專利名稱：多功能抗癌重組腺病毒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于抗癌領域，描述一種多功能抗癌重組腺病毒。這種重組腺病毒能選擇性地在P53功能缺陷型和/或P53功能正常型的腫瘤細胞內復制、繁殖，高效表達外源性抗腫瘤蛋白，并殺死腫瘤細胞，而在非腫瘤細胞內基本上是非復制型的。本發(fā)明還提出了應用這種重組腺病毒治療、預防腫瘤的方法。
背景技術：
惡性腫瘤是嚴重危害人類健康與生命的常見多發(fā)病。全世界每年癌癥的新發(fā)病人數超過1000萬(癌癥患者人數超過4000萬)。癌癥已超過心腦血管疾病而成為人類致死的第一位原因。目前對惡性腫瘤的常規(guī)治療仍以手術，放療及化療為主，這種常規(guī)治療對極大多數腫瘤的治療效果很不理想。而對極大多數化療藥物而言，其治療指數仍較低，即其治療劑量與毒性劑量較為接近。故化療的治療方案通常伴有明顯的毒性作用，包括危及生命的骨髓抑制，脫發(fā)等。因此選擇性的殺傷腫瘤細胞而不影響正常細胞的治療方案對腫瘤治療非常重要。
腫瘤基因治療是近年興起的治療惡性腫瘤方案的一種新方法?；蜣D染方法可分為病毒法與非病毒法兩種。病毒法通常采用逆轉錄病毒，腺病毒，腺相關病毒，單純瘡疹病毒及痘病毒。逆轉錄病毒在體外具有較高的轉染率，但病毒滴度偏底，在體內轉染率較低，而且只能感染分裂期的細胞，同時具有整合至染色體內，存在癌變的可能性的缺點。非病毒法包括脂質體及基因槍等方法，其轉染基因表達時間較短，轉染率較低。
腺病毒是目前腫瘤基因治療中最常見的病毒載體，已廣泛地應用于人體的基因治療方案中，它在體內及體外均能有效轉染分裂及靜止細胞，無致癌性，并且有容易生產及純化的特點。腺病毒可以感染呼吸道，眼，胃腸道和膀胱，目前已鑒定出47個血清型。根據其血凝作用，對培養(yǎng)細胞的轉化和G+C百分比，可將人腺病毒分為7個類型。腺病毒基因組含有11個基因，其中E1區(qū)在早期基因合成中是非常重要的。研究表明腺病毒E1A蛋白具有抗腫瘤作用，它能抑制原癌基因如HER-2/neu，P27/kipi，P21/waf1/cip1，P15/INK41等的轉錄，還能將腫瘤細胞變化為上皮類細胞，并防止腫瘤細胞轉移。E1A基因還能增加腫瘤細胞對DNA損傷制劑，如化療，放療的敏感性，并能誘導腫瘤細胞產生依賴或非依賴p53狀況的細胞凋亡效應。E1B 19K蛋白是一類超強的細胞凋亡抑制劑，能抑制Bax，Bak，Nbk/Bik，Fas，腫瘤壞死因子受體，腺病毒E1A，P53和TNF等所誘導的細胞凋亡效應，還能降低腺病毒E1A蛋白在細胞內的表達量。E1B 55k蛋白可結合P53腫瘤抑制蛋白，螯合或滅活P53蛋白。正常情況下，腺病毒主要在細胞內有效復制，E1B區(qū)基因編碼合成55K蛋白可與宿主細胞中的P53蛋白結合，并使其失活從而阻止細胞凋亡的發(fā)生，使腺病毒得以復制。
美國專利5677178，Bischoff，J.R等，科學(Science)，274卷，373-376頁(1996)及Heise，C等，自然醫(yī)學(Nature Medicine)3卷，639-645頁(1997)報道了應用E1B 55K突變腺病毒(d1 1520)，也稱ONYX 015對腫瘤細胞的選擇性殺傷作用為一類新型的抗腫瘤療法。腺病毒E1B區(qū)基因編碼合成55K蛋白可與宿主細胞中的P53蛋白結合，使其失活而阻止細胞凋亡的發(fā)生，并使病毒得以復制。由于d11520或ONYX 015缺失功能性55kd蛋白，因此該腺病毒突變體能在p53功能缺陷型的腫瘤細胞內自我復制，繁殖，導致腫瘤細胞裂解或凋亡。而在正常細胞中卻不能自我復制，因此正常細胞與組織并不受影響。
目前ONYX-015在美國已進入III期臨床，并取得了一定療效。然而作為一類抗腫瘤新藥，ONYX-015存在著以下幾個問題第一，ONYX-015的抗腫瘤效果不夠理想。由于ONYX-015缺乏E1B 55K蛋白，從而極大地降低了腺病毒在腫瘤細胞內的復制能力，它在腫瘤細胞內的復制能力只有野生型腺病毒的10％左右，它對淺部腫瘤如頭頸癌有一定療效，而對深部腫瘤如肝癌，胰腺癌療效不佳。第二，ONYX-015對P53基因突變型的腫瘤有一定殺傷效力，但對p53基因正常型的腫瘤療效不佳。目前已知50％左右的腫瘤是p53基因缺陷型，另外50％左右的腫瘤是p53基因正常型，由此可預測，ONYX-015對大約50％左右的腫瘤沒有療效。第三，ONYX-015的臨床結果表明單獨使用ONYX-015很難治愈腫瘤，ONYX-015必須與化療藥物聯用，才能有較好的抗腫瘤療效。但聯合用藥會增加化療藥物的毒副反應，如骨髓抑制、脫發(fā)等，給病人增加許多不必要痛苦。因此發(fā)展新一代的重組腺病毒，具有超強的、多功能抗癌效應，并對P53基因缺陷型或p53基因正常型的腫瘤均有較強的殺傷力是非常必要的。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種多功能抗癌重組腺病毒，其特征在于這種重組腺病毒滅活能夠與細胞內功能性腫瘤抑制蛋白p53結合的E1B 55K病毒蛋白，并攜帶兩組外源性基因，在兩組外源性基因之間由內部核糖體進入位點(IRES)有效連接，因此兩組外源性基因能被共轉錄成一條mRNA鏈，并由內部核糖體進入位點控制第二組外源性基因的翻譯。本發(fā)明所提供的重組腺病毒能夠在P53功能缺陷型和/或P53功能正常型的腫瘤細胞內大量復制繁殖，產生細胞致病效應(CPE)，并能在腫瘤細胞內高效表達外源性蛋白，最終殺死腫瘤細胞，而對P53功能正常型的非腫瘤細胞基本無殺傷作用。另外，這種腺病毒攜帶的E3基因能增加腺病毒進入宿主體內的最大耐受劑量，降低病毒對宿主所產生的毒副反應。因此，此新型重組腺病毒的抗癌效應和安全性均優(yōu)于現有技術改進的重組腺病毒。
本發(fā)明所述的重組腺病毒優(yōu)選地通過缺失突變滅活該病毒的E1B55K蛋白，缺失部分包括E1B啟動子序列，E1B 55K基因序列，缺失部分也可為E1B 55K基因序列，但保留E1B啟動子序列。重組腺病毒也可通過定點突變，和/或插入突變，和/或移碼突變滅活該病毒的E1B 55K蛋白。
另一方面，本發(fā)明所述重組腺病毒所攜帶的兩組外源性基因，它們所編碼的蛋白優(yōu)選地為一個細胞因子與一個自殺基因產物，包括但不限于粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，美國專利5393870或5391485；白介素2，美國專利4738927或5641665；白介素7，美國專利4965195或5328988，白介素12，美國專利5457038，α-腫瘤壞死因子，美國專利677063或5773582，γ-干擾素，美國專利4727138或4762791，單純皰疹病毒胸苷激酶基因產物(HSV-TK)和胞嘧啶脫氨基酶基因產物(cytocine deaminase，CD)，美國專利5358866和5677178，或為兩個細胞因子，或為兩個細胞自殺基因產物。重組腺病毒所攜帶的兩組外源性基因所編碼的蛋白也可為一個細胞因子與一個細胞周期調控蛋白，或為一個細胞因子與一個細胞凋亡誘導蛋白。
本發(fā)明所述重組腺病毒所攜帶的兩組外源性基因，其中第一組外源性基因由外源性啟動子，或內源性腺病毒啟動子所驅動，優(yōu)選的外源性啟動子為病毒類啟動子，例如CMV早期啟動子，SV40啟動子；外源性基因也可由組織特異性啟動子，例如前列腺特殊抗原啟動子(美國專利5648478)驅動；優(yōu)選的內源性腺病毒啟動子為內源性E1B啟動子。第二組外源性基因由內部核糖體進入位點控制翻譯，并在第二組外源性基因下游任選地含有外源性聚腺苷酸結構。
另一方面，本發(fā)明所述的重組腺病毒，其中所述內部核糖體進入位點序列有效連接兩組外源性基因，并控制第二組外源性基因的翻譯。內部核糖體進入位點序列優(yōu)選地選自腦心肌炎病毒(EMCV)，和/或微管內皮生長因子(VEGF)，和/或免疫球蛋白鏈結合蛋白(BiP)，和/或纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor2)，和/或丙型肝炎病毒(HCV)基因組。
另一方面，本發(fā)明所述的重組腺病毒，其中所述外源性基因可優(yōu)選地插入到腺病毒E1B部位，例如E1B基因缺失突變，和/或定點突變，和/或插入突變，和/或移碼突變部位，外源性基因也可插入到腺病毒E1A部位，和/或腺病毒E2部位，和/或腺病毒E3部位，和/或腺病毒E4部位。
另一方面，本發(fā)明所述的重組腺病毒含有E3基因。E3基因產物能增加腺病毒進入宿主體內的最大耐受劑量，并降低病毒對宿主所產生的毒副反應。
本發(fā)明還提供了另一種多功能抗癌重組腺病毒，其特征在于該病毒同時滅活能夠與細胞內功能性腫瘤抑制蛋白p53結合的E1B 55K病毒蛋白和能夠抑制細胞凋亡的E1B 19K病毒蛋白，并任選地攜帶一組由外源性啟動子所驅動的外源性基因。這種重組腺病毒能在P53功能缺陷型或P53功能正常型的腫瘤細胞內大量復制繁殖，產生細胞致病效應(CPE)，并在腫瘤細胞內高效表達外源性蛋白，最終殺死腫瘤細胞，而對P53功能正常型的非腫瘤細胞基本無殺傷作用。
這種重組腺病毒優(yōu)選地通過缺失突變滅活該病毒的E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白，缺失突變部分包括E1B啟動子序列，E1B 19k基因序列和E1B 55K基因序列。這種重組腺病毒也能通過定點突變，和/或插入突變，和/或移碼突變滅活E1B 19K和E1B 55K蛋白。
