專利名稱：神經(jīng)細(xì)胞提取物及其在間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物細(xì)胞提取物及應(yīng)用技術(shù)，具體涉及人或動物神經(jīng)細(xì)胞提取物及其在間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞中的應(yīng)用技術(shù)。
背景技術(shù)：
1997年以來，干細(xì)胞研究取得重要進(jìn)展，研究發(fā)現(xiàn)人體間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)可以被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)、肌肉、皮膚、軟骨、脂肪、肌腱、肝臟、血液及組織類型的成熟細(xì)胞，擴(kuò)增誘導(dǎo)后移植到體內(nèi)和相應(yīng)組織細(xì)胞良好整合，發(fā)揮特定的生物學(xué)功能，可以用來移植治療多種疾病。上述研究結(jié)果提示，MSC擴(kuò)增誘導(dǎo)分化而得的神經(jīng)樣細(xì)胞可以用來移植治療老年性癡呆、帕金森、腦萎縮、外周神經(jīng)損傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病。目前這類疾病在臨床上沒有理想的治療措施，干細(xì)胞和誘導(dǎo)分化后的神經(jīng)樣細(xì)胞移植將成為上述疾病治療的最佳選擇。
目前，人工提取的神經(jīng)細(xì)胞提取物為小分子提取物，主要從腮腺等組織中提取，以注射方式應(yīng)用于治療神經(jīng)性損傷方面。
近年來，對誘導(dǎo)MSC分化為神經(jīng)細(xì)胞所用誘導(dǎo)試劑有了較多的研究，MSC可以在β-巰基乙醇，二甲基亞砜及維甲酸等抗氧化劑的誘導(dǎo)下分化為神經(jīng)細(xì)胞，中國微侵襲神經(jīng)外科雜志2004，9(2)實驗研究報道“人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及向神經(jīng)細(xì)胞分化研究”結(jié)論阿魏酸鈉具有誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人MSC向神經(jīng)細(xì)胞分化的作用?，F(xiàn)有技術(shù)研究方法及誘導(dǎo)試劑各不相同，應(yīng)用效果不穩(wěn)定，且未形成標(biāo)準(zhǔn)。
相關(guān)名詞注釋(1)于細(xì)胞是各種成熟細(xì)胞的起源細(xì)胞，根據(jù)來源及分化潛能的不同，分為胚胎干細(xì)胞(embryonic stemcells，ES)和成體干細(xì)胞(dult stem cells，ASCs)兩類。有潛在的擴(kuò)增及誘導(dǎo)分化性能。
(2)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs簡寫為MSC)是目前研究較多的ASCs廣泛存在于成人多種組織中，而且具有多向分化潛能，可以在體內(nèi)外被誘導(dǎo)分化為多種類型、不同功能的成熟細(xì)胞。在體外能達(dá)到50次以上倍增而保持其多向分化的潛能性。
(3)DMEM與F12培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)通用基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
(4)卵細(xì)胞提取物從人或動物卵細(xì)胞中提取，分子量大小正常不等的復(fù)雜混合物，含有多種促進(jìn)、調(diào)控及誘導(dǎo)細(xì)胞生長分化因子。該項技術(shù)的技術(shù)方案記載在專利申請?zhí)枮?00410033182.9的專利申請中。
(5)神經(jīng)細(xì)胞提取物，從人或動物神經(jīng)細(xì)胞組織中提取的，分子量大小不等的復(fù)雜混合物，含有多種特異性促進(jìn)、調(diào)控及誘導(dǎo)向神經(jīng)細(xì)胞生長分化因子。
