專利名稱：采用熒光納米顆粒檢測結(jié)核桿菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，具體涉及一種對結(jié)核桿菌進(jìn)行快速、準(zhǔn)確檢測的方法。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是全球傳染病的首要?dú)⑹?，近年來發(fā)病率有上升的趨勢；而結(jié)核分枝桿菌則是引起人類結(jié)核病的主要病原體，結(jié)核桿菌的檢測不僅是診斷結(jié)核病的主要依據(jù)，還是考核療效、隨訪病情的重要指標(biāo)。目前，結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有三類細(xì)菌學(xué)方法、分子生物學(xué)方法、免疫學(xué)方法。細(xì)菌學(xué)方法包括涂片抗酸染色和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)等方法，是醫(yī)院檢查結(jié)核桿菌最常用的方法。涂片抗酸染色法快速簡便，但敏感度很低，陽性率低于50％，不但與病人的排菌量有關(guān)，而且很大程度上依賴于化驗(yàn)工作者的個(gè)人技能和經(jīng)驗(yàn)；改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)法精確可靠、特異性高，但相當(dāng)費(fèi)時(shí)，通常需4～8周才能報(bào)告；近年來一些結(jié)核桿菌快速培養(yǎng)兼鑒定系統(tǒng)陸續(xù)推出并得以應(yīng)用，如BACTEC系列，極大地縮短了培養(yǎng)時(shí)間，但仍需數(shù)日，另外該培養(yǎng)基試劑完全依賴進(jìn)口，成本高導(dǎo)致檢查費(fèi)用昂貴。分子生物學(xué)方法包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法及核酸探針技術(shù)等。PCR法靈敏度很高，但容易發(fā)生污染，出現(xiàn)假陽性、假陰性現(xiàn)象；核酸探針技術(shù)的靈敏度和特異性尚不十分理想。基于血清學(xué)診斷的免疫學(xué)方法有酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、乳膠凝集等，當(dāng)處于結(jié)核病高發(fā)地區(qū)，陽性結(jié)果并不代表一定患結(jié)核病，僅說明過去曾受過結(jié)核桿菌的感染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是利用熒光納米顆?？焖?、準(zhǔn)確地檢測結(jié)核桿菌，以改進(jìn)現(xiàn)有結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷方法或需時(shí)太長或準(zhǔn)確性低或操作步驟繁瑣的問題。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題采用下述技術(shù)方案。一種采用熒光納米顆粒檢測結(jié)核桿菌的方法，其特征在于以表面修飾了結(jié)核桿菌抗體的熒光納米顆粒與結(jié)核桿菌培育，納米顆粒表面固定的結(jié)核桿菌抗體與結(jié)核桿菌細(xì)胞壁表面抗原發(fā)生高特異性的免疫反應(yīng)而形成“熒光納米顆粒-結(jié)核桿菌復(fù)合物”，通過離心作用將“熒光納米顆粒-結(jié)核桿菌復(fù)合物”與游離的未與結(jié)核桿菌結(jié)合的熒光納米顆粒分開，將“熒光納米顆粒-結(jié)核桿菌復(fù)合物”涂片后即可在熒光顯微鏡下觀察到復(fù)合物的熒光，從而實(shí)現(xiàn)對結(jié)核桿菌的快速、準(zhǔn)確檢測，整個(gè)檢測過程可在1小時(shí)之內(nèi)完成。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，其特征在于具體檢測步驟為