另一方面，這種重組腺病毒攜帶的外源性基因所編碼的蛋白優(yōu)選地為細胞因子，包括但不限于粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)；美國專利5393870或5391485；白介素2，美國專利4738927或5641665；白介素7，美國專利4965195或5328988；白介素12，美國專利5457038；α-腫瘤壞死因子，美國專利677063或5773582；γ-干擾素，美國專利4727138或4762791，或為細胞自殺基因產物，包括但不限于單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)和胞嘧啶脫氨基酶基因(cytocine deaminase，CD)，美國專利編號5358866和5677178，或為細胞周期調控蛋白，包括但不限于p16，Arapet等，癌癥研究，551351-1354，1995，細胞凋亡誘導蛋白，包括但不限于腫瘤抑制蛋白P53，Casey等，原癌基因，61791-1797，1991。
外源性基因優(yōu)選地由外源性病毒類啟動子，例如CMV早期啟動子，SV40早期啟動子所驅動，外源性基因優(yōu)選地插入到腺病毒E1B部位，例如E1B基因缺失突變，和/或定點突變，和/或插入突變，和/或移碼突變部位。外源性基因也可插入到腺病毒E1A部位，和/或腺病毒E2部位，和/或腺病毒E3部位，和/或腺病毒E4部位。
另一方面，這種重組腺病毒含有E3基因。E3基因產物能增加腺病毒進入宿主體內的最高耐受劑量，并降低病毒對宿主所產生的毒副反應。
本發(fā)明的另一目的是提供選擇性殺死腫瘤細胞的方法。該方法包括在感染的條件下，將殺死腫瘤有效量的重組腺病毒與含有腫瘤細胞的細胞種群接觸，由此產生感染的細胞群，并在感染的細胞種群內高效表達外源性抗腫瘤蛋白，最終殺死感染的腫瘤細胞。所述病毒不能編碼E1B19K蛋白和/或E1B 55K蛋白，并可進一步包含一組，兩組，或兩組以上的外源性基因。
另一方面，本發(fā)明提供含有該重組腺病毒和化療藥物的藥物組合物。


圖1示出了重組腺病毒E1區(qū)基因圖譜，其中，1.野生型腺病毒；2.重組腺病毒△1651；3.重組腺病毒△1714；4.重組腺病毒△1651/GM-CSF；5.重組腺病毒△1714/GM-CSF；6.重組腺病毒△1651/TK；7.重組腺病毒△1714/TK；8.重組腺病毒△1651/GM-CSF/TK；9.重組腺病毒△1714/GM-CSF/TK；10.重組腺病毒△2251/GM-CSF/TK。
圖2是重組腺病毒高效GM-CSF。
圖3示出了藥物前體GCV能加強重組腺病毒對肝癌細胞的致病效應。
圖4示出了重緩腺病毒在疥列腺癌動物模型中的藥效實驗。
圖5示出了藥物前體GCV和重組腺病毒和藥效實驗。
具體實施例方式
本發(fā)明使用的專用術語名稱以及下述細胞培養(yǎng)、分子遺傳學和分子病毒學的實驗室步驟，都是本領域中為人熟知和常用的。核酸重組、多核苷酸合成、病毒毒株的構建、生產與增殖(包括能夠反式互補重組缺陷型病毒原種的細胞株)、細胞培養(yǎng)等均按照標準技術進行。一般技術及步驟均按照本領域的常規(guī)方法，并參照綜合性參考文獻分子克隆實驗手冊，第二版，Sambrook等編著(1989)冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約；病毒學，第二版，Fields BN與Knipe DM編著(1990)RAVEN出版社，紐約。酶切反應，DNA純化步驟及克隆等均根據生產廠家的說明書進行。
除非有另外不同的定義，本文所使用的技術和科學術語與本發(fā)明所屬領域一般技術人員通常所理解的一樣，任何與本文描述相似或相同的方法及材料均可用于本發(fā)明的實施例或實驗。本文對以下術語予以定義，并對本發(fā)明中的優(yōu)選方法和材料加以描述。
重組腺病毒這一術語指經人類DNA重組技術有意修飾后所產生的新的腺病毒基因組。本發(fā)明中的重組腺病毒優(yōu)選地選自人類腺病毒2型或者5型。最優(yōu)選的腺病毒選自人類腺病毒5型，也包括腺病毒2型和5型的嵌合體。
多功能抗癌重組腺病毒這一術語指這種重組腺病毒具有兩種或兩種以上的抗癌功能。例如本發(fā)明中的重組腺病毒除了腺病毒本身對腫瘤細胞的直接溶癌作用外，重組腺病毒所攜帶的一組，或兩組，或兩組以上的外源性抗腫瘤基因，能選擇性地在腫瘤細胞內高效表達，進一步加強了腺病毒的抗腫瘤效果。本發(fā)明中的重組腺病毒所攜帶的外源性基因所編碼的蛋白優(yōu)選地為細胞因子和細胞自殺基因產物。
外源性基因這一術語是指一段不同于腺病毒基因組的多核苷酸序列。外源性基因可以編碼，也可不編碼蛋白質。本發(fā)明中的外源性基因所編碼的蛋白質通常具有抗腫瘤效應，優(yōu)選的外源性基因所編碼的蛋白為免疫細胞因子，細胞自殺基因產物，細胞周期調控蛋白或細胞凋亡誘導蛋白。
有效地連接這一術語指多核苷酸元件以功能性關系連接。例如，一個啟動子或增強子如果影響某一段基因序列的轉錄，它就是有效地與這段基因序列相連接。有效地連接所指的DNA序列通常是鄰接連接的。然而，增強子通常與啟動子相隔幾千個堿基對而發(fā)揮功能，因此某些核苷酸元件雖不鄰接，但可以是有效地連接。
內部核糖體進入位點(internal ribosome entry site or IRES)這一術語是指一段多核苷酸序列，它能夠促使內部核糖體進入到蛋白質啟始密碼ATG位點，并引導帽獨立的蛋白翻譯過程。參照Jackson RJ等生物研究趨勢(Trends Biochem Sci)，15(12)477～83，1990和Jackson RJ等RNA1(10)985～1000，1995。本發(fā)明中的內部核糖體進入位點序列包括任何能夠促進內部核糖體進入到蛋白質啟始密碼ATG，并引導帽獨立的蛋白翻譯的多核苷酸序列。本發(fā)明中的內部核糖體進入位點優(yōu)選地選自腦心肌炎病毒(EMCV)，微管內皮生長因子(VEGF)，免疫球蛋白重鏈結合蛋白(Bip)，纖維細胞生長因子2，和丙型肝炎病毒(HCV)。
P53功能正常型這一術語是指細胞內由P53基因編碼的多肽水平基本正常。P53多肽能夠結合野生型腺病毒2或5的E1B 55K蛋白。P53功能缺陷型是指通過突變，或通過P53表達量的減少或完全消失而導致細胞內功能型P53蛋白的缺失。另外，P53蛋白功能型缺陷也可以通過P53基因以外的遺傳物質的改變，如通過P53亞細胞加工或定位異常的突變而導致P53功能的缺陷。
E1B啟動子序列是指腺病毒基因組從1636至1701的多核苷酸序列，其中包括SP1結和位點和TATA盒序列。腺病毒E1B 19K和E1B 55K序列是指腺病毒基因組從1715至3509的多核苷酸序列。
滅活E1B 55K蛋白是指通過DNA重組技術修飾后使E1B 55K蛋白失去了與P53蛋白結合或滅活P53基因轉錄活性的能力。滅活E1B 55K蛋白可以通過缺失突變消除E1B 55K蛋白與P53蛋白的結合位點，也可通過定點突變、或插入突變、或移碼突變滅活E1B 55K蛋白活性。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，重組腺病毒通過缺失突變切除腺病毒基因組2251至3509的多核苷酸序列以滅活E1B 55K蛋白。
同時滅活E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白是指通過DNA重組技術修飾后使腺病毒的E1B 55K蛋白失去了與P53蛋白結合或滅活P53基因轉錄活性的能力，同時也使E1B 19K蛋白失去了能夠抑制細胞凋亡的能力。重組腺病毒可以通過缺失突變，和/或定點突變，和/或插入突變，和/或移碼突變滅活E1B 55K蛋白和E1B 19K蛋白活性。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方法中，重組腺病毒通過缺失突變切除腺病毒基因組1651至2591多核苷酸序列，包括E1B啟動子序列，E1B 19K基因序列和5′端E1B 55K基因序列，并插入多核苷酸GGTTAATTCCGCTCGAACGG序列，以滅活E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白。在本發(fā)明的另一實施方案中，重組腺病毒通過缺失腺病毒基因組1714至2591多核苷酸序列，包括E1B 19K基因序列和5′端E1B 55K基因序列，并插入多核苷酸GGTTAATTAACCGCTCGAGCGG序列，以滅活E1B 19K蛋白和E1B55K蛋白。
外源性啟動子是指一段不同于腺病毒基因組的DNA序列，這種DNA序列能調控與其有效連接的另一段基因組的轉錄與翻譯。本發(fā)明中的外源性啟動子包括但不限于病毒類啟動子，如CMV早期啟動子，SV40啟動子，細胞內啟動子，如α-延長因子啟動子，組織特異性啟動子，如平滑肌特異性啟動子，胰臟特異性啟動子，Palmite等(1987)細胞50435；肝臟特異性啟動子Rovet等(1992)生物化學雜志(J.Biol.Chem)，26720765，Lemaigne等(1993)生物化學雜志(J.Biol.Chem)，26819896，前列腺特異性啟動子(美國專利5,698,443)；腫瘤特異性啟動子，如甲胎蛋白啟動子，胳氨酸酶啟動子。腫瘤特異性啟動子在腫瘤細胞內呈激活狀態(tài)，而在非腫瘤細胞內呈非激活狀態(tài)?？烧T導型啟動子是指在化學刺激或溫度改變等外來刺激情況下，啟動子呈激活狀態(tài)，并能調控與其功能性相連的基因組的轉錄與翻譯。參照Yoshida和Hamada(1997)生化與生物物理研究通訊(Biochem Biophys Res Comm)，230426～430；Iida等(1996)病毒學雜志(J Virol)，70(9)6054～6059；Hwang等(1997)病毒學雜志(J Virol)，71(9)7128～7131；Lee等(1997)分子細胞生物學(Mol Cell Biol)17(9)5097～5105?？烧T導型啟動子包括X光誘導型啟動子如XRE啟動子[Boothman等放射學研究(Radiation Reseach)138(增訂刊1)S68～71]，UV誘導型啟動子[Garnier和Cole，(1998)分子微生物學(Mol Microbiol)，2607～614]。本發(fā)明優(yōu)選的外源型啟動子為病毒類啟動子如CMV早期啟動子，或組織特異啟動子，如前列腺特異性啟動子。
