專利名稱：硅殼納米顆粒檢測(cè)sars病毒基因組片斷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種SARS病毒的檢測(cè)方法，具體涉及一種利用硅殼納米探針對(duì)SARS病毒基因組進(jìn)行純化和檢測(cè)的方法。
背景技術(shù)：
目前，一般檢測(cè)SARS病毒的方法有三類分子生物學(xué)檢測(cè)方法(PCR檢測(cè))、免疫學(xué)方法(抗體檢測(cè))、細(xì)胞學(xué)方法(細(xì)胞培養(yǎng))。單純的PCR檢測(cè)方法由于擴(kuò)增產(chǎn)物有較強(qiáng)的非特異性，且容易發(fā)生污染，出現(xiàn)假陽(yáng)性、假陰性現(xiàn)象，所以會(huì)出現(xiàn)無法確診的情況。免疫學(xué)方法是基于病毒蛋白檢測(cè)患者或疑似患者血液中的是否存在該病毒的抗體，而最早的血清抗體IgM出現(xiàn)要7天左右，抗體IgG的產(chǎn)生則在10后，20天左右才達(dá)到高峰。一般患者在剛發(fā)熱時(shí)，血液中已經(jīng)存在病毒，但抗體還沒有發(fā)展起來，所以單純用抗體檢測(cè)方法會(huì)令醫(yī)生難以判斷SARS病毒的存在。細(xì)胞培養(yǎng)方法是最早發(fā)展的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段，能夠在電子顯微鏡下直接觀察到病毒顆粒，因而十分準(zhǔn)確。但技術(shù)難道高，操作復(fù)雜，所需時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)設(shè)備要求相當(dāng)高，不適于臨床檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是利用病毒檢測(cè)的三明治模型和硅殼納米顆粒高靈敏度以及雜交檢測(cè)的高準(zhǔn)確性對(duì)SARS病毒基因組片斷進(jìn)行檢測(cè)，以克服一般分子生物學(xué)方法檢測(cè)SARS病毒所存在的假陽(yáng)性和假陰性問題。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題采用下述技術(shù)方案。一種硅殼納米顆粒檢測(cè)SARS病毒基因組片斷的方法一構(gòu)建三明治結(jié)構(gòu)的檢測(cè)模型，即構(gòu)建由將待檢測(cè)的SARS病毒基因組片斷、標(biāo)記有熒光納米檢測(cè)信號(hào)的硅殼熒光納米探針、以及能與玻璃芯片相聯(lián)的寡核苷酸探針組成的類似三明治結(jié)構(gòu)的檢測(cè)模型。二設(shè)計(jì)對(duì)SARS病毒進(jìn)行基因片斷檢測(cè)的各探針序列和檢測(cè)序列以及PCR擴(kuò)增的引物序列，根據(jù)SARS基因組序列，通過BLAST分析SARS病毒基因組，篩選出與人類及其它病毒基因組無同源性的2個(gè)探針序列，其中之一作為硅殼磁性納米探針的序列和硅殼熒光納米探針的序列，另一段作為與玻璃芯片基片相連接的探針的序列。而包含這2段序列的100bp的序列作為SARS病毒基因組的檢測(cè)序列。再用primer express2.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)1套PCR引物。三合成與制備用于SARS病毒基因病毒組提取與純化的硅殼磁性納米探針和對(duì)特異SARS病毒基因組片斷進(jìn)行熒光檢測(cè)的硅殼熒光納米探針及玻璃芯片，將制備的磁性納米顆粒和表面氨基化熒光納米顆粒用生物素化的牛血清白蛋白以及鏈霉親和素修飾好，然后聯(lián)接上合成的cDNA，制備成修飾有與SARS病毒基因組具有35個(gè)堿基互補(bǔ)cDNA序列的硅殼磁性納米探針和熒光納米探針；在購(gòu)買的醛基化玻璃芯片上修飾生物素化的牛血清白蛋白以及鏈霉親和素制備成玻璃芯片基片。