(yīng)生成腺苷二磷酸,再偶聯(lián)丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶,將還原型輔酶反應(yīng)成氧化型輔酶,通過測定主波長340nm處吸光度的下降幅度而測定出樣品中鎂離子的含量。該方法特異性高,不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染,測試結(jié)果精確、準確性好。將診斷試劑盒制成雙劑或三劑可減少各成分的交叉影響,保持試劑的穩(wěn)定性,便于長期儲存。該方法在普通紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀上便可快速檢測,不需要特殊或額外儀器,測試成本低廉,便于行業(yè)內(nèi)推廣應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/48GK1778959SQ20041006555
公開日2006年5月31日 申請日期2004年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月23日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司