內源性腺病毒啟動子是指一段來源于腺病毒基因組的DNA序列，它能調控與其有效連接的另一組DNA序列的轉錄與翻譯。內源性腺病毒啟動子包括早期啟動子E1A啟動子、E1B啟動子、E3啟動子、E4啟動子和主要晚期啟動子。本發(fā)明優(yōu)選的內源性腺病毒啟動子是內源性E1B啟動子。
多功能抗癌重組腺病毒的構建本發(fā)明提供了一種多功能抗癌重組腺病毒，這種腺病毒同時滅活能夠與細胞內功能性腫瘤抑制蛋白p53結合的E1B 55K病毒蛋白和能夠抑制細胞凋亡的E1B 19K病毒蛋白，但攜帶兩組編碼抗腫瘤蛋白的外源性基因，并通過內部核糖體進入位點(IRES)有效地連接，因此這兩組外源性基因能被共轉錄成一條mRNA鏈，并由內部核糖體進入位點控制第二組外源性基因的翻譯。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，重組腺病毒通過缺失突變滅活E1B19K蛋白和E1B 55K蛋白。缺失部分包括E1B啟動子序列，E1B 19K基因序列和E1B 55K基因序列，并在E1B基因缺失突變部位插入新的酶切位點。通過新的酶切位點，該重組腺病毒能攜帶一組，或兩組，或兩組以上的外源性基因。
為了獲得上述重組腺病毒，首先優(yōu)選地以pXC-1質粒(從MicrobixBiosystems公司購得)作為啟始材料，構建缺失E1B基因的腺病毒左端質粒。有關質粒pXC-1的資料可以參照由Microbix Biosytems出版的“Gene Transfer with Adenovirus Vectors”一文。除了質粒pXC-1外，任何從pXC-1衍生出來的腺病毒左端質粒，或任何含有腺病毒5’端反向末端重復序列(ITR)、腺病毒包裝信號，E1A增強子、啟動子、和聚腺苷酸信號以及來自于腺病毒基因組的一段DNA片段所組成的腺病毒載體均可用于構建本發(fā)明所述的重組腺病毒。
為了構建缺失E1B 19K基因和55K基因的腺病毒左端質粒，采用PCR方法從質粒pXC-1上優(yōu)選地切除nt1651至2591的DNA序列。并在缺失突變部位插入新的酶切位點PacI和XhoI，獲得新的質粒pXC-Δ1651。質粒pXC-Δ1651缺失內源性E1B啟動子序列，并同時滅活E1B19K蛋白和E1B 55K蛋白。E1B基因缺失部分也可包括nt1636至3509之間的任意一段DNA序列，并通過此缺失突變同時滅活腺病毒E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白。
質粒pXC-Δ1651能攜帶一組，或兩組，或兩組以上的外源性基因。優(yōu)選外源性基因所編碼的抗腫瘤蛋白為免疫細胞因子，例如粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，美國專利5393870或5391485，白介素2，美國專利4738927或5641665，白介素7，美國專利4965195或5328988，白介素12，美國專利5457038，α-腫瘤壞死因子，美國專利677063或5773582，γ-干擾素，美國專利4727138或4762791；細胞自殺基因產物，例如單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)和胞嘧啶脫氨基酶基因(cytocine deaminase，CD)，美國專利5358866和5677178；細胞周期調控蛋白，例如P16，Arapet等，癌癥研究，551351-1354，1995；細胞凋亡誘導蛋白，例如腫瘤抑制蛋白P53，Casey等，原癌基因，61791-1797，1991。優(yōu)選的兩組外源性基因所編碼的蛋白分別為一個細胞因子與一個自殺基因產物，兩個細胞因子，兩個細胞自殺基因產物，一個細胞因子與一個細胞周期調控蛋白，一個細胞因子與一個細胞凋亡誘導蛋白，或上述蛋白的任意組合。
用于控制上述外源性基因轉錄和表達的啟動子為外源性啟動子，優(yōu)選地為外源性病毒類啟動子，如CMV早期啟動子。然而組織特異性啟動子如前列腺特殊抗原啟動子也可用于控制外源性基因的轉錄與表達。
上述重組腺病毒載體所攜帶的兩組或兩組以上外源性基因優(yōu)選地通過內部核糖體進入位點有效地連接。內部核糖體進入位點是一段特殊的DNA序列，它能通過啟始密碼(通常為AUG)，啟動一段含有雙基因或多基因(編碼兩組或多組蛋白質)的RNA轉錄體的翻譯過程。因此通過內部核糖體進入位點有效連接的兩組或多組基因組能被共轉錄成一條mRNA鏈，并通過內部核糖體進入位點控制雙基因或多組基因的翻譯。本發(fā)明所述的重組腺病毒，其中所包含的內部核糖體進入位點優(yōu)選地選自腦心肌炎病毒(EMCV)，微管內皮生長因子(VEGF)，免疫球蛋白鏈結合蛋白(BiP)，纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor2)和丙型肝炎病毒(HCV)基因組。
在本發(fā)明的另一實施方案中，重組腺病毒通過缺失突變同時滅活E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白。缺失部分為E1B 19K基因序列和E1B 55K基因序列，但保留E1B啟動子序列，并在E1B基因缺失突變部位插入新的酶切位點。通過新的酶切位點，該病毒能任選地攜帶一組，或兩組，或兩組以上的外源性基因。
為了獲得上述重組腺病毒，優(yōu)選地以質粒pXC-1作為啟始材料，構建缺失E1B 19K和55K基因的腺病毒左端質粒pXC-Δ1714。pXC-Δ1714缺失nt1714-2591的DNA序列，缺失部分為E1B 19K基因序列和E1B 55K基因序列，但保留E1B啟動子序列，并在E1B基因缺失突變部位插入新的酶切位點PacI和XhoI。質粒pXC-Δ1714還能攜帶一組，或兩組，或兩組以上的外源性基因。優(yōu)選外源性基因所編碼的抗腫瘤蛋白為免疫細胞因子，例如粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，美國專利5393870或5391485，白介素2，美國專利4738927或5641665，白介素7，美國專利4965195或5328988，白介素12，美國專利5457038，α-腫瘤壞死因子，美國專利677063或5773582，γ-干擾素，美國專利4727138或4762791，細胞自殺基因產物，例如單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)和胞嘧啶脫氨基酶基因(cytocine deaminase，CD)，美國專利5358866和5677178，細胞周期調控蛋白，例如P16，Arapet等，癌癥研究，551351-1354，1995，細胞凋亡誘導蛋白，例如腫瘤抑制蛋白P53，Casey等，原癌基因，61791-1797，1991。優(yōu)選的兩組外源性基因所編碼的蛋白分別為一個細胞因子與一個自殺基因產物，兩個細胞因子，兩個細胞自殺基因產物， 一個細胞因子與一個細胞周期調控蛋白，一個細胞因子與一個細胞凋亡誘導蛋白，或上述蛋白的任意組合。
用于控制上述外源性基因轉錄與表達的啟動子為外源性啟動子，優(yōu)選地啟動子為外源性病毒類啟動子，例如CMV早期啟動子。然而組織特異性啟動子，例如前列腺特殊抗原啟動子，或內源性腺病毒啟動子，如內源性E1B啟動子可用于控制上述重組腺病毒攜帶的兩組，或兩組以上外源性基因的轉錄與表達。在外源性基因之間由內部核糖體進入位點序列(IRES)有效連接，內部核糖體進入位點優(yōu)選地選自腦心肌炎病毒(EMCV)，微管內皮生長因子(VEGF)，免疫球蛋白鏈結合蛋白(BiP)，纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor2)和丙型肝炎病毒(HCV)基因組。
內源性E1B啟動子位于腺病毒基因組nt1636至1701，含有與SP1具有高度親和力的結合位點和TATA盒。E1B啟動子能調控至少4條mRNA的轉錄，包括22S、14.5S、14S和13S，其中22S和13S編碼兩組最主要的E1B蛋白-E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白。由于E1B啟動子調控腺病毒早期蛋白的合成，當腺病毒進入感染晚期時，E1B啟動子的活性被抑制，主要晚期啟動子的活性被激活，晚期蛋白如腺病毒殼蛋白和其他結構蛋白的表達量大幅增加。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，腺病毒內源性E1B啟動子序列，E1B 19K基因和E1B 55K基因被切除，由外源性超強啟動子如CMV早期啟動子調控的外源性基因被插入到E1B基因缺失突變部分，這樣在CMV早期啟動子調控下，外源性基因能在腫瘤細胞內持續(xù)高效地表達抗腫瘤蛋白，極大地了加強抗腫瘤效應。在本發(fā)明的另一個實施方案中，腺病毒的內源性E1B啟動子序列被保留，E1B 19K基因和E1B 55K基因被切除，外源性基因被插入到E1B基因缺失突變部位，并由外源性病毒類啟動子如CMV早期啟動子調控外源性基因的轉錄與表達。然而，由于E1B啟動子序列與CMV早期啟動子序列相鄰連接，兩者之間有可能互相作用而影響或降低外源性基因的轉錄與表達。外源性抗腫瘤蛋白基因也可由內源性E1B啟動子調控，然而當腺病毒進入感染晚期時，E1B啟動子的活性被仰制，外源性抗腫瘤蛋白的表達量會明顯降低從而影響其抗腫瘤效應。