(6)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化用天然化合物或細(xì)胞因子及等與干細(xì)胞在特定溫度、濕度和二氧化碳條件下共同培養(yǎng)一定時間后，干細(xì)胞分化為成熟細(xì)胞。不同誘導(dǎo)因子和條件誘導(dǎo)后所得成熟細(xì)胞類型不同。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種取材于人或動物體內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞組織，經(jīng)人工提取的、使分子量小于20萬道爾頓(Da)的神經(jīng)細(xì)胞提取物；本發(fā)明還提供該神經(jīng)細(xì)胞提取物在體外MSC誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞中作為誘導(dǎo)劑的應(yīng)用技術(shù)，本發(fā)明的神經(jīng)細(xì)胞提取物在MSC誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的應(yīng)用中，顯示出良好的誘導(dǎo)分化率，且效果好，重復(fù)性及穩(wěn)定性好。
發(fā)明技術(shù)方案如下人或動物神經(jīng)細(xì)胞提取物，主要包括以下方法提取神經(jīng)細(xì)胞組織取材，如坐骨神經(jīng)組織或腦組織，去除紅細(xì)胞、被膜及結(jié)締組織等非需要成份→細(xì)胞勻漿→細(xì)胞破碎→沉淀或過濾，取上清液→分離去除大于20萬道爾頓(Da)以上分子量的物質(zhì)→蛋白濃度測定，活性測定，除菌，凍存或制備成試劑分裝。
具體方法為(1)取人或動物神經(jīng)細(xì)胞組織，去除內(nèi)存紅細(xì)胞及被膜、結(jié)締組織，剪碎備用；(2)在4℃以下，勻漿3-5次；(3)將勻漿液行細(xì)胞破碎至細(xì)胞完全破碎；(4)在1-4℃條件下，去處沉渣和蛋白絮狀物，吸取上清液；(5)獲得的上清液，截留分離去除分子量大于20萬道爾頓(Da)以上的大分子物質(zhì)，使獲得的過濾液中的蛋白和多肽類物質(zhì)的分子量小于20萬道爾頓(Da)；(6)獲得的過濾液蛋白含量測定，活性測定，除菌，凍存或無菌分裝，此為本發(fā)明的神經(jīng)細(xì)胞提取物。
步驟(1)的神經(jīng)細(xì)胞組織剪碎后進(jìn)行勻漿，也可以加入1-4倍生理鹽水稀釋后再勻漿；步驟(3)細(xì)胞破碎可以用化學(xué)或物理的方法，優(yōu)選凍融，是置于冰箱凍存至完全凍結(jié)，然后在不高于隔水42℃的條件下徹底融化，如上條件反復(fù)凍融3-5次，按常規(guī)涂片顯微鏡觀察，證明細(xì)胞完全破碎；步驟(5)的截留分離方法可以是高速離心、電泳、過濾膜過濾等方法，優(yōu)選過濾膜在正壓或負(fù)壓條件下過濾截留，其目的是將大分子物質(zhì)分離出來，保留分子量小于20萬道爾頓(Da)的成份。過濾膜的選用要求能截留下分子量大于20萬道爾頓(Da)的大分子物質(zhì)。本發(fā)明的神經(jīng)細(xì)胞提取物濾液用常規(guī)方法制成試劑，可粉劑或水劑。制成水劑時，蛋白質(zhì)濃度大于4毫克/毫升為好，若水劑中蛋白濃度過低，在應(yīng)用時為了滿足蛋白濃度，相應(yīng)的水容積增大，導(dǎo)致一定體積的培養(yǎng)液內(nèi)的其它成份用量減少，不能滿足培養(yǎng)液配比要求。不論是粉劑或水劑，應(yīng)用時，根據(jù)活性單位要求取量即可。試劑應(yīng)按生物制劑保存辦法低溫保存。
所述的人或動物神經(jīng)細(xì)胞組織是直接從人或動物體取得的，動物又以哺乳動物為好。
本發(fā)明的神經(jīng)細(xì)胞提取物的生產(chǎn)過程，最好在上述低溫條件下進(jìn)行，以減少活性損失，防止污染。細(xì)胞破碎應(yīng)完全，可采用化學(xué)或物理方法，超聲波等技術(shù)，凍融過程需反復(fù)進(jìn)行至細(xì)胞完全破碎。蛋白質(zhì)含量可因鹽水加入的多少而變化，提取液中蛋白質(zhì)濃度最好為1毫克以上/毫升，保證其它有效成份得以充分提取，制備成試劑時，可再濃縮或稀釋到要求濃度，活性界定是在應(yīng)用中以100毫升培養(yǎng)液含神經(jīng)細(xì)胞提取物以蛋白質(zhì)濃度表示，含蛋白質(zhì)1毫克以上即表現(xiàn)有活性，為有效活性范圍。凍存可以是-20℃，能較好地保持提取物的活性，積量后制備試劑。除菌方法以過濾法為好。
