專利名稱：一種灌注式生物反應(yīng)器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于組織工程領(lǐng)域，具體涉及一種灌注式生物反應(yīng)器，該生物反應(yīng)器是一種可對(duì)細(xì)胞/支架復(fù)合物進(jìn)行灌注式培養(yǎng)的工程化組織培養(yǎng)裝置。
背景知識(shí)組織工程涉及種子細(xì)胞、支架材料和培養(yǎng)環(huán)境。工程化組織的構(gòu)建是從種子細(xì)胞和支架復(fù)合開(kāi)始的，培養(yǎng)環(huán)境對(duì)工程化組織的形成具有重要影響。生物反應(yīng)器的目的就是幫助在體外培養(yǎng)新的組織和提供培養(yǎng)的細(xì)胞一定的刺激。為進(jìn)行不同目的的培養(yǎng)，人們?cè)O(shè)計(jì)出不同生物反應(yīng)器，在這些生物反應(yīng)器中有代表性的為旋轉(zhuǎn)瓶式和旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器。旋轉(zhuǎn)瓶式生物反應(yīng)器通過(guò)電磁棒的攪拌來(lái)維持培養(yǎng)液混合均勻，電磁棒產(chǎn)生的對(duì)流力有助于減小支架材料表面培養(yǎng)液濃度梯度。旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器具有模擬微重力、低剪切力優(yōu)點(diǎn)，可進(jìn)行高密度和三維培養(yǎng)。盡管這些生物反應(yīng)器具有自身的優(yōu)點(diǎn)，并且緩和了支架材料外部和內(nèi)部的氧氣、養(yǎng)料和代謝廢物的擴(kuò)散限制，但它們不能使培養(yǎng)液和其它的營(yíng)養(yǎng)物滲透到支架材料的多孔網(wǎng)絡(luò)中去，這樣內(nèi)部的細(xì)胞因?yàn)檠鯕?、養(yǎng)料供應(yīng)受限及代謝廢物的聚集導(dǎo)致生長(zhǎng)和發(fā)育受限，甚至死亡。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種組織工程化培養(yǎng)裝置，該裝置根據(jù)工程化組織培養(yǎng)對(duì)傳質(zhì)的要求而設(shè)計(jì)的。旋轉(zhuǎn)瓶和旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器緩和了內(nèi)部和外部的擴(kuò)散限制，但不能使培養(yǎng)液和其他營(yíng)養(yǎng)物滲透到支架材料的多孔網(wǎng)絡(luò)中去。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的灌注式生物反應(yīng)器通過(guò)削弱內(nèi)部和外部的擴(kuò)散限制，培養(yǎng)液不僅擴(kuò)散到每一個(gè)支架材料上，而且通過(guò)了它的每一個(gè)內(nèi)部結(jié)構(gòu)，增加了培養(yǎng)液完全通過(guò)支架時(shí)的擴(kuò)散能力。該裝置由三個(gè)部分組成培養(yǎng)室裝置、蠕動(dòng)泵和儲(chǔ)液容器，三部分間通過(guò)硅膠管相連，培養(yǎng)液通過(guò)蠕動(dòng)泵在整個(gè)裝置中進(jìn)行流動(dòng)。培養(yǎng)室裝置設(shè)置四個(gè)培養(yǎng)小室，種子細(xì)胞/支架復(fù)合體放置在培養(yǎng)小室中，通過(guò)蠕動(dòng)泵的作用使培養(yǎng)液擴(kuò)散通過(guò)培養(yǎng)的細(xì)胞/支架復(fù)合體，將氧氣和養(yǎng)料帶入支架，同時(shí)將其中細(xì)胞代謝產(chǎn)生的廢物帶出，改善傳質(zhì)效果，同時(shí)還可對(duì)支架中的細(xì)胞施加剪切力的作用，從而提高細(xì)胞的成活和工程化組織的發(fā)育水平，提高構(gòu)建復(fù)合物的厚度。不同大小的種子細(xì)胞/支架復(fù)合體均可在生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)。