內部核糖體進入位點能將兩組或兩組以上編碼蛋白的基因組有效連接，通過內部核糖體進入位點將這些基因組共轉錄成一條mRNA鏈，并在翻譯水平上控制基因組所編碼蛋白的表達。目前已知腫瘤的發(fā)生、演變過程是一個十分復雜的過程，需要多種因素，通過多種途徑同時作用才能將正常細胞轉化為腫細胞。單一療法，如化療，或放療很難治愈腫瘤。而許多抗癌藥物具有協(xié)同抗腫瘤效應，聯合用藥已成為腫瘤治療的一種趨勢。目前已知許多抗腫瘤蛋白具有協(xié)同抗腫瘤效應，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，重組腺病毒所攜帶的兩組或兩組以上抗腫瘤蛋白基因通過內部核糖體進入位點有效連接，因此，兩組或兩組以上抗腫瘤蛋白能同時在同一腫瘤細胞內高效、持續(xù)表達，加上重組腺病毒本身的直接溶癌作用，這樣可極大地加強了抗腫瘤效應。
外源性基因表達盒包括外源性啟動子序列和外源性基因序列(包含一組，或兩組，或兩組以上的外源性基因，通過內部核糖體進入位點有效相連)，并任選地含有外源性聚腺苷酸信號，可優(yōu)選地連接到腺病毒E1B部位，例如E1B基因缺失突變，或定點突變，或移碼突變部位。然而外源性基因表達盒也能插入到腺病毒E1A部位，或E3部位，或E4部位。
優(yōu)選的外源性抗腫瘤基因為粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)基因，或HSV-TK基因。它們分別通過PacI位點被插入到pXC-Δ1651或pXC-Δ1714腺病毒載體上，獲得新的、含有外源性基因的腺病毒左端載體pXC-Δ1651/GM-CSF，pXC-Δ1714/GM-CSF，pXC-Δ1651/TK或pXC-Δ1714/TK。優(yōu)選的兩組外源性抗腫瘤基因為粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)與TK基因。它們通過內部核糖體進入位點序列有效連接，并被分別插入到pXC-Δ1651或pXC-Δ1714腺病毒左端載體，獲得新的、含有兩組外源性基因的腺病毒左端載體pXC-Δ1651/GM-CSF/TK和pXC-Δ1714/GM-CSF/TK。
本發(fā)明還提供了另一種多功能抗癌重組腺病毒，這種腺病毒滅活能夠與細胞內功能性腫瘤抑制蛋白p53結合的E1B 55K病毒蛋白，但攜帶兩組編碼抗腫瘤蛋白的外源性基因，并由內部核糖體進入位點(IRES)有效連接這兩組外源性基因，因此兩組外源性基因能被共轉錄成一條mRNA鏈，并由內部核糖體進入位點控制第二組外源性基因的翻譯。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，這種重組腺病毒通過缺失突變滅活E1B 55K蛋白。缺失部分為nt2251至3509 DNA序列，并在E1B 55K基因缺失突變部位插入新的酶切位點。通過此新的酶切位點，該重組腺病毒能攜帶兩組，或兩組以上編碼抗腫瘤蛋白的外源性基因。
為了獲得上述重組腺病毒，優(yōu)選地以質粒pXC-1作為啟始材料，通過PCR技術構建缺失E1B 55K基因的腺病毒左端質粒pXC-Δ2251，pXC-Δ2251缺失nt2251至3509的DNA序列，并在E1B 55K基因缺失突變部位插入新的酶切位點PacI和XhoI。質粒pXC-Δ2251能攜帶兩組，或兩組以上的外源性基因。優(yōu)選的兩組外源性基因所編碼的蛋白分別為一個細胞因子與一個自殺基因產物，兩個細胞因子，兩個細胞自殺基因產物，一個細胞因子與一個細胞周期調控蛋白，一個細胞因子與一個細胞凋亡誘導蛋白，或上述蛋白的任意組合。用于控制上述外源性基因轉錄與表達的優(yōu)選啟動子為外源性病毒類啟動子，例如CMV早期啟動子。然而組織特異性啟動子，例如前列腺特殊抗原啟動子也可用于控制上述外源性基因的轉錄與表達。在外源性基因之間優(yōu)選地由內部核糖體進入位點序列(IRES)有效相連。因此外源性基因能被共轉錄成一條mRNA鏈，并由內部核糖體進入位點控制第二組外源性基因的翻譯。
優(yōu)選的兩組外源性抗腫瘤基因為粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)與TK基因。它們通過內部核糖體進入位點序列有效連接，并被分別插入到pXC-Δ2251的PacI位點，獲得新的、含有兩組外源性基因的腺病毒左端載體pXC-Δ2251/GM-CSF/TK。
為了獲得相應的重組腺病毒，上述重組腺病毒左端載體與含有E3區(qū)基因的腺病毒右端載體共轉染293細胞，通過同源重組方式獲得新的重組腺病毒Δ1651，Δ1714，Δ1651/GM-CSF，Δ1714/GM-CSF，Δ1651/TK，Δ1714/TK，Δ1651/GM-CSF/TK，Δ1714/GM-CSF/TK，Δ2251/GM-CSF/TK。優(yōu)選的腺病毒右端載體為pBHGE3質粒，也可為含有E3區(qū)基因的感染性腺病毒顆粒。腺病毒右端載體也可為不含E3區(qū)基因的pBGH10或pBGH11質粒，或從這些質粒衍生出來的類似質粒。有關腺病毒質粒的資料及它們的應用，參考Hitt，Construction andPropagation of Human Adenovirus Vectors，InCell BiologyA LaboratoryHandbook，J.Celis，Academic Press，NY，1995，或參考Graham，Adenovirus Based Expression Vectors and Recombinant Vaccines，InVaccinesNew Approaches to Immunological Problems，R.W.Eliss，Butterworth，pp363-390，1992。
為了證實本發(fā)明中所述重組腺病毒的抗腫瘤效果，首先進行細胞水平的實驗，比較野生型腺病毒、重組腺病毒Δ1651，Δ1651/GM-CSF、Δ1651/TK、Δ1651/GM-CSF/TK、Δ1714，Δ1714/GM-CSF，Δ1714/TK，和1714/GM-CSF/TK在正常細胞--微管內皮細胞(MVEC)，宮頸癌細胞株C33A、肝癌細胞株HeP3B和前列腺癌細胞株LNCaP中的復制能力。實驗步驟和結果參考實施例4。本發(fā)明還通過比較野生型腺病毒與重組腺病毒Δ1651，Δ1651/GM-CSF對各種正常細胞、P53缺陷型和P53正常型腫瘤細胞株所產生的細胞致病效應(CPE)來評估重組腺病毒對腫瘤細胞的選擇性殺傷作用，參見實施例5。此外，含有一組或兩組外源性抗腫瘤蛋白基因的重組腺病毒Δ1651/GM-CSF、Δ1651/TK、Δ1651/GM-CSF/TK，Δ2251/GM-CSF/TK能選擇性地在腫瘤細胞內高效表達抗腫瘤蛋白，參見實施例6、7和附圖2、3。
除了細胞水平的實驗外，本發(fā)明還通過動物腫瘤模型來進一步證實本發(fā)明所提供的重組腺病毒的抗癌效應，參見實施例8、9、10和附圖4、5。
由實施例4、5所見，同時滅活E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白的重組腺病毒，能選擇性地在P53功能正常型和/或P53正常缺陷型的腫瘤細胞內復制、繁殖，產生細胞病變效應，并殺死腫瘤細胞，它們在腫瘤細胞內的復制能力超過了野生型腺病毒，而對正常細胞基本上無殺傷作用。重組腺病毒Δ1651/GM-CSF，Δ1651/GM-CSF/TK除了能選擇性地在P53缺陷型和/或P53功能正常型的腫瘤細胞內復制、繁殖，還能在腫瘤細胞內高效表達粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，參照實施例6和附圖2，進而誘導效應細胞產生腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞和非特異性抗腫瘤免疫反應而進一步加強殺傷腫瘤的效應。有關粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的資料可從本領域中各種不同來源獲得。重組腺病毒Δ1651/TK和Δ1651/GM-CSF/TK除了能選擇性地殺傷P53功能正常型和/或P53功能缺陷型的腫瘤細胞，還能在腫瘤細胞內高效表達HSV-TK基因產物，參照實施例7和附圖3。HSV-TK基因產物對細胞沒有直接毒性，然而，當細胞群接觸到一種藥物前體無環(huán)鳥苷(GCV)或FIAU時，在腫瘤細胞內高效表達的TK基因產物能將藥物前體無環(huán)鳥苷(GCV)轉化成有毒藥物二，三磷酸核苷，并將腫瘤細胞選擇性的消除，因此極大的增強了重組腺病毒的抗腫瘤作用。有關藥物前體的資料可從本領域中各種不同來源獲得。重組腺病毒Δ1651/GM-CSF/TK除了能選擇性地殺傷P53功能正常型和/或P53功能缺陷型的腫瘤細胞外，還能在上述腫瘤細胞內高效表達粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和TK基因產物，參照實施例6和7，附圖2和3。這類重組腺病毒具有多功能抗腫瘤效應重組腺病毒的直接溶癌作用，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子所誘發(fā)的抗腫瘤免疫反應和TK基因產物對腫瘤細胞所產生的“旁觀者效應”，這三方面的抗癌作用結合在一起，產生了三殺傷的最佳抗腫瘤效應。