本發(fā)明所述的神經(jīng)細(xì)胞提取物在MSC誘導(dǎo)分化中的應(yīng)用，是將本發(fā)明的神經(jīng)細(xì)胞提取物、基礎(chǔ)培養(yǎng)基及條件培養(yǎng)液等與MSC共同培養(yǎng)，誘導(dǎo)其分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，其應(yīng)用可以是本發(fā)明的神經(jīng)細(xì)胞提取物結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)的應(yīng)用，也可以是本發(fā)明的神經(jīng)細(xì)胞提取物與其它試劑如基礎(chǔ)培養(yǎng)基等共同制備成干細(xì)胞誘導(dǎo)分化試劑盒的應(yīng)用。所述試劑盒的應(yīng)用可以是主要由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和卵細(xì)胞提取物和/或神經(jīng)細(xì)胞提取物制備的試劑盒中的應(yīng)用。所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以選自DMEM與F12的混合培養(yǎng)基為好。
應(yīng)用有效量即活性條件以培養(yǎng)液總體積中含神經(jīng)細(xì)胞提取物以蛋白質(zhì)濃度表示，顯示為蛋白質(zhì)1％(毫克/毫升)以上即表現(xiàn)有活性，為有效活性范圍，在1％-100％為更有效活性范圍。在此活性范圍內(nèi)，誘導(dǎo)分化率達(dá)到60％以上。
經(jīng)多次反復(fù)的實驗，以人MSC為例，擴(kuò)增培養(yǎng)15天，傳代四次，將擴(kuò)增后的MSC誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞，再培養(yǎng)15天，傳代四次，誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化率達(dá)到本發(fā)明的應(yīng)用效果，且重復(fù)性和穩(wěn)定性好。誘導(dǎo)細(xì)胞鑒定結(jié)果形態(tài)學(xué)、神經(jīng)細(xì)胞特異性抗原標(biāo)志鑒定及神經(jīng)遞質(zhì)分析等均符合神經(jīng)細(xì)胞特征。
本發(fā)明的神經(jīng)細(xì)胞提取物在MSC誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的應(yīng)用中，顯示出良好的誘導(dǎo)分化率，在60％以上，適宜的應(yīng)用，誘導(dǎo)分化率可達(dá)到95％以上。
所述人或動物神經(jīng)細(xì)胞提取物所含成份及其含量目前尚未完全清楚，已有報導(dǎo)證實，神經(jīng)細(xì)胞漿中含有潛在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長與分化的因子，還含有豐富的蛋白質(zhì)及相關(guān)因子，與其它培養(yǎng)基及相關(guān)因素共同為MSC誘導(dǎo)分化提供了理想的綜合營養(yǎng)環(huán)境，表現(xiàn)為維持MSC生長的同時，誘導(dǎo)其向神經(jīng)細(xì)胞分化。
現(xiàn)結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述實施例1，神經(jīng)細(xì)胞提取物的制備(1)取人或動物坐骨神經(jīng)細(xì)胞組織，立即通過動脈和靜脈灌生理鹽水，最大限度地去除血管內(nèi)存留的紅細(xì)胞，剃出被膜、結(jié)締組織、血管等非需要成份，剪碎，加入等量生理鹽水備用；(2)組織勻漿或搗碎機(jī)在4℃條件下，1-3萬轉(zhuǎn)/分鐘勻漿3-5次，每次1分鐘；應(yīng)注意勻漿機(jī)不宜過熱，否則部分組織液失去活性；(3)將勻漿液置于-20℃冰箱凍存至完全凍結(jié)，一般24小時以上，然后在不高于42℃的條件下隔水徹底融化，如上條件反復(fù)凍融3-5次，按常規(guī)涂片顯微鏡觀察，證明細(xì)胞完全破碎；(4)在1-4℃的條件下自然沉降2-10小時，吸取上清液，用3-4層無菌紗布過濾，去處沉渣和蛋白絮狀物，在4℃條件下，400-600g離心30分鐘，取上清液；(5)用過濾膜在正壓或負(fù)壓條件下過濾獲得的上清液，截留分子量大于20萬道爾頓(Da)以上的大分子物質(zhì)，使過濾液中的蛋白和多肽類物質(zhì)的分子量小于20萬道爾頓(Da)；(6)測定蛋白濃度為20毫克/毫升，應(yīng)用活性測定符合，過濾法除菌，用無菌生理鹽水稀釋成蛋白濃度為10毫克/毫升，無菌分裝，為水劑試劑。
實施例2，MSC誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的應(yīng)用試劑盒的應(yīng)用，卵細(xì)胞提取物水劑，含蛋白10毫克/毫升，上述神經(jīng)細(xì)胞提取物水劑含蛋白10毫克/毫升，制備每100毫升試劑盒，各組份獨立包裝用量(1)DMEM與F12混合培養(yǎng)基 80毫升(2)人體卵細(xì)胞提取物水劑 10毫升(3)神經(jīng)細(xì)胞提取物水劑 10毫升試劑盒中可以有常規(guī)用有效量的促細(xì)胞生長因子、抗氧化劑及抗生素等。