本發(fā)明裝置除可對(duì)預(yù)先成型的多孔支架進(jìn)行培養(yǎng)外，還可對(duì)液態(tài)材料為支架，如液態(tài)膠原等構(gòu)建復(fù)合體進(jìn)行灌注式培養(yǎng)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一 軟骨細(xì)胞調(diào)成5×107/ml細(xì)胞懸液，接種在用培養(yǎng)液預(yù)濕的PLGA上。12小時(shí)后將軟骨細(xì)胞/支架復(fù)合體置于灌注式生物反應(yīng)器卡式盒中(圖4)，加注培養(yǎng)液，旋緊壓緊螺栓(圖5)，蓋上頂蓋(圖3)，從頂蓋排氣口排掉裝置中殘留的氣體。整個(gè)裝置置于37℃、5％CO2孵箱中。調(diào)節(jié)流速，打開(kāi)蠕動(dòng)泵開(kāi)關(guān)進(jìn)行流體灌注。開(kāi)始時(shí)以較小的流速進(jìn)行液體灌注，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)流體灌注速度逐漸加大，以提高傳質(zhì)能力和對(duì)細(xì)胞給以流體剪切力刺激。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后，形成的組織厚度較常規(guī)培養(yǎng)增厚，細(xì)胞外基質(zhì)分泌增多(圖6)。
實(shí)施例二新分離的新生大鼠心室肌心肌細(xì)胞調(diào)成5×107/ml細(xì)胞懸液，接種在用培養(yǎng)液預(yù)濕的聚羥基丁酸酯支架上。12小時(shí)后將心肌細(xì)胞/支架復(fù)合體置于灌注式生物反應(yīng)器卡式盒中(圖4)，加注培養(yǎng)液，旋緊壓緊螺栓(圖5)，蓋上頂蓋(圖3)，從頂蓋排氣口排掉裝置中殘留的氣體。整個(gè)裝置置于37℃、5％CO2孵箱中。調(diào)節(jié)流速，打開(kāi)蠕動(dòng)泵開(kāi)關(guān)進(jìn)行流體灌注。開(kāi)始時(shí)以較小的流速進(jìn)行液體灌注，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)流體灌注速度逐漸加大，以提高傳質(zhì)能力和對(duì)細(xì)胞給以流體剪切力刺激。經(jīng)過(guò)灌注式培養(yǎng)，組織學(xué)檢測(cè)顯示細(xì)胞層數(shù)明顯增厚，透射電鏡觀察顯示心肌細(xì)胞的發(fā)育水平要比新生大鼠心肌的發(fā)育水平有所提高(圖7)。
實(shí)施例三液態(tài)I型膠原與2×DMEM(添加有20％胎牛血清)混合，形成的混合液與新分離的新生大鼠心室肌心肌細(xì)胞復(fù)合，加入特制的卡式盒中鑄膜成片狀復(fù)合物(圖4)，1小時(shí)后加注培養(yǎng)液，旋緊壓緊螺栓(圖5)，蓋上頂蓋(圖3)，從頂蓋排氣口排掉裝置中殘留的氣體。整個(gè)裝置置于37℃、5％CO2孵箱中。調(diào)節(jié)流速，打開(kāi)蠕動(dòng)泵開(kāi)關(guān)進(jìn)行流體灌注。灌注式培養(yǎng)14天，構(gòu)建的復(fù)合體形成一致跳動(dòng)，組織學(xué)檢測(cè)顯示細(xì)胞層數(shù)明顯增厚，透射電鏡觀察顯示心肌細(xì)胞的發(fā)育水平要比新生大鼠心肌細(xì)胞發(fā)育水平有所提高(圖8)。


圖1培養(yǎng)裝置底座圖2培養(yǎng)裝置密封圈圖3培養(yǎng)裝置頂蓋圖4培養(yǎng)裝置培養(yǎng)小室圖5培養(yǎng)裝置壓緊螺栓圖6軟骨細(xì)胞/PLGA復(fù)合物培養(yǎng)四周甲苯氨蘭染色。
圖A經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)，形成比較少的軟骨團(tuán)塊；圖B經(jīng)灌注式培養(yǎng)，形成較多的軟骨團(tuán)塊。圖7心肌細(xì)胞/膠原纖維膜復(fù)合物培養(yǎng)兩周H.E.染色。
圖A經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)，形成的心肌聚集體的細(xì)胞層數(shù)較??；圖B經(jīng)灌注式培養(yǎng)，形成的心肌細(xì)胞聚集體的細(xì)胞層數(shù)較厚。