本發(fā)明中的重組腺病毒還含有E3區(qū)基因。目前認為E3基因產物能降低宿主對腺病毒的免疫排斥效應，延長外源性蛋白在宿主體內的表達時間。[Ican，等(1997)美國國家科學院院報(PNAS)942587～2592；Bunder等(1997)病毒學雜志(J.Virol.)717623～7628]。本發(fā)明人發(fā)現帶有E3基因的腺病毒進入宿主體內的最大耐受量比不帶E3基因的腺病毒提高了2倍左右，表明E3基因產物能提高宿主對腺病毒的耐受性，降低腺病毒對宿主所產生的毒副反應。參見實施例10。這可能E3區(qū)的14.7K蛋白和10.4K/14.5K蛋白復合物阻斷腫瘤壞死因子所誘導的細胞毒性及炎癥反應有關。
在本發(fā)明的一個代替實施方案中，重組腺病毒蛋白可以通過定點突變，或/和插入突變，或/和移碼突變滅活E1B 19K蛋白和/或E1B 55K，所述病毒還可任選地攜帶一組，或兩組，或兩組以上的外源性基因。本發(fā)明的重組腺病毒能進一步包含一個在E1A基因上的額外突變。這種突變型的E1A蛋白質缺乏能夠結合腫瘤抑制基因Rb(和/或300kd多肽和/或107kd多肽)的CR1和/或CR2結構區(qū)域，但包含一個能夠反式激活腺病毒早期基因的功能CR3結構區(qū)域。該重組腺病毒能夠在缺乏功能性Rb腫瘤細胞內復制，繁殖，并殺傷腫瘤細胞。
治療腫瘤的方法本發(fā)明還提供了治療腫瘤的方法。本發(fā)明中的重組腺病毒可用于治療多種P53正常型和/或P53缺陷型的人類腫瘤。例如但不限于支氣管癌，鼻咽癌，喉癌，小細胞與非小細胞肺癌，肺腺癌，肝癌，胰腺癌，膀胱癌，結腸癌，乳腺癌，宮頸癌，卵巢癌，或淋巴細胞白血病的病人或非人類乳動物。重組腺病毒以有效抗腫瘤劑量的混懸液，通過多種途徑應用到腫瘤組織中，包括靜脈內，腹腔內，肌肉，皮下及局部腫瘤直接注射。每毫升含有大約103～1012或更多病毒顆粒的混懸物可做為一種氣霧劑吸入以治療腫瘤，例如支氣管癌，小細胞肺癌，非小細胞肺癌，肺腺癌或喉癌，鼻咽癌，宮頸癌，或用藥簽將其直接敷到腫瘤部位以治療腫瘤，例如支氣管癌，鼻咽癌，喉癌，宮頸癌，或著可以注射方法治療腫瘤，例如可注射到腹腔以治療卵巢癌，注射到門靜脈治療肝腫瘤或其他非肝臟原發(fā)腫瘤的肝轉移，或著直接注射到腫瘤部位以治療腫瘤，例如乳腺肝癌，前列腺癌。
本發(fā)明的重組腺病毒還可用于預防多種P53正常型和P53缺陷型的人類腫瘤。在預防性應用中，重組腺病毒或其混合物的組合物，被應用到目前并不患有癌癥的病人上，以增強病人對腫瘤復發(fā)的抵抗力，或延長緩解時間。
本發(fā)明的重組腺病毒還可作為一種腫瘤免疫療法，治療p53正常型和/或p53缺陷型的人類腫瘤，包括局部或遠處轉移的腫瘤。這種重組腺病毒可以通過多種途徑應用到腫瘤組織中，選擇性地在腫瘤細胞內復制、繁殖，并有效表達免疫細胞因子，免疫細胞因子能誘導效應細胞產生腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞和非特異性抗腫瘤免疫反應。
本發(fā)明的抗腫瘤腺病毒療法可聯合其他抗腫瘤方案，如常規(guī)化療、和/或放療、和/或生物療法以治療各種腫瘤。優(yōu)選的化療藥物包括Taxol，Taxotere，Doxorubicin，這些化合物的抗腫瘤療效在本領域中是公認的。
為了進一步詳細描述本發(fā)明，以下實施例是通過舉例方法提供。然而在權利要求的范圍內進行某些改變和調整應認為屬于本發(fā)明的范疇。
實施例實施例1.腺病毒E1B基因突變體的構建A.質粒pXC-Δ1651的構建質粒pXC-1購于加拿大Microbix Biosystem Inc(Toronto)。pXC-1含有人腺病毒5型(Ad5)從nt22-5790的基因序列。通過PCR方法[詳細實驗步驟參照分子克隆實驗手冊，第二版，Sambrook編著(1989)]在pXC-1上構建缺失E1B基因(從nt1651-2591)的腺病毒左端質粒。具體構建步驟如下以寡核苷酸鏈UCP 1(5’-TGAGACGCCCGACATCACCT-3’)UCP2(5’-CCGCTCGAGCGGTTAATTAACCTAACACGCCATGCAAGTTAA-3’)XhoI PacI為引物，pXC-1 DNA為模板，得到PCR產物A。PCR產物A含有腺病毒從nt1316-1650的基因序列，并在3’端含有寡核苷酸CCAATTAATTGGCGAGCTCGCC序列。
PacI XhoI以寡核苷酸鏈UCP3(5’-TTGGCTGCAGCGGCTGAAGC-3’)UCP4(5’-GGTTAATTAACCGCTCGAGCGGGTAAATATCAGGAATTGTTG-3’)為引物，pXC-1DNA為模板，得到PCR產物B。PCR產物B含有腺病毒從nt2592-3820的基因序列，并在5’端含有寡核苷酸GGTTAATTAACCGCTCGAGCGG序列。
PacI XhoI由此可見，PCR產物A的3’端含有與PCR產物B的5’端互補的22個寡核苷酸序列。將PCR產物A與PCR產物B混合在一起，100°C變性5分鐘，然后緩慢降溫復性。復性后有大約10％-20％左右的PCR產物A的正鏈與PCR產物B的副鏈，通過22個互補寡核苷酸序列而互聯成為PCR產物A+B。加入Taq DNA多聚酶(購于美國Promega公司)，在37℃條件下補平PCR產物A+B。
以寡核苷酸UCP1與UCP3為引物，PCR產物A+B為模板，得到PCR產物C。以AflII和HpaI消化PCR產物C，并將其與同樣的方式消化后的pXC-1連接，得到新的質粒pXC-Δ1651。pXC-Δ1651含有從nt1651-2591的缺失突變，缺失部分包括內源性E1B啟動子，E1B19K基因和5’端E1B 55K基因，并在E1B基因缺失部位插入寡核苷酸GGTTAATTAACCGCTCGAGCGG序列。PacI XhoIB.質粒pXC-Δ1714的構建為了在質粒pXC-1上構建缺失nt1714-2591的突變體，以寡核苷酸鏈UCP1(5’-TGAGACGCCCGACATCACCT-3’)UCP5(5’-CCGCTCGAGCGGTTAATTAACCGAGGTCAGATGTAACCAAGA-3’)XhoI PacI為引物，pXC-1DNA為模板，得到PCR產物D。PCR產物D含有腺病毒從nt1316-1713的基因序列，并在3’端含有寡核苷酸CCAATTAATTGGCGAGCTCGCC序列。
PacI XhoI以寡核苷酸鏈UCP3(5’-TTGGCTGCAGCGGCTGAAGC-3’)UCP4(5’-GGTTAATTAACCGCTCGAGCGGGTAAATATCAGGAATTGTTG-3’)PacI XhoI為引物，pXC-1DNA為模板，得到PCR產物B。PCR產物B含有腺病毒從nt2592-3820的基因序列，并在5’端含有寡核苷酸GGTTAATTAACCGCTCGAGCGG序列。
PacIXhoIPCR產物D的3’端含有與PCR產物B的5’端互補的22個寡核苷酸序列。將PCR產物D與PCR產物B混合在一起，100℃變性5分鐘，然后緩慢降溫復性。復性后有大約10％-20％左右的PCR產物D的正鏈與PCR產物B的副鏈，通過22個互補寡核苷酸序列而互聯成為PCR產物D+B。加入Taq NDA多聚酶(購于美國Promega公司)，在37℃條件下補平PCR產物D+B。以寡核苷酸UCP1與UCP3為引物，PCR產物D+B為模板，進行第二次PCR反應，得到PCR產物E。以AflII和HpaI消化PCR產物E，并將其與同樣的方式消化后的pXC-1相連接，得到新的質粒pXC-Δ1714。pXC-Δ1714含有從nt1714-2591的缺失突變，缺失部分包括E1B19K基因和5’端E1B 55K基因，但保留內源性E1B啟動子序列，并在E1B基因缺失部位插入寡核苷酸GGTTAATTAACCGCTCGAGCGG序列。
PacI XhoIC.質粒pXC-Δ2251的構建為了在質粒pXC-1上構建缺失nt2251-3509的突變體，以寡核苷酸鏈UCP1(5’-TGAGACGCCCGACATCACCT-3’)UCP13(5’-CCGCTCGAGCGGTTAATTAACCCAACATTCATTCCCGAGGGT-3’)XhoI PacI為引物，pXC-1DNA為模板，得到PCR產物L。PCR產物L含有腺病毒從nt1316-2250的基因序列，并在3’端含有寡核苷酸CCAATTAATTGGCGAGCTCGCC序列。
PacI XhoI以寡核苷酸鏈UCP3(5’-TTGGCTGCAGCGGCTGAAGC-3’)UCP14(5’-GGTTAATTAACCGCTCGAGCGGGGTACTGAAATGTGTGGGCG-3’)PacI XhoI為引物，pXC-1DNA為模板，得到PCR產物M。PCR產物M含有腺病毒從nt3510-3820的基因序列，并在5’端含有寡核苷酸GGTTAATTAACCGCTCGAGCGG序列。
PacI XhoIPCR產物L的3’端含有與PCR產物M的5’端互補的22個寡核苷酸序列。將PCR產物L與PCR產物M混合在一起，100℃變性5分鐘，然后緩慢降溫復性。復性后有大約10％-20％左右的PCR產物L的正鏈與PCR產物M的副鏈，通過22個互補寡核苷酸序列而互聯成為PCR產物L+M。加入Taq NDA多聚酶(購于美國Promega公司)，在37℃條件下補平PCR產物L+M。以寡核苷酸UCP1與UCP3為引物，PCR產物L+M為模板，進行第二次PCR反應，得到PCR產物N。以AflII和HpaI消化PCR產物N，并將其與同樣的方式消化后的pXC-1相連接，得到新的質粒pXC-Δ2251。pXC-Δ2251含有從nt2251-3509的缺失突變，缺失部分包括E1B 55K基因，但保留內源性E1B啟動子序列和E1B 19K基因，并在E1B 55K基因缺失部位插入寡核苷酸GGTTAATTAACCGCTCGAGCGG序列。