(1)熒光納米顆粒對結(jié)核桿菌的識別利用以結(jié)核桿菌細(xì)胞壁抗原為免疫原的結(jié)核桿菌抗體對結(jié)核桿菌具有高特異性的識別能力這一特性，將表面修飾了結(jié)核桿菌抗體的熒光納米顆粒與結(jié)核桿菌的磷酸鹽緩沖液PBS懸浮液在37℃培育0.5-2h，結(jié)核桿菌細(xì)胞壁就會(huì)結(jié)合上大量熒光納米顆粒，形成熒光納米顆粒-結(jié)核桿菌復(fù)合物；(2)熒光納米顆粒-結(jié)核桿菌復(fù)合物與游離的未與結(jié)核桿菌結(jié)合的熒光納米顆粒的分離利用熒光納米顆粒與熒光納米顆粒-結(jié)核桿菌復(fù)合物之間大小和重量的差異，通過離心使熒光納米顆粒-結(jié)核桿菌復(fù)合物沉淀，而游離的未與結(jié)核桿菌結(jié)合的熒光納米顆粒處于上清中，棄去上清；(3)熒光顯微鏡下觀察熒光納米顆粒-結(jié)核桿菌復(fù)合物在熒光納米顆粒-結(jié)核桿菌復(fù)合物沉淀中加入無菌水，將沉淀物分散后，涂片，置于熒光顯微鏡下觀察，以藍(lán)光激發(fā)，被熒光納米顆粒識別的結(jié)核桿菌發(fā)橙紅色的熒光。
本發(fā)明的方法結(jié)合了免疫反應(yīng)高特異性、快速的特點(diǎn)和熒光納米顆粒的信號放大作用(即高敏感性)，簡化了檢測步驟、縮短了檢測時(shí)間、提高了方法的敏感度以及減小了假陽性率；與抗酸染色法相比，本法結(jié)合了熒光納米顆粒的高敏感性和結(jié)核桿菌抗體的高特異性，可以提高檢測方法的敏感性以及減小假陽性現(xiàn)象；本法不需要對細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，與各種培養(yǎng)法相比，極大地縮短了檢測的時(shí)間；與聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)等方法相比，操作更簡單、步驟更少、耗時(shí)更省，檢測快速、準(zhǔn)確。


圖1為結(jié)核桿菌與大腸桿菌分別與表面修飾了結(jié)核桿菌抗體的熒光納米顆粒培育后在激光共聚焦顯微鏡下的成像圖。
圖中A-結(jié)核桿菌的光學(xué)成像圖B-被修飾了結(jié)核桿菌抗體的熒光納米顆粒識別的結(jié)核桿菌的熒光成像圖C-大腸桿菌的光學(xué)成像圖D-大腸桿菌與修飾了結(jié)核桿菌抗體的熒光納米顆粒培育后的熒光成像2為修飾了結(jié)核桿菌抗體的熒光納米顆粒對混和細(xì)菌樣品中結(jié)核桿菌識別的成像圖。
大腸桿菌用異硫氰酸熒光素(FITC)染色后與未染色的結(jié)核桿菌混合，再與修飾了結(jié)核桿菌抗體的熒光納米顆粒共培育，離心棄去游離的納米顆粒，涂片后在激光共聚焦顯微鏡下觀察。
圖中A-激光共聚焦顯微鏡綠色通道所采集到的熒光，是大腸桿菌細(xì)胞壁上所結(jié)合的異硫氰酸熒光素(FITC)的熒光
B-激光共聚焦顯微鏡紅色通道所采集到的熒光，是結(jié)合在結(jié)核桿菌細(xì)胞壁上的熒光納米顆粒所發(fā)出的熒光C-激光共聚焦顯微鏡綠色通道與紅色通道的疊加D-激光共聚焦顯微鏡透射光成像3為修飾了結(jié)核桿菌抗體的熒光納米顆粒對混和細(xì)菌樣品中結(jié)核桿菌識別的成像圖。
大腸桿菌用異硫氰酸熒光素(FITC)染色后與未染色的結(jié)核桿菌混合，再與修飾了結(jié)核桿菌抗體的熒光納米顆粒共培育，離心棄去游離的納米顆粒，涂片后在熒光顯微鏡下觀察。