四檢測(cè)，其具體過程為1)、雜交，硅殼磁性納米探針與SARS病毒基因片斷及其它非SARS病毒基因片斷的樣品進(jìn)行雜交，2)、磁分離，利用硅殼磁性納米顆粒的磁性分離作用將SARS病毒基因組從混合樣品中分離和純化出來。3)、PCR擴(kuò)增，純化的SARS病毒基因組通過一對(duì)特定的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到100bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。4)、熒光檢測(cè)，與擴(kuò)增產(chǎn)物有35個(gè)堿基互補(bǔ)序列的熒光納米探針再和擴(kuò)增產(chǎn)物以及同樣修飾有34個(gè)堿基互補(bǔ)序列的玻璃芯片以一種類似三明治結(jié)構(gòu)的模型進(jìn)行雜交，而后用激光共聚焦熒光顯微鏡對(duì)芯片進(jìn)行掃描檢測(cè)。
本發(fā)明硅殼納米顆粒檢測(cè)SARS病毒基因組片斷的方法有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明利用磁性納米探針對(duì)SARS病毒的基因片斷進(jìn)行提取，從而將SARS病毒的基因片斷從含有許多非SARS病毒的基因片斷的樣本中純化出來，避免直接將此樣本作為PCR擴(kuò)增的模板將可能會(huì)導(dǎo)致的非特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物減少到最低，而在一定程度上控制假陽(yáng)性的出現(xiàn)。
本發(fā)明優(yōu)越于單純PCR檢測(cè)方法的特點(diǎn)在于，它利用了PCR檢測(cè)方法的高敏感性，故有可能做到對(duì)SARS患者進(jìn)行早期檢測(cè)。同時(shí)，它又克服了單純靠PCR檢測(cè)技術(shù)所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物中存在的非特異性現(xiàn)象，通過利用三明治檢測(cè)模型對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基序列進(jìn)行雜交檢測(cè)而對(duì)這些產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。另外在三明治檢測(cè)模型中，作為熒光檢測(cè)標(biāo)記的硅殼熒光納米探針將大量聯(lián)釕吡啶熒光染料包裹在具有光保護(hù)性硅殼當(dāng)中，與常用的直接將探針序列標(biāo)記在染料分子上的方法相比，具有信號(hào)放大和抗熒光信號(hào)的光漂白的效應(yīng)。


圖1為本發(fā)明的三明治檢測(cè)模型圖；其中1-硅殼熒光納米探針2-能修飾于玻璃芯片的寡核苷酸探針3-SARS病毒基因組片斷4-玻璃芯片基片圖2為本發(fā)明的檢測(cè)方法的流程圖；圖3為本發(fā)明的檢測(cè)實(shí)施例的激光共聚焦熒光顯微鏡掃描結(jié)果圖；其中5-對(duì)照(其熒光強(qiáng)度值為33)6-樣品1(SARS病毒cDNA含量6×10-12mol，其熒光強(qiáng)度值為307)
7-樣品2(SARS病毒cDNA含量3×10-12mol，其熒光強(qiáng)度值為159)
具體實(shí)施例方式現(xiàn)結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作出進(jìn)一步說明。
一、SARS病毒基因片斷檢測(cè)的三明治模型。
如圖1所示，該模型由SARS病毒基因的cDNA片斷、硅殼熒光納米探針、玻璃芯片相聯(lián)的另一段寡核苷酸序列組成。將SARS病毒基因的cDNA片斷分別與硅殼熒光納米探針上的一段寡核苷酸序列以及能與玻璃芯片相聯(lián)的另一段寡核苷酸序列在適當(dāng)?shù)臈l件下雜交反映，形成類似三明治結(jié)構(gòu)的雜交復(fù)合物。此雜交復(fù)合物能與特制的玻璃芯片偶聯(lián)。偶聯(lián)到玻璃芯片上的雜交復(fù)合物因?yàn)闊晒饧{米探針的熒光放大效應(yīng)，而激發(fā)出能用激光共聚焦熒光顯微鏡檢測(cè)出來的強(qiáng)烈熒光。