PacIXhoI實施例2.轉基因E1B基因突變體的構建A.質粒pXC-Δ1651/GM-CSF的構建以寡核苷酸鏈UCP5(5’-CGCGGATCCGCGATGTGGCTGCAGAGCCTGCT-3’)BamHIUCP6(5’-CCGGAATTCCCCTCACTCCGGACTGGCTCCC-3’)EcoRI為引物，以質粒PGT60hGM-CSF(購于美國Invivogen公司)為模板，獲得PCR產物F。PCR產物F含有完整的人源性GM-CSF基因序列，并在5’端和3’端含有BamHI和EcoRI的酶切 位點。以EcoRI和BamHI消化PCR產物F，并插入到同樣位點的質粒pcDNA3(購于美國Invitrogen公司)上，獲得新的重組質粒pcDNA3-GM-CSF。
以寡核苷酸鏈UCP7(5’-CCTTAATTAAGGGTTGACATTGATTATTGACT-3’)PacIUCP8(5’-CCTTAATTAAGGATGCAATTTCCTCATTTTATT-3’)PacI為引物，以質粒pcDNA3-GM-CSF為模板，獲得PCR產物G。PCR產物G含有CMV早期啟動子，人源性GM-CSF基因序列和牛生長荷爾蒙(BGH)聚腺苷酸信號，并在PCR產物G的兩端含有PacI酶切位點。以PacI消化PCR產物G，并連接到相同位點的pXC-Δ1651上獲得新的重組質粒pXC-Δ1651/GM-CSF。質粒pXC-Δ1651/GM-CSF缺失內源性E1B啟動子序列、E1B 19K基因序列和5’端E1B 55K基因，但含有人源性GM-CSF基因序列，并在GM-CSF基因的上游含有CMV早期啟動子，在GM-CSF基因的下游含有BGH聚腺苷酸序列。
B.質粒pXC-Δ1714/GM-CSF的構建以同樣的方法獲得PCR產物G，并以PacI消化PCR產物G，連接到相同位點的pXC-Δ1714上獲得新的重組質粒pXC-Δ1714/GM-CSF。質粒pXC-Δ1714/GM-CSF缺失E1B 19K基因序列和5’端E1B 55K基因，但保留內源性E1B啟動子序列。在E1B基因缺失突變部位插入人源性GM-CSF基因序列，并在GM-CSF基因的上游含有CMV早期啟動子，GM-CSF基因的下游含有BGH聚腺苷酸序列。
C.質粒pXC-Δ1651/TK的構建以寡核苷酸鏈UCP9(5’-CCGCTCGAGCGGATGGCCTCGTACCCCGGCCA-3’)XhoIUCP10(5’-CTAGTCTAGACTAGTCAGTTAGCCTCCCCCATCT-3’)XbaI為引物，以質粒PGT60hGM-CSF為模板，獲得PCR產物H。PCR產物H含有HSV TK基因序列，在PCR產物H的5’端含有XhoI位點，3’端含有XhaI位點，以XhoI和XbaI消化PCR產物H，并U插入到pcDNA3的相同位點獲得新的質粒pcDNA3-TK。以寡核苷酸鏈CP7(5’-CCTTAATTAAGGGTTGACATTGATTATTGACT-3’)PacIUCP8(5’-CCTTAATTAAGGATGCAATTTCCTCATTTTATT-3’)PacI為引物，以質粒pcDNA3-TK為模板，獲得PCR產物I。PCR產物I含有CMV早期啟動子，HSV-TK基因序列和牛生長荷爾蒙(BGH)聚腺苷酸信號，并在PCR產物I的兩端含有PacI酶切位點。以PacI消化PCR產物I，并連接到相同位點的pXC-Δ1651上獲得新的重組質粒pXC-Δ1651/TK。質粒pXC-Δ1651/TK缺失內源性E1B啟動子序列、E1B 19K基因序列和5’端E1B 55K基因，但含有HSV-TK基因序列，并在HSV-TK基因的上游含有CMV早期啟動子，在HSV-TK基因的下游含有BGH聚腺苷酸序列。
D.質粒pXC-Δ1714/TK的構建以同樣的方法獲得PCR產物I，并以PacI消化PCR產物I，連接到相同位點的pXC-Δ1714上獲得新的重組質粒pXC-Δ1714/TK。質粒pXC-Δ1714/TK缺失E1B 19K基因序列和5’端E1B 55K基因，但保留內源性E1B啟動子序列。在E1B基因缺失突變部位插入HSV-TK基因序列，并在HSV-TK基因的上游含有CMV早期啟動子，HSV-TK基因的下游含有BGH聚腺苷酸序列。
E.質粒pXC-Δ1651/GM-CSF/TK的構建以XhoI和XbaI消化質粒pcDNA-TK獲得HSV TK基因，并將HSVTK基因插入到相同位點的pcDNA-GM-CSF獲得新的質粒pcDNA-CSF-TK。以寡核苷酸鏈UCP11(5’-GACGTCGACTAATTCCGGTTATTTTCCA-3’)SalIUCP12(5’-GACGTCGACATCGTGTTTTTCAAAGGAA-3’)SalI為引物，以質粒PCITE-3a(+)(購于美國Novagen公司)為模板，獲得PCR產物J。PCR產物J含有腦心肌炎病毒(EMCV)的內部核糖體進入位點序列，并在PCR產物J的兩端含有內切酶SalI位點。以SalI消化PCR產物J，并插入到pcDNA-CSF-TK的XboI位點的，獲得新的質粒pcDNA-GM-CSF/TK。以寡核苷酸鏈UCP7(5’-CCTTAATTAAGGGTTGACATTGATTATTGACT-3’)PacIUCP8(5’-CCTTAATTAAGGATGCAATTTCCTCATTTTATT-3’)PacI為引物，以質粒pcDNA-CSF/TK為模板，獲得PCR產物K。PCR產物K含有CMV早期啟動子，人源性hGM-CSF基因序列，HSV-TK序列和牛生長荷爾蒙(BGH)聚腺苷酸信號，在人源性GM-CSF基因序列和HSV-TK序列之間由腦心肌類病毒內部核糖體進入位點有效連接。以PacI消化PCR產物K，并連接到相同位點的pXC-Δ1651上獲得新的重組質粒pXC-Δ1651/GM-CSF/TK。質粒pXC-Δ1651/GM-CSF/TK缺失內源性E1B啟動子序列、E1B 19K基因序列和5’端E1B 55K基因，但含有人源性hGM-CSF基因序列，HSV-TK序列和牛生長荷爾蒙(BGH)聚腺苷酸信號，并在人源性GM-CSF基因序列和HSV-TK序列之間由腦心肌類病毒內部核糖體進入位點有效連接，并在GM-CSF基因的上游含有CMV早期啟動子，在HSV TK基因的下游含有BGH聚腺苷酸序列。
F.質粒pXC-Δ1714/GM-CSF/TK的構建以同樣的方法獲得PCR產物K，并以PacI消化PCR產物K，連接到相同位點的pXC-Δ1714上獲得新的重組質粒pXC-Δ1714/GM-CSF/TK。質粒pXC-Δ1714/GM-CSF/TK缺失E1B 19K基因序列和5’端E1 B 55K基因，保留內源性E1B啟動子序列，并含有人源性GM-CSF基因序列，HSV-TK序列和牛生長荷爾蒙(BGH)聚腺苷酸信號，在人源性GM-CSF基因序列和HSV-TK序列之間由腦心肌類病毒內部核糖體進入位點有效連接，并在GM-CSF基因的上游含有CMV早期啟動子，在HSVTK基因的下游含有BGH聚腺苷酸序列。
G.質粒pXC-Δ2251/GM-CSF/TK的構建以同樣的方法獲得PCR產物K，并以PacI消化PCR產物K，連接到相同位點的pXC-Δ2251上獲得新的重組質粒pXC-Δ2251/GM-CSF/TK。質粒pXC-Δ2251/GM-CSF/TK缺失E1B 55K基因，保留內源性E1B啟動子序列和E1B 19K基因，并含有人源性GM-CSF基因序列，HSV-TK序列和牛生長荷爾蒙(BGH)聚腺苷酸信號，在人源性GM-CSF基因序列和HSV-TK序列之間由腦心肌類病毒內部核糖體進入位點有效連接，并在GM-CSF基因的上游含有CMV早期啟動子，在HSVTK基因的下游含有BGH聚腺苷酸序列。
實施例3.重組腺病毒的產生
A.Δ1651腺病毒的產生pBHGE3購于加拿大Microbix Biosystems Inc。pBHGE3含有Ad5基因序列但E1區(qū)從nt188到1339缺失。pBHGE3本身不具有感染性，但pXC-1或從PXC-1衍生出來的質粒與pBHG-E3共轉染293細胞，通過同源重組能產生具有感染的病毒(詳細實驗步驟參照Hitt，Constructionand Propagation of Human Adenovirus Vectors，InCell BiologyALaboratory Handbook，J.Celis，Academic Press，NY，1995，或參考Graham，Adenovirus Based Expression Vectors and RecombinantVaccines，InVaccinesNew Approaches to Immunological Problems。R.W.Eliss，Butterworth，pp363-390，1992)。Δ1651腺病毒由質粒pXC-Δ1651與質粒pBHGE3共轉染293細胞，通過同源重組的方法獲得。挑出單一的噬斑，并在293細胞中擴增。病毒DNA通過Qiagen血液試劑盒(購于美國Qiagen公司)獲得，用PCR篩選確認。Δ1651腺病毒缺失了nt 1651-2591部分，缺失部分包括內源性E1B啟動子，E1B19K基因和E1B 55K基因的大部分，Δ1651腺病毒不能編碼E1B 19K蛋白和E1B55K蛋白。
B.Δ1714腺病毒的產生Δ1714腺病毒由質粒pXC-Δ1714與質粒pBHGE3共轉染293細胞，通過同源重組的方法獲得。挑出單一的噬斑，并在293細胞中擴增，病毒DNA通過Qiagen血液試劑盒獲得，用PCR篩選確認。Δ1714腺病毒缺失了nt 1714-2591部分，缺失部分包括E1B19K基因和E1B 55K基因的大部分，但保留內源性E1B啟動子，Δ1714腺病毒不能編碼E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白。
C.Δ1651/GM-CSF腺病毒的產生Δ1651/GM-CSF腺病毒由質粒pXC-Δ1651/GM-CSF與質粒pBHGE3共轉染293細胞，通過同源重組的方法獲得。挑出單一的噬斑，并在293細胞中擴增，病毒DNA通過Qiagen血液試劑盒獲得，用PCR篩選確認。Δ1651/GM-CSF腺病毒不能編碼E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白，并攜帶由CMV早期啟動子調控的GM-CSF基因。