圖中A-藍(lán)光激發(fā)下的熒光成像圖，其中打圓圈的為大腸桿菌，由于細(xì)胞壁上結(jié)合了異硫氰酸熒光素(FITC)而發(fā)綠色熒光，未打圓圈的為結(jié)核桿菌，由于細(xì)胞壁上結(jié)合了熒光納米顆粒而發(fā)橙紅色熒光B-混和細(xì)菌的光學(xué)成像圖如圖1所示結(jié)核桿菌與表面修飾了結(jié)核桿菌抗體的熒光納米顆粒培育后形成“熒光納米顆粒-結(jié)核桿菌復(fù)合物”而發(fā)熒光，但大腸桿菌與表面修飾了結(jié)核桿菌抗體的熒光納米顆粒培育后無熒光，說明修飾了結(jié)核桿菌抗體的熒光納米顆粒對結(jié)核桿菌的識別是特異性的，對大腸桿菌的非特異性小，這有利于減小假陽性率。
如圖2和圖3所示表明利用修飾了結(jié)核桿菌抗體的熒光納米顆粒能將混和細(xì)菌樣品中的結(jié)核桿菌特異性地檢測出來。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一，采用熒光納米顆?？焖?、準(zhǔn)確檢測結(jié)核桿菌(1)熒光納米顆粒對結(jié)核桿菌的識別利用以結(jié)核桿菌細(xì)胞壁抗原為免疫原的結(jié)核桿菌抗體對結(jié)核桿菌具有高特異性的識別能力這一特性，將表面修飾了結(jié)核桿菌抗體的熒光納米顆粒與結(jié)核桿菌的磷酸鹽緩沖液PBS(pH7.4，0.01M)懸浮液在37℃培育0.5-2h，結(jié)核桿菌細(xì)胞壁上就會(huì)結(jié)合上大量熒光納米顆粒，形成“熒光納米顆粒-結(jié)核桿菌復(fù)合物”。
(2)“熒光納米顆粒-結(jié)核桿菌復(fù)合物”與游離的未與結(jié)核桿菌結(jié)合的熒光納米顆粒的分離利用熒光納米顆粒與“熒光納米顆粒-結(jié)核桿菌復(fù)合物”之間大小和重量的差異，通過離心使“熒光納米顆粒-結(jié)核桿菌復(fù)合物”沉淀而游離的未與結(jié)核桿菌結(jié)合的熒光納米顆粒處于上清中，棄去上清；如在4000rpm下離心5min，將上清棄去后，重新分散在無菌水中，如此重復(fù)三次。
(3)熒光顯微鏡下觀察“熒光納米顆粒-結(jié)核桿菌復(fù)合物”在熒光納米顆粒-結(jié)核桿菌復(fù)合物沉淀中加入無菌水，將沉淀物分散后，涂片，置于熒光顯微鏡下觀察，以藍(lán)光激發(fā)，被熒光納米顆粒識別的結(jié)核桿菌發(fā)橙紅色的熒光，若在激光共聚焦顯微鏡下成像，可在紅色通道檢測到結(jié)核桿菌細(xì)胞壁上結(jié)合的納米顆粒的熒光(參見圖1的A和B激光共聚焦顯微鏡成像圖)。
實(shí)施例二，采用熒光納米顆?？焖佟?zhǔn)確檢測混和細(xì)菌體系(同時(shí)含有大腸桿菌和結(jié)核桿菌)中的結(jié)核桿菌(1)混和細(xì)菌樣品的制備由于從形態(tài)上無法區(qū)分大腸桿菌與結(jié)核桿菌，因此用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記大腸桿菌以區(qū)別于結(jié)核桿菌。在0.1mol/L pH9.0碳酸鹽緩沖液中，大腸桿菌與0.5mg/ml異硫氰酸熒光素(FITC)在37℃培育2h，用0.01M pH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)洗三次后，與未經(jīng)任何染色的結(jié)核桿菌混和懸浮于磷酸鹽緩沖液(PBS)中形成混合細(xì)菌樣品。
(2)熒光納米顆粒與混合細(xì)菌樣品共培育將表面修飾了結(jié)核桿菌抗體的熒光納米顆粒與混合細(xì)菌樣品在37℃培育0.5-2h，納米顆粒表面固定的結(jié)核桿菌抗體高特異性地與結(jié)核桿菌細(xì)胞壁表面抗原結(jié)合而使結(jié)核桿菌細(xì)胞壁結(jié)合上大量熒光納米顆粒，形成“熒光納米顆粒-結(jié)核桿菌復(fù)合物”。
(3)游離熒光納米顆粒與各細(xì)菌及“熒光納米顆粒-細(xì)菌復(fù)合物”的分離利用熒光納米顆粒與細(xì)菌及“熒光納米顆粒-細(xì)菌菌復(fù)合物”之間大小和重量的差異，通過離心使各細(xì)菌及“熒光納米顆粒-細(xì)菌復(fù)合物”沉淀而游離熒光納米顆粒處于上清中，棄去上清；如在4000rpm下離心5min，將上清棄去后，重新分散在無菌水中，如此重復(fù)三次。