二、設(shè)計(jì)對(duì)SARS病毒進(jìn)行基因片斷檢測(cè)的各探針序列和檢測(cè)序列以及PCR擴(kuò)增的引物序列。
根據(jù)NCBI(National Center for Biotechnology Information)網(wǎng)站所提供的SARS冠狀病毒(NCBI的NC_004718株及gi33115118株)全基因組序列，通過BLAST分析SARS病毒基因組，篩選出與人類及其它病毒基因組無同源性的2個(gè)探針序列，其中之一作為硅殼磁性納米探針的序列和硅殼熒光納米探針的序列，另一段作為與玻璃芯片基片相連接的探針的序列。而包含這2段序列的100bp的序列作為SARS病毒基因組的檢測(cè)序列。再用primer express2.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)1套PCR引物。它們的具體序列如下硅殼磁性納米探針序列5’-TCATAGAGCC TGTGTTGTAG ATTGCGGACA TACTT-Biotin-3’硅殼熒光納米探針序列5’-TCATAGAGCC TGTGTTGTAG ATTGCGGACA TACTT-biotin-3’與玻璃芯片基片相連接的探針序列5’-biotin-CATCCACGAA TTCATGATCA ACATCCCTAT TTCT-3’SARS病毒檢測(cè)序列(即PCR擴(kuò)增區(qū)域)5’-GATGGTAATA AGATAGCTGA CAAGTATGTC CGCAATCTAC AACACAGGCTCTATGAGTGT CTCTATAGAA ATAGGGATGT TGATCATGAA TTCGTGGATG-3’PCR引物上游引物5’-GATGGTAATA AGATAGCTGA CAAGT-3’下游引物
5’-CATCCACGAA TTCATGATCA-3’三、制備硅殼磁性納米探針和硅殼熒光納米探針以及玻璃芯片。
硅殼磁性納米探針制備將用反相微乳法制備的大小60-100納米的表面氨基化四氧化三鐵磁性納米顆粒懸浮在0.1M醋酸溶液溶液中，超聲波振蕩10分鐘后，加入用丙酮與水溶解的三嗪三唑溶液3毫升，室溫下攪拌1小時(shí)。分別用丙酮和超純水以及10nM的磷酸緩沖液洗滌后，用磷酸緩沖液分散，加入生物素化的牛血清白蛋白，4℃下連續(xù)攪拌24小時(shí)，磷酸緩沖液洗滌2-3次，再加入鏈霉親和素，室溫下攪拌4小時(shí)以上，磷酸緩沖液洗滌2-3次，加入合成的cDNA，4℃下連續(xù)攪拌24小時(shí)，磷酸緩沖液洗滌備用。
硅殼熒光納米探針將用反相微乳法制備的大小約60-100納米的內(nèi)核含有聯(lián)釕吡啶熒光染料的熒光納米顆粒超聲，懸浮在20毫升1mM的醋酸溶液中，加入20微升氨基硅烷化試劑WD-52，連續(xù)攪拌1小時(shí)，用超純水洗滌后懸浮在0.1M醋酸溶液中，超聲波振蕩10分鐘后，加入用丙酮與水溶解的三嗪三唑溶液3毫升，室溫下攪拌1小時(shí)。分別用丙酮和超純水以及pH7.4的磷酸緩沖液洗滌后，用磷酸緩沖液分散，加入生物素化的牛血清白蛋白，4℃下連續(xù)攪拌24小時(shí)，磷酸緩沖液洗滌2-3次，再加入鏈霉親和素，室溫下攪拌4小時(shí)以上，PBS洗滌2-3次，加入合成的cDNA，4℃下連續(xù)攪拌24小時(shí)，磷酸緩沖液洗滌備用。
玻璃芯片制備在購(gòu)買的表面經(jīng)醛基化修飾的玻片上滴加生物素化的牛血清白蛋白，置于4℃冰箱，使生物素化的牛血清白蛋白吸附在玻片上，24小時(shí)后取出玻片用磷酸緩沖液輕輕沖洗，再在被覆生物素化的牛血清白蛋白的位置滴加鏈霉親和素，在4℃冰箱中放置24小時(shí)，用磷酸緩沖液輕輕沖洗備用。
四、檢測(cè)。
見圖2所示，其流程如下1、雜交，將制備好的磁性納米探針與含有SARS病毒基因片斷及其它非SARS病毒基因片斷的樣品在55℃，6×SSC、0.1％SDS的雜交緩沖液中雜交30分鐘。