D.Δ1651/TK腺病毒的產生Δ1651/TK腺病毒由質粒pXC-Δ1651/TK與質粒pBHGE3共轉染293細胞，通過同源重組的方法獲得。挑出單一的噬斑，并在293細胞中擴增，病毒DNA通過Qiagen血液試劑盒獲得，用PCR篩選確認。Δ1651/TK腺病毒不能編碼E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白，并攜帶由CMV早期啟動子調控的TK基因。
E.Δ1714/GM-CSF腺病毒的產生Δ1714/GM-CSF腺病毒由質粒pXC-Δ1714/GM-CSF與質粒pBHGE3共轉染293細胞，通過同源重組的方法獲得。挑出單一的噬斑，并在293細胞中擴增，病毒DNA通過Qiagen血液試劑盒獲得，用PCR篩選確認。Δ1714/GM-CSF腺病毒不能編碼E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白，但保留 內源性E1B啟動子，并攜帶由CMV早期啟動子調控的GM-CSF基因。
F.Δ1714/TK腺病毒的產生Δ1714/TK腺病毒由質粒pXC-Δ1714/TK與質粒pBHGE3共轉染293細胞，通過同源重組的方法獲得。挑出單一的噬斑，并在293細胞中擴增，病毒DNA通過Qiagen血液試劑盒獲得，用PCR篩選確認。Δ1714/TK腺病毒不能編碼E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白，但保留內源性E1B啟動子，并攜帶由CMV早期啟動子調控的HSV TK基因。
G.Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒的產生Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒由質粒pXC-Δ1651/GM-CSF/TK與質粒pBHGE3共轉染293細胞，通過同源重組的方法獲得。挑出單一的噬斑，并在293細胞中擴增，病毒DNA通過Qiagen血液試劑盒獲得，用PCR篩選確認。Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒不能編碼E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白，并攜帶由CMV早期啟動子調控的GM-CSF基因和HSV TK基因，它們通過腦心肌炎病毒(EMCV)內部核糖體進入位點序列有效連接。
H.Δ1714/GM-CSF/TK腺病毒的產生Δ1714/GM-CSF/TK腺病毒由質粒pXC-Δ1714/GM-CSF/TK與質粒pBHGE3共轉染293細胞，通過同源重組的方法獲得。挑出單一的噬斑，并在293細胞中擴增，病毒DNA通過Qiagen血液試劑盒獲得，用PCR篩選確認。Δ1714/GM-CSF/TK腺病毒不能編碼E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白，但保留內源性E1B啟動子，并攜帶由CMV早期啟動子調控的GM-CSF基因和HSV TK基因，它們通過腦心肌炎病毒(EMCV)內部核糖體進入位點序列有效連接。
I.Δ2251/GM-CSF/TK腺病毒的產生Δ2251/GM-CSF/TK腺病毒由質粒pXC-Δ2251/GM-CSF/TK與質粒pBHGE3共轉染293細胞，通過同源重組的方法獲得。挑出單一的噬斑，并在293細胞中擴增，病毒DNA通過Qiagen血液試劑盒獲得，用PCR篩選確認。Δ2251/GM-CSF/TK腺病毒不能編碼E1B 55K蛋白，但保留內源性E1B啟動子和E1B 19K蛋白，并攜帶由CMV早期啟動子調控的GM-CSF基因和HSV TK基因，它們通過腦心肌炎病毒(EMCV)內部核糖體進入位點序列有效連接。
實施例4.噬斑法檢測重組腺病毒的復制能力為了比較本發(fā)明中的重組腺病毒在腫瘤細胞和正常細胞內的復制能力，同等劑量的重組腺病毒和野生型腺病毒(1 MOI)分別感染正常細胞--人微管內細胞MVEC(購于美國Clonetics公司)，宮頸癌細胞(C33A，P53突變型，購于美國ATCC公司)，肝癌細胞(Hep3B，P53突變型，購于美國ATCC公司)和前列腺癌細胞(LNCaP，P53正常型，購于美國ATCC公司)。48小時后，將細胞凍融三次釋放病毒，通過噬斑法在HEK293細胞內測定病毒滴度[詳細實驗步驟參照Heise等自然醫(yī)學(Nature Medicine)，3(6)639-645]。重組腺病毒在不同細胞株內的滴度與野生型病毒在同一細胞內的滴度相比較，其比率可用來評估病毒復制的有效性，以及對腫瘤細胞的選擇性。例如，當比率小于100，表明重組腺病毒在其細胞株內的復制能力小于野生型腺病毒，相反，當比率大于100時，則表明此病毒在其細胞株內的復制能力大于野生腺病毒。由表1所見，Δ1651腺病毒、Δ1715腺病毒、Δ1651/GM-CSF腺病毒、Δ1773/GM-CSF腺病毒、Δ1651/TK腺病毒、1773/TK腺病毒、Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒、Δ1773/GM-CSF/TK腺病毒與野生型腺病毒在腫瘤細胞C33A，HeP3B、LNCaP中的比率均超過150％，表明同時滅活E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白的重組腺病毒在P53突變型和P53正常型的腫瘤細胞內的復制能力強于野生型腺病毒。而這些重組腺病毒與野生型腺病毒在正常細胞MVEC內的比率為0.2％左右，表明這類重組腺病毒在MVEV內的復制能力遠遠低于野生型腺病毒。比較這些重組腺病毒在腫瘤細胞和正常細胞內的復制能力，也能進一步表明這些重組腺病毒能選擇性地在P53突變型和P53正常型的腫瘤細胞內復制，他們在腫瘤細胞內的復制能力高于在正常細胞內1000倍以上。
表1.噬斑法檢測重組腺病毒在腫瘤細胞內的復制能力 實施例5.細胞致病效應實驗重組腺病毒和野生型腺病毒分別以20 MOI的劑量感染正常細胞，包括人微管內皮細(MVEC)，乳腺上皮細胞(MEC)，纖維細胞(HS68)，以上正常細胞均購于美國Clonetics公司，P53基因突變型的腫瘤細胞，包括宮頸癌細胞(C33A)，結腸癌細胞(SW620)，結腸癌細胞(HT29)，肺癌細胞(NCI-H128)，肝癌細胞(Hep3B)，卵巢癌細胞(OVCAR3)，P53基因正常型腫瘤細胞，包括前列腺癌(LNCaP)，乳腺癌(MCF7)，宮頸癌細胞(Hela)，黑色素瘤細胞(SP6)，肝癌細胞(Hep G2)，胰腺癌細胞(PANC-1)，以上腫瘤細胞株均購于美國ATCC公司(見表2)。感染后3天以顯微鏡法檢查細胞致病效應(CPE)。(+)或(-)表明存在或缺乏致病效應(CPE)。由表2結果可知，野生型腺病毒對正常細胞和腫瘤細胞均產生致病效應(CPE)，而Δ1651腺病毒和Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒對幾乎所有的P53基因突變型和P53基因正常型腫瘤細胞，均產生致病效應(CPE)，但對正常細胞不產生致病效應。此結果進一步說明了同時滅活E1B 19K蛋白和E1B 55K蛋白的重組腺病毒能選擇性地殺死P53功能正常型和P53功能缺陷型腫瘤細胞。但對正常細胞基本上無傷害作用。
表2.重組腺病毒和野生型腺病毒對正常細胞和腫瘤細胞的致病效應(CPE)細胞株致病效應(CPE)正常細胞 野生型腺病毒 Δ1651腺病毒Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒人微管內皮細(MVEC)+ - -乳腺上皮細胞(MEC) + - -纖維細胞(HS68)+ - -淋巴細胞(Lymphocytes) + - -P53基因突變型腫瘤細胞宮頸癌細胞(C33A) + + +結腸癌細胞(SW620) + + +結腸癌細胞(HT29) + + +肺癌細胞(NCI-H128)+ + +肝癌細胞(Hep3B) + + +卵巢癌細胞(OVCAR3)+ + +P53基因正常型腫瘤細胞前列腺癌(LNCaP) + + +乳腺癌(MCF7) + + +
宮頸癌細胞(Hela)+++黑色素瘤細胞(SP6) +++肝癌細胞(Hep G2)+++實施例6.表達粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的腺病毒Δ1651腺病毒、Δ1651/GM-CSF腺病毒、Δ1651/TK腺病毒，Δ1651/GM-CSF/TK和Δ2251/GM-CSF/TK腺病毒分別以10 MOI的劑量感染293細胞和C33A細胞。感染二天后，觀察到腺病毒引起90％以上細胞致病作用(CPE)。收獲被感染的293細胞和C33A細胞，快速離心除去細胞碎片，用ELISA方法檢測粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(購于美國R&D System公司)的表達水平。其測檢步驟按照廠家的要求進行。由圖2所示，含有粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子基因表達盒的Δ1651/GM-CSF腺病毒，Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒和Δ2251/GM-CSF/TK腺病毒均能高效表達粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子，其中Δ1651/GM-CSF，Δ1651/GM-CSF/TK和Δ2251/GM-CSF/TK在293細胞內表達粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的水平分別為1000ng/ml，1250ng/ml和500ng/ml(1ml含有1×105細胞)，在C33A細胞中的表達劑量分別為1100ng/ml，1300ng/ml和550ng/ml。而不含有粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子基因的Δ1651腺病毒和Δ1651/TK腺病毒未能檢查出任何粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子。腺病毒Δ1651/GM-CSF和Δ1651/GM-CSF/TK表達粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的水平基本相似，表明Δ1651/GM-CSF/TK內的第二組外源性基因HSV TK并未影響第一組基因粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的表達。