(4)熒光顯微鏡下觀察各細(xì)菌的熒光在通過離心除去游離納米顆粒的細(xì)菌及“熒光納米顆粒-細(xì)菌復(fù)合物”沉淀中加入無菌水，將沉淀物分散后，涂片，置于熒光顯微鏡下觀察，以藍(lán)光激發(fā)，被熒光納米顆粒識別的結(jié)核桿菌發(fā)橙紅色的熒光而大腸桿菌發(fā)綠色熒光(參見圖3)，若在激光共聚焦顯微鏡下成像，大腸桿菌只發(fā)異硫氰酸熒光素(FITC)的綠色熒光而沒有熒光納米顆粒的紅色熒光，說明表面修飾了結(jié)核桿菌抗體的熒光納米顆粒對結(jié)核桿菌的識別是高特異的，對大腸桿菌的非特異性吸附小(參見圖2)。
上述實(shí)施例中，所述熒光納米顆粒用如下方法制得將環(huán)己烷(7.5ml)、表面活性劑曲拉通Triton X-100(1.8ml)和正己醇(1.8ml)(體積比為4.2∶1∶1)，混合均勻，加入H2O(400μl)作為分散相，攪拌5分鐘后形成反相微乳液，加入0.1mol/L聯(lián)吡啶釕配合物的水溶液(50μl)，攪拌均勻后加入正硅酸乙酯(200μl)和氨水(200μl)，反應(yīng)24h后加入丙酮破乳，離心收集納米顆粒，依次用丙酮、乙醇、水洗滌反應(yīng)后的納米顆粒，由此可制得以熒光物質(zhì)聯(lián)吡啶釕配合物Ru(BPY)3為內(nèi)核的二氧化硅熒光納米顆粒。
所述的表面修飾了結(jié)核桿菌抗體的熒光納米顆粒用以下方法制得將熒光納米顆粒經(jīng)高壓滅菌后懸浮于經(jīng)0.22μm濾膜除菌的2ml 2mol/L Na2CO3中，超聲10-15min，在劇烈的磁攪拌下將2ml CNBr/乙腈液(0.2g CNBr/每毫升乙腈)逐滴滴至納米顆粒懸浮液中，反應(yīng)10min，加入30ml無菌冰水終止反應(yīng)，分別用無菌冰水和無菌冷磷酸鹽緩沖液PBS(pH7.4，0.01M)各洗三次，最后懸浮在1ml無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)中，加入結(jié)核桿菌抗體，4℃輕微振蕩過夜，用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗兩次后，加入pH8.0，1mol/L無菌乙醇胺，4℃輕微振蕩16h以封閉反應(yīng)，用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗三次，制得修飾了結(jié)核桿菌抗體的熒光納米顆粒，貯存于4℃?zhèn)溆谩?br> 權(quán)利要求
1.一種采用熒光納米顆粒檢測結(jié)核桿菌的方法，其特征在于以表面修飾了結(jié)核桿菌抗體的熒光納米顆粒與結(jié)核桿菌培育，納米顆粒表面固定的結(jié)核桿菌抗體與結(jié)核桿菌細(xì)胞壁表面抗原發(fā)生高特異性的免疫反應(yīng)而形成熒光納米顆粒-結(jié)核桿菌復(fù)合物，通過離心作用將熒光納米顆粒-結(jié)核桿菌復(fù)合物與游離的未與結(jié)核桿菌結(jié)合的熒光納米顆粒分開，將熒光納米顆粒-結(jié)核桿菌復(fù)合物涂片后即可在熒光顯微鏡下觀察到復(fù)合物的熒光，實(shí)現(xiàn)對結(jié)核桿菌的快速、準(zhǔn)確檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用熒光納米顆粒檢測結(jié)核桿菌的方法，其特征在于其具體檢測步驟為(1)熒光納米顆粒對結(jié)核桿菌的識別利用以結(jié)核桿菌細(xì)胞壁抗原為免疫原的結(jié)核桿菌抗體對結(jié)核桿菌具有高特異性的識別能力這一特性，將表面修飾了結(jié)核桿菌抗體的熒光納米顆粒與結(jié)核桿菌的磷酸鹽緩沖液PBS懸浮液在37℃培育0.5-2h，結(jié)核桿菌細(xì)胞壁就會(huì)結(jié)合上大量熒光納米顆粒，形成熒光納米顆粒-結(jié)核桿菌復(fù)合物；(2)熒光納米顆粒-結(jié)核桿菌復(fù)合物與游離的未與結(jié)核桿