2、磁分離，雜交完畢，將裝有反應(yīng)物的EP管置于磁分離器上，用磁分離器將與磁納米顆粒上探針雜交上的目標(biāo)片斷吸附在管壁上，再用磷酸緩沖液洗滌2-3次。然后將磁納米顆粒懸浮在少量無菌水中，95℃變性5分鐘后立即置于冰水中10分鐘左右使雜交于磁納米探針上的目標(biāo)從磁納米顆粒上解離?？焖僬袷帋酌牒螅賹P管置于磁分離器上，磁納米顆粒吸附于管壁而目標(biāo)溶解于無菌水中。吸取含純目標(biāo)的上清溶液作PCR擴(kuò)增反應(yīng)所需模板備用。
3、PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件95℃ 5min；95℃ 30s，55℃ 15s(每個(gè)退火溫度重復(fù)3個(gè)循環(huán)，然后退后溫度下降1℃)，72℃ 15s，共18循環(huán)；95℃ 30s，55℃ 15s，72℃ 15s，共20循環(huán)；72℃ 15min。
4、熒光檢測(cè)，將用硅殼熒光納米探針與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及能連接到玻璃芯片上探針序列在55℃，6×SSC、0.1％SDS的雜交緩沖液中雜交30min。然后將反應(yīng)混合液滴加在玻片上加鏈霉親和素的位置。再將玻片放在濕盒中室溫放置2個(gè)小時(shí)以上，再用磷酸緩沖液和無菌水輕輕沖洗，晾干備用。用FV500-IX70激光共聚焦熒光顯微鏡對(duì)芯片進(jìn)行掃描。其檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，其中5表示對(duì)照，6表示樣品1，7表示樣品2。根據(jù)多次統(tǒng)計(jì)的結(jié)果，陰性對(duì)照的熒光強(qiáng)度值為30±20，不同樣品的熒光值都大于160。因此可以根據(jù)熒光值確定檢測(cè)樣品中SARS病毒的存在與否。
權(quán)利要求
1.一種硅殼納米顆粒檢測(cè)SARS病毒基因組片斷的方法，其特征在于一、構(gòu)建三明治結(jié)構(gòu)的檢測(cè)模型，即構(gòu)建由將待檢測(cè)的SARS病毒基因組片斷、標(biāo)記有熒光納米檢測(cè)信號(hào)的硅殼熒光納米探針、以及能與玻璃芯片相聯(lián)的寡核苷酸探針組成的類似三明治結(jié)構(gòu)的檢測(cè)模型；二、設(shè)計(jì)對(duì)SARS病毒進(jìn)行基因片斷檢測(cè)的各探針序列和檢測(cè)序列以及PCR擴(kuò)增的引物序列，根據(jù)SARS基因組序列，通過BLAST分析SARS病毒基因組，篩選出與人類及其它病毒基因組無同源性的2個(gè)探針序列，其中之一作為硅殼磁性納米探針的序列和硅殼熒光納米探針的序列，另一段作為與玻璃芯片基片相連接的探針的序列；而包含這2段序列的100bp的序列作為SARS病毒基因組的檢測(cè)序列；再用primer express2.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)1套PCR引物；三、合成與制備用于SARS病毒基因病毒組提取與純化的硅殼磁性納米探針和對(duì)特異SARS病毒基因組片斷進(jìn)行熒光檢測(cè)的硅殼熒光納米探針及玻璃芯片，將制備的磁性納米顆粒和表面氨基化熒光納米顆粒用生物素化的牛血清白蛋白以及鏈霉親和素修飾好，然后聯(lián)接上合成的cDNA，制備成修飾有與SARS病毒基因組具有35個(gè)堿基互補(bǔ)cDNA序列的硅殼磁性納米探針和熒光納米探針；在醛基化玻璃芯片上修飾生物素化的牛血清白蛋白以及鏈霉親和素制備成玻璃芯片基片；四、檢測(cè)，其具體過程為1)雜交硅殼磁性納米探針與SARS病毒基因片斷及其它非SARS病毒基因片斷的樣品進(jìn)行雜交，2)磁分離利用硅殼磁性納米顆粒的磁性分離作用將SARS病毒基因組從混合樣品中分離和純化出來；3)PCR擴(kuò)增純化的SARS病毒基因組通過一對(duì)特定的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到100bp的擴(kuò)增產(chǎn)物；4)熒光檢測(cè)與擴(kuò)增產(chǎn)物有