誘導(dǎo)培養(yǎng)方法1、間充質(zhì)干細(xì)胞分離、純化按常規(guī)方法從骨髓、脂肪等組織中分離獲得單個核細(xì)胞，先進(jìn)行細(xì)胞原代貼壁培養(yǎng)后用間充質(zhì)干細(xì)胞的表面特異標(biāo)志抗原進(jìn)行正、負(fù)免疫篩選，獲得純間充質(zhì)干細(xì)胞。若細(xì)胞數(shù)量足夠，也可直接用分離獲得的單個核細(xì)胞進(jìn)行分離純化。依據(jù)實驗?zāi)康暮图?xì)胞數(shù)量，先進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)到所需數(shù)量或直接用本試劑進(jìn)行誘導(dǎo)。
2、間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁培養(yǎng)將間充質(zhì)干細(xì)胞用基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋為1×105細(xì)胞/ml，按×104細(xì)胞/cm2密度接種到培養(yǎng)瓶(皿)中，按間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增方法進(jìn)行體外培養(yǎng)至細(xì)胞長滿瓶壁，2/3以上細(xì)胞融合后進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。間充質(zhì)干細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)梭形，呈火焰狀有規(guī)則排列生長。表面分子標(biāo)志CD34-、CD45-、CD103+、CD106+、SH2+、SH4+。
3、誘導(dǎo)培養(yǎng)移出貼壁培養(yǎng)細(xì)胞后的培養(yǎng)液，用生理鹽水洗1-2次，將上述量的細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，需試劑盒培養(yǎng)液總體積為10ML，設(shè)定活性蛋白質(zhì)含量分別為50％，則取DMEM/F12培養(yǎng)基9ml，卵細(xì)胞提取物0.5毫升，神經(jīng)細(xì)胞提取物0.5毫升，此10ML培養(yǎng)液中含兩種細(xì)胞提取物蛋白質(zhì)各5mg，活性蛋白質(zhì)濃度分別為50％。將試劑盒培養(yǎng)液與細(xì)胞的混合物置于37℃、5％CO2、95％濕度條件下培養(yǎng)，連續(xù)觀察細(xì)胞生長狀況。
4、誘導(dǎo)細(xì)胞鑒定(1)形態(tài)誘導(dǎo)前細(xì)胞呈長梭形，火焰狀生長，有規(guī)則排列，細(xì)胞核大，胞漿成份相對少。培養(yǎng)3天左右，細(xì)胞逐漸變圓，然后伸出突起，形成多突起神經(jīng)細(xì)胞樣細(xì)胞。
(2)神經(jīng)元細(xì)胞特異性抗原標(biāo)志鑒定采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法對細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果為神經(jīng)元的特異標(biāo)志物神經(jīng)元特異性烯醇酶(NSE)、神經(jīng)特異性核蛋白(NeuN)、中間神經(jīng)絲(NFOm)、tau蛋白和一些微管蛋白(tubulin-β、MAP-2、TuJ-1)呈陽性反應(yīng)。
(3)神經(jīng)遞質(zhì)分析采用氣/質(zhì)譜分析，培養(yǎng)上清液中有多巴胺等神經(jīng)遞質(zhì)產(chǎn)生。
(4)誘導(dǎo)率90％以上。
經(jīng)多個實施例，培養(yǎng)液中分別取神經(jīng)細(xì)胞提取物不同蛋白濃度如5％、10％、20％、35％、50％、75％、100％及150％作誘導(dǎo)培養(yǎng)，均獲得較滿意的效果，顯示出良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。本發(fā)明的技術(shù)方案不受實施例的限制。
權(quán)利要求