實施例7.藥物前體GCV對重組腺病毒的細胞致病效應的影響肝癌細胞株Hep3B(P53基因突變型)以2×10000細胞/孔的數量種到96孔細胞板，37℃培養(yǎng)過夜。第二天，Δ1651/TK腺病毒和Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒分別以0.001 MOI劑量感染HeP3B。感染后72小時，將含有或不含有藥物前體GCV(購于美國Sigma公司)的新鮮細胞培養(yǎng)液加入到96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)96小時，由MTT方法測定細胞的成活率[詳細實驗步驟參照Kodama等抗病毒研究(Antiviral Res)199631(3)159-164]。在不含有GCV的培養(yǎng)條件下，Δ1651/TK腺病毒和Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒以0.001 MOI劑量感染HeP3B細胞，HeP3B細胞的成活率分別為71％和68％。在含有GCV的培養(yǎng)條件下，以同樣劑量的病毒感染，HeP3B細胞的成活率明顯降低，且與GCV濃度呈正比。由圖3所見，當Δ1651/TK腺病毒和Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒的感染劑量為0.001 MOI時，GCV的IC50為0.02ug/m1，當GCV濃度為1ug/ml時，0.001 MOI的Δ1651/TK腺病毒或Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒能殺傷99％的HeP3B細胞。由此可見，Δ1651/TK腺病毒和Δ1651/GM-CSF/TK腺病毒均能高效表達HSV-TK基因產物，并在藥物前體GCV的誘導下，進一步加強了腺病毒對腫瘤細胞的細胞致病效應。
比較腺病毒Δ1651/GM-CSF和Δ1651/GM-CSF/TK在藥物前提GCV的存在下的細胞致病效應曲線，表明兩組重組腺病毒表達HSV TK產物的水平基本相似。由于Δ1651/GM-CSF/TK中的HSV TK基因是由腦心肌類病毒的內部核糖體進入位點控制翻譯，本實驗表明通過內部核糖體進入位點而有效連接的兩組外源性基因組，其中第二組外源性基因能在內部核糖體進入位點的調控下高效表達。
實施例8.動物實驗I將LNCaP細胞(P53基因正常型)以1×106細胞/鼠的劑量，皮下注射到雄性無胸腺的裸鼠頸背部。當腫瘤瘤體達到300mm3左右，將帶有腫瘤的裸鼠分別分為4組(每組共含六個以上的裸鼠)，第一組為陰性對照，直接注入含有10％甘油的PBS溶液，第二組裸鼠接受Δ1651的直接腫瘤注射，第三組接受Δ1651/TK的直接腫瘤注射，第四組接受Δ1651/GM-CSF/TK的直接腫瘤注射，其各病毒的注射量為109顆粒/mm3。每周測量腫瘤的生產情況，連續(xù)記錄六周，其結果列于圖4(LNCaP腫瘤)。由圖4所見，接受注射Δ1651、Δ1651/TK和Δ1651/GM-CSF/TK一周后，裸鼠的LNCaP腫瘤瘤體開始縮小，給藥后的六周，腫瘤均縮小至注射前瘤體體積的5％左右，腫瘤幾乎完全消失。而陰性對照組的腫瘤體積持續(xù)增大，六周后是原腫瘤體積近四倍。本實驗表明，本發(fā)明中的重組腺病毒具有超強的抗腫瘤效應， 單一療程的注射能徹底治愈患有前列腺癌的裸鼠。
實施例9.動物實驗II將LNCaP細胞(P53基因正常型)以1×106細胞/鼠的劑量，皮下注射到雄性無胸腺的裸鼠頸背部。當腫瘤瘤體達到300mm3左右，將帶有腫瘤的裸鼠分別分為4組(每組共含六個以上的裸鼠)。裸鼠除接受病毒的直接腫瘤注射外，同時還接受前體藥物GCV的腹腔內注射。由圖5所示，此動物實驗分為四組，第一組為陰性對照，接受10％甘油的PBS溶液注射，第二組接受Δ1651和GCV的注射，第三組接受Δ1651/TK和GCV的注射，第四組接受Δ1651/GM-CSF/TK和GCV的注射。病毒的注射劑量為1×107顆粒數/mm3，GCV的注射劑量為60mg/Kg，連續(xù)注射6天。由圖5可見，治療6周后，接受Δ1651與GCV注射的裸鼠腫瘤瘤體為原腫瘤瘤體的103％。而接受Δ1651/TK和GCV，Δ1651/GM-CSF/TK和GCV注射的裸鼠腫瘤瘤體顯著縮小，分別是原腫瘤體積的6.8％和8.7％。由此可見，Δ1651/TK和Δ1651/GM-CSF/TK內的HSV TK基因能高效表達，并能通過前體藥GCV，極大地加強了腺病毒的抗腫瘤效應。
實施例10。腺病毒的最大耐受量實驗8周大的雄性小白鼠(各組為4只)接受大劑量重組腺病毒的直接靜脈注射，觀察大劑量腺病毒進入小鼠體內所產生的毒副反應，以確定腺病毒在小白鼠體內的最大耐受劑量(MTD)。重組腺病毒Δ1651，Δ1651/GM-CSF/TK，含有及不含有E3區(qū)基因的野生型腺病毒Wt/E3和Wt/E3-以1×1011顆粒/鼠，2×1011顆粒/鼠，3×1011顆粒/鼠靜脈的劑量注射到小白鼠體內，觀察各組小白鼠的死亡率以確定腺病毒的最大耐受量(表3)。由表3所示，3×1011顆粒/鼠的Δ1651，Δ1651/GM-CSF/TK和Wt/E3靜脈注射到小白鼠體內，不會引起小白鼠死亡，表明它們在小白鼠體內的最大耐受劑量至少為3×1011顆粒，而wt/E3-進入小白鼠體內的最大耐受量為1×1011顆粒/鼠。本動物實驗證明E3區(qū)基因產物能降低腺病毒進入宿主體內的毒副反應，并提高腺病毒的最大耐受劑量。
表3.腺病毒的最大耐受量實驗

權利要求
1.一種重組腺病毒，其特征在于該病毒滅活能夠與細胞內功能性腫瘤抑制基因p53結合的病毒蛋白，但攜帶兩組能夠編碼抗腫瘤蛋白的外源性基因，并通過內部核糖體進入位點(internal ribosome entry site或IRES)有效連接，兩組外源性基因能被共轉錄成一條mRNA鏈，由內部核糖體進入位點控制第二組外源性基因的翻譯。
2.權利要求1中所述的重組腺病毒，其特征在于其中所述病毒被滅活的病毒蛋白為E1B 55K蛋白。
3.權利要求1或2中所述的重組腺病毒，其特征在于其中所述病毒可在P53功能缺陷型的腫瘤細胞內大量復制繁殖，高效表達外源性蛋白，并殺死腫瘤細胞，而對P53功能正常型的非腫瘤細胞基本無殺傷作用。
4.權利要求1或2中所述的重組腺病毒，其中所述病毒通過缺失突變，和/或定點突變，和/或插入突變，和/或移碼突變滅活該病毒的E1B55K蛋白。
5.權利要求1或2中所述的重組腺病毒，其中包括兩組外源性基因，它們所編碼的蛋白分別為兩個細胞因子，兩個細胞自殺基因產物，一個細胞因子與一個自殺基因產物，一個細胞因子與一個細胞周期調控蛋白，或一個細胞因子與一個細胞凋亡誘導蛋白。
6.權利要求1或2中所述的重組腺病毒，其中包括兩組外源性基因，它們由外源性啟動子，或腺病毒啟動子所驅動，并在第二個外源性基因下游任選地含有外源性聚腺苷酸結構。
7.權利要求6中所述的重組腺病毒，其中所述外源性啟動子為外源性病毒類啟動子，或外源性組織特異性啟動子。
8.權利要求1或2中所述的重組腺病毒，其中所述內部核糖體進入位點序列來自腦心肌炎病毒(EMCV)，和/或微管內皮生長因子(VEGF)，和/或免疫球蛋白鏈結合蛋白(BiP)，和/或纖維細胞生長因子2(fibroblastgrowth factor2)，和/或丙型肝炎病毒(HCV)基因組。
9.權利要求1～8中任意一項所述的重組腺病毒，其中所述病毒含有E3基因。
10.藥物組合物，該組合物含有殺死腫瘤細胞有效量的權利要求1～9中任意一項所述的重組腺病毒和化療藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組腺病毒，其特征在于該病毒滅活能夠與細胞內功能性腫瘤抑制基因p53結合的病毒蛋白，但攜帶兩組能夠編碼抗腫瘤蛋白的外源性基因，并通過內部核糖體進入位點(internal ribosome entry site或IRES)有效連接，兩組外源性基因能被共轉錄成一條mRNA鏈，由內部核糖體進入位點控制第二組外源性基因的翻譯。這種重組腺病毒能夠在P53功能缺陷型和/或P53功能正常型的腫瘤細胞內大量復制繁殖，產生細胞致病效應(CPE)，并能在腫瘤細胞內高效表達外源性抗腫瘤蛋白，最終殺死腫瘤細胞，而對P53功能正常型的非腫瘤細胞基本無殺傷作用。
文檔編號C12N15/12GK1607248SQ20041004605
公開日2005年4月20日 申請日期2001年11月15日 優(yōu)先權日2001年11月15日
發(fā)明者陳瑜 申請人:杭州中肽生化有限公司, 陳瑜