35個(gè)堿基互補(bǔ)序列的熒光納米探針再和擴(kuò)增產(chǎn)物以及同樣修飾有34個(gè)堿基互補(bǔ)序列的玻璃芯片以一種類似三明治結(jié)構(gòu)的模型進(jìn)行雜交，而后用激光共聚焦熒光顯微鏡對(duì)芯片進(jìn)行掃描檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硅殼納米顆粒檢測(cè)SARS病毒基因組片斷的方法，其特征在于硅殼磁性納米探針的制備為將用反相微乳法制備的大小60-100納米的表面氨基化四氧化三鐵磁性納米顆粒懸浮在0.1M醋酸溶液溶液中，超聲波振蕩10分鐘后，加入用丙酮與水溶解的三嗪三唑溶液3毫升，室溫下攪拌1小時(shí)；分別用丙酮和超純水以及10nM的磷酸緩沖液洗滌后，用磷酸緩沖液分散，加入生物素化的牛血清白蛋白，2-6℃下連續(xù)攪拌24小時(shí)，磷酸緩沖液洗滌2-3次，再加入鏈霉親和素，室溫下攪拌4小時(shí)以上，磷酸緩沖液洗滌2-3次，加入合成的cDNA，2-6℃下連續(xù)攪拌24小時(shí)，磷酸緩沖液洗滌備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硅殼納米顆粒檢測(cè)SARS病毒基因組片斷的方法，其特征在于硅殼熒光納米探針的制備為將用反相微乳法制備的大小為60-100納米的內(nèi)核含有聯(lián)釕吡啶熒光染料的熒光納米顆粒超聲，懸浮在20毫升1mM的醋酸溶液中，加入20微升氨基硅烷化試劑WD-52，連續(xù)攪拌1小時(shí)，用超純水洗滌后懸浮在0.1M醋酸溶液中，超聲波振蕩10分鐘后，加入用丙酮與水溶解的三嗪三唑溶液3毫升，室溫下攪拌1小時(shí)，分別用丙酮和超純水以及pH7.4的磷酸緩沖液洗滌后，用磷酸緩沖液分散，加入生物素化的牛血清白蛋白，2-6℃下連續(xù)攪拌24小時(shí)，磷酸緩沖液洗滌2-3次，再加入鏈霉親和素，室溫下攪拌4小時(shí)以上，磷酸緩沖液洗滌2-3次，加入合成的cDNA，2-6℃下連續(xù)攪拌24小時(shí)，磷酸緩沖液洗滌備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硅殼納米顆粒檢測(cè)SARS病毒基因組片斷的方法，其特征在于玻璃芯片的制備為在表面經(jīng)醛基化修飾的玻片上滴加生物素化的牛血清白蛋白，在2-6℃環(huán)境下，使生物素化的牛血清白蛋白吸附在玻片上，24小時(shí)后取出玻片用磷酸緩沖液輕輕沖洗，再在被覆生物素化的牛血清白蛋白的位置滴加鏈霉親和素，在2-6℃的環(huán)境下中放置24小時(shí)，用磷酸緩沖液輕輕沖洗備用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種硅殼納米顆粒檢測(cè)SARS病毒基因組片斷的方法，其特點(diǎn)是構(gòu)建了用于SARS病毒檢測(cè)的三明治模型，利用自制的修飾有與SARS病毒基因組特有序列互補(bǔ)的cDNA片斷的硅殼磁性納米探針對(duì)含有SARS病毒基因組的樣本進(jìn)行病毒基因組的提取與純化，再在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR擴(kuò)增)對(duì)病毒基因片斷進(jìn)行擴(kuò)增的基礎(chǔ)上，用修飾有與SARS病毒基因片斷特異序列互補(bǔ)的cDNA片斷的硅殼熒光納米探針及玻璃芯片對(duì)SARS病毒基因片斷進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明的檢測(cè)方法具有快捷，靈敏度和特異性高，穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1597987SQ20041004662
公開日2005年3月23日 申請(qǐng)日期2004年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月3日
發(fā)明者譚蔚泓, 王柯敏, 龔萍, 何曉曉 申請(qǐng)人:湖南大學(xué)