菌結(jié)合的熒光納米顆粒的分離利用熒光納米顆粒與熒光納米顆粒-結(jié)核桿菌復(fù)合物之間大小和重量的差異，通過離心使熒光納米顆粒-結(jié)核桿菌復(fù)合物沉淀，而游離的未與結(jié)核桿菌結(jié)合的熒光納米顆粒處于上清中，棄去上清；(3)熒光顯微鏡下觀察熒光納米顆粒-結(jié)核桿菌復(fù)合物在熒光納米顆粒-結(jié)核桿菌復(fù)合物沉淀中加入無菌水，將沉淀物分散后，涂片，置于熒光顯微鏡下觀察，以藍(lán)光激發(fā)，被熒光納米顆粒識別的結(jié)核桿菌發(fā)橙紅色的熒光。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的采用熒光納米顆粒檢測結(jié)核桿菌的方法，其特征在于所述熒光納米顆粒用如下方法制得按4.2∶1∶1的體積比，將環(huán)己烷7.5ml、表面活性劑曲拉通Triton X-100 1.8ml和正己醇1.8ml混合均勻，加入400μl H2O作為分散相，攪拌均勻后形成反相微乳液，加入50μl 0.1mol/L聯(lián)吡啶釕配合物的水溶液，攪拌均勻后加入200μl正硅酸乙酯和200μl氨水，反應(yīng)24h后加入丙酮破乳，離心收集納米顆粒，依次用丙酮、乙醇、水洗滌反應(yīng)后的納米顆粒，由此可制得以熒光物質(zhì)聯(lián)吡啶釕配合物Ru(BPY)3為內(nèi)核的二氧化硅熒光納米顆粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的采用熒光納米顆粒檢測結(jié)核桿菌的方法，其特征在于所述的表面修飾了結(jié)核桿菌抗體的熒光納米顆粒用以下方法制得將熒光納米顆粒經(jīng)高壓滅菌后懸浮于經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌的2ml 2mol/L碳酸鈉Na2CO3中，超聲10-15min，在劇烈的磁攪拌下將2ml 0.2g/ml溴化氰CNBr/乙腈液反應(yīng)逐滴滴至納米顆粒懸浮液中，反應(yīng)10min，加入30ml無菌冰水終止反應(yīng)，分別用無菌冰水和pH7.4，0.01mol/L無菌冷磷酸鹽緩沖液PBS各洗三次，最后懸浮在1ml無菌磷酸鹽緩沖液PBS中，加入結(jié)核桿菌抗體，4℃輕微振蕩過夜，用無菌磷酸鹽緩沖液PBS洗兩次后，加入pH8.0，1mol/L無菌乙醇胺，4℃輕微振蕩16h以封閉反應(yīng)，用無菌磷酸鹽緩沖液PBS洗三次，制得修飾了結(jié)核桿菌抗體的熒光納米顆粒，貯存于4℃?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
本發(fā)明公開了一種采用熒光納米顆粒檢測結(jié)核桿菌的方法，其特點(diǎn)是以表面修飾了結(jié)核桿菌抗體的熒光納米顆粒與結(jié)核桿菌培育，納米顆粒表面固定的結(jié)核桿菌抗體與結(jié)核桿菌細(xì)胞壁表面抗原發(fā)生高特異性的免疫反應(yīng)而形成熒光納米顆粒－結(jié)核桿菌復(fù)合物，通過離心作用將熒光納米顆粒－結(jié)核桿菌復(fù)合物與游離的未與結(jié)核桿菌結(jié)合的熒光納米顆粒分開，將熒光納米顆粒－結(jié)核桿菌復(fù)合物涂片后即可在熒光顯微鏡下觀察到復(fù)合物的熒光，實(shí)現(xiàn)對結(jié)核桿菌的快速、準(zhǔn)確檢測。該方法結(jié)合了免疫反應(yīng)高特異性、快速的特點(diǎn)和熒光納米顆粒的信號放大作用，簡化了檢測步驟、縮短了檢測時(shí)間、提高了方法的敏感度及減小了假陽性率。
文檔編號C12Q1/04GK1597978SQ20041004680
公開日2005年3月23日 申請日期2004年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月28日
發(fā)明者王柯敏, 譚蔚泓, 秦迪嵐, 何曉曉, 陳基耘 申請人:湖南大學(xué)