圖8心肌細(xì)胞/膠原復(fù)合物培養(yǎng)兩周H.E.染色。
圖A經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)，心肌細(xì)胞束主要分布在材料的邊緣，且層數(shù)較?。粓DB經(jīng)灌注式培養(yǎng)，心機(jī)細(xì)胞比較均勻的分布在整個(gè)材料中，形成比較厚的組織樣結(jié)構(gòu)。
權(quán)利要求
1.一種組織工程構(gòu)建物體外培養(yǎng)裝置，可對(duì)構(gòu)建的種子細(xì)胞/支架材料復(fù)合物進(jìn)行灌注式培養(yǎng)，提高培養(yǎng)液通過(guò)支架材料時(shí)的擴(kuò)散能力。
2.權(quán)利要求1中所述的體外培養(yǎng)裝置由三個(gè)部分組成培養(yǎng)室裝置、儲(chǔ)液容器和蠕動(dòng)泵。三部分間通過(guò)硅膠管連接起來(lái)，蠕動(dòng)泵驅(qū)動(dòng)培養(yǎng)液在整個(gè)系統(tǒng)中循環(huán)流動(dòng)。
3.權(quán)利要求2中所述的培養(yǎng)室裝置使用的材料為有機(jī)玻璃、硅橡膠、聚苯乙烯和不銹鋼。整個(gè)裝置可進(jìn)行高壓消毒。
4.權(quán)利要求2中所述的培養(yǎng)室裝置的主要部件為培養(yǎng)小室，整個(gè)培養(yǎng)室裝置中共設(shè)置四個(gè)培養(yǎng)小室，可同時(shí)對(duì)四個(gè)復(fù)合體進(jìn)行同等條件的培養(yǎng)。
5.權(quán)利要求4中所述的培養(yǎng)小室由流動(dòng)腔、O-型密封圈、卡式盒和壓縮螺栓組成，培養(yǎng)小室的結(jié)構(gòu)保證培養(yǎng)液穿過(guò)復(fù)合體流動(dòng)。
6.權(quán)利要求1中所述的種子細(xì)胞/支架復(fù)合體可以被放置在權(quán)利要求5所述的卡式盒中， 根據(jù)復(fù)合體的不同大小可以選擇不同大小卡式盒。
7.選擇權(quán)利要求5中所述的卡式盒可以對(duì)用液態(tài)的支架材料構(gòu)建的復(fù)合體進(jìn)行灌注培養(yǎng)。將種子細(xì)胞/液態(tài)支架復(fù)合體澆鑄在卡式盒中鑄模成型再行培養(yǎng)。
8.權(quán)利2所述的蠕動(dòng)泵為單通道、可調(diào)速式，單口接入培養(yǎng)室裝置，對(duì)四個(gè)培養(yǎng)小室進(jìn)行同等的、可調(diào)速的灌注式培養(yǎng)。培養(yǎng)初期采用較低流速的培養(yǎng)，以后根據(jù)培養(yǎng)要求可采用較高流速的培養(yǎng)。
9.權(quán)利要求2中所述的儲(chǔ)液容器有三個(gè)接口，其中兩個(gè)接口分別接入進(jìn)液口、出液口，第三個(gè)接口作為與外界進(jìn)行氣體交換的進(jìn)出口。
10.權(quán)利要求9中所述的氣體進(jìn)出口與外界氣體可以通過(guò)一層過(guò)濾除菌膜進(jìn)行氣體交換。
全文摘要
本發(fā)明屬于組織工程領(lǐng)域，具體涉及一種灌注式生物反應(yīng)器。該裝置由蠕動(dòng)泵、流動(dòng)小室和儲(chǔ)液容器三部分組成，可對(duì)預(yù)先成型的和液態(tài)的生物材料為支架構(gòu)建的種子細(xì)胞/支架材料復(fù)合物進(jìn)行灌注式培養(yǎng)，提高培養(yǎng)液完全通過(guò)材料的擴(kuò)散能力，同時(shí)利用流體產(chǎn)生的剪切力對(duì)細(xì)胞進(jìn)行力學(xué)刺激。通過(guò)灌注式培養(yǎng)可提高構(gòu)建物組織形成的厚度和發(fā)育程度。
文檔編號(hào)C12N5/00GK1706936SQ20041004638
公開(kāi)日2005年12月14日 申請(qǐng)日期2004年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月8日
發(fā)明者王常勇, 郭希民, 趙云山, 段翠密, 董靈芝 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所