1.神經(jīng)細(xì)胞提取物，主要包括以下方法制取(1)取人或動物神經(jīng)細(xì)胞組織，去除紅細(xì)胞、被膜及結(jié)締組織，剪碎備用；(2)細(xì)胞勻漿；(3)將勻漿液行細(xì)胞破碎至細(xì)胞完全破碎；(4)沉淀或過濾，取上清液；(5)分離去除分子量大于20萬道爾頓(Da)以上的物質(zhì)；(6)蛋白濃度測定，活性測定，除菌，凍存或制備試劑無菌分裝，此為本發(fā)明的神經(jīng)細(xì)胞提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的神經(jīng)細(xì)胞提取物，其特征在于，主要包括以下方法制取(1)取人或動物神經(jīng)細(xì)胞組織，去除內(nèi)存紅細(xì)胞及被膜及結(jié)締組織，剪碎備用；(2)在4℃以下，勻漿3-5次；(3)細(xì)胞破碎方法是凍融，將勻漿液置于冰箱凍存至完全凍結(jié)，然后在不高于隔水42℃條件下徹底融化，如上條件反復(fù)凍融3-5次，按常規(guī)涂片顯微鏡觀察，細(xì)胞完全破碎；(4)在1-4℃條件下，去除沉渣和蛋白絮狀物，吸取上清液；(5)獲得的上清液，分離去除分子量大于20萬道爾頓(Da)以上的大分子物質(zhì)，使獲得的過濾液中的蛋白和多肽類物質(zhì)的分子量小于20萬道爾頓(Da)；(6)獲得的過濾液蛋白含量測定，蛋白質(zhì)濃度為1毫克以上/每毫升濾液，活性測定，除菌，凍存或制備試劑無菌分裝。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的神經(jīng)細(xì)胞提取物，其特征在于，步驟(1)的神經(jīng)細(xì)胞組織中加入1-4倍生理鹽水稀釋再勻漿。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的神經(jīng)細(xì)胞提取物，其特征在于，步驟(5)的分離方法是用過濾膜在正壓或負(fù)壓條件下過濾。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的神經(jīng)細(xì)胞提取物，其特征在于，步驟(5)的分離方法是用過濾膜在正壓或負(fù)壓條件下過濾。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2或5所述的神經(jīng)細(xì)胞提取物，其特征在于，所述動物是哺乳動物。
7.權(quán)利要求1的神經(jīng)細(xì)胞提取物在間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化中的應(yīng)用，是體外間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是在制備試劑盒中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述試劑盒的應(yīng)用是基礎(chǔ)培養(yǎng)基選自DMEM與F12的混合培養(yǎng)基的試劑盒的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述試劑盒的應(yīng)用是基礎(chǔ)培養(yǎng)基和卵細(xì)胞提取物和/或神經(jīng)細(xì)胞提取物制備的試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及人或動物神經(jīng)細(xì)胞提取物及其在體外間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞中的應(yīng)用，為間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù)提供了新的誘導(dǎo)試劑，是神經(jīng)細(xì)胞組織→去除血細(xì)胞結(jié)締組織及被膜等→細(xì)胞勻漿→細(xì)胞破碎→沉淀→取上清液→分離去除分子量大于20萬道爾頓(Da)以上的物質(zhì)→分裝而得，本發(fā)明所述的應(yīng)用可以是神經(jīng)細(xì)胞提取物與現(xiàn)有技術(shù)有機(jī)結(jié)合的應(yīng)用，也可以是制備為試劑盒的應(yīng)用。在間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的應(yīng)用中顯示出良好的誘導(dǎo)分化率為90％以上。誘導(dǎo)分化的神經(jīng)細(xì)胞可以用來移植治療多種神經(jīng)性疾病，在臨床有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N5/06GK1570088SQ200410044418
公開日2005年1月26日 申請日期2004年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月10日
發(fā)明者潘興華, 龐榮清, 李俊, 陸家海 申請人:成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院, 潘興華