專利名稱：新的細(xì)胞及其在制備天麻素中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的來自植物的細(xì)胞，其在制備天麻素中的用途及制備天麻素的方法。進(jìn)一步講，本發(fā)明的植物細(xì)胞來自茄科曼陀羅屬，尤其是白花曼陀羅和紫花曼陀羅。
背景技術(shù)：
天麻素(對羥基甲基苯-β-O-吡喃葡糖甙)是天麻的主要活性成分，具有鎮(zhèn)靜、抗炎、抗驚厥、鎮(zhèn)痛及增強(qiáng)機(jī)體免疫功能作用。天麻素現(xiàn)已通過化學(xué)合成制備且人工合成的天麻素具有與天然來源的天麻素相同的生物或藥理活性。但現(xiàn)有的化合合成天麻素工藝存在著制備成本高，所用原料易燃，環(huán)境易受污染，經(jīng)濟(jì)效益差等缺陷。因此開發(fā)新的經(jīng)濟(jì)、安全、無污染且高效的天麻素制備方法是十分必要的。戴均貴等(2001，2002)研究了桔梗和長春花懸浮培養(yǎng)對天麻素的生物轉(zhuǎn)化，其利用培養(yǎng)液中的生物酶去除天麻素分子結(jié)構(gòu)中的葡萄糖基，將天麻素轉(zhuǎn)化為對羥基苯甲醇，然后再化學(xué)合成天麻素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是開發(fā)新的合成天麻素方法。本發(fā)明經(jīng)研究現(xiàn)已出人意料地發(fā)現(xiàn)通過對茄科曼陀羅屬中的白花曼陀羅和紫花曼陀羅進(jìn)行細(xì)胞水平上的選擇性培養(yǎng)，得到了能將對羥基苯甲醛或?qū)αu基苯甲醇直接有效轉(zhuǎn)化為天麻素的高活性細(xì)胞(株)，該高活性細(xì)胞(株)保藏在中國微生素菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.1122和CGMCC No.1123。
因此，本發(fā)明第一方面涉及細(xì)胞(株)，其保藏號為CGMCC No.1122和/或CGMCC No.1123。
本發(fā)明再一方面涉及細(xì)胞(株)CGMCC No.1122和/或CGMCC No.1123在制備天麻素中的用途。
本發(fā)明再一方面涉及制備天麻素的方法，其包括在液體培養(yǎng)基存在下，將細(xì)胞(株)CGMCC No.1122和/或CGMCC No.1123與對羥基苯甲醛或?qū)αu基苯甲醇接觸。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明中所述的液體培養(yǎng)基可是對本發(fā)明細(xì)胞(株)CGMCC No.1122和/或CGMCC No.1123活性無影響的任何液體培養(yǎng)基，其包括但不限于LS液體培養(yǎng)基，等。
根據(jù)本發(fā)明，在用本發(fā)明細(xì)胞(株)CGMCC No.1122和/或CGMCCNo.1123制備天麻素過程中，溫度通常為環(huán)境溫度，如20-25℃。在天麻素用生成后，可用能溶解天麻素有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑與水的混合物提取轉(zhuǎn)化液中的天麻素，然后用色譜法，如硅膠柱層析，高壓液相色譜，大孔樹脂等對提取液中天麻素進(jìn)行進(jìn)一步分離。其中作用有機(jī)溶劑包括但不限于直鏈或支鏈C1-6烷基醇，丙酮，二氯甲烷，氯仿，乙腈等；C1-6烷基醇舉例講有甲醇，乙醇，丙醇，正丁醇等。分離后的天麻素，可進(jìn)行重結(jié)晶。
根據(jù)本發(fā)明，在用細(xì)胞(株)(CGMCC No.1122和/或CGMCC No.1123)制備天麻素過程中，可先將液體培養(yǎng)基如LS與細(xì)胞(株)(CGMCCNo.1122和/或CGMCC No.1123)混合并在搖床中旋轉(zhuǎn)4-5天，搖床轉(zhuǎn)速為100-120轉(zhuǎn)/分鐘，然后再加入對羥基苯甲醛或?qū)αu基苯甲醇；或者將液體培養(yǎng)基與細(xì)胞(株)(CGMCC No.1122和/或CGMCC No.1123)及對羥基苯甲醛或?qū)αu基苯甲醇同時在搖床中混合并旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速可為100-120轉(zhuǎn)/分鐘。但以上這些因素如原料的混合順序，搖床的轉(zhuǎn)速，溫度，提取方式等對用細(xì)胞(株)CGMCC No.1122和/或CGMCC No.1123能否將對羥基苯甲醛或?qū)αu基苯甲醇轉(zhuǎn)化為天麻素是可選擇或變化的。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明中所用原料如對羥基苯甲醛或?qū)αu基苯甲醇或液體培養(yǎng)基LS都是已知的，并可按本領(lǐng)域已知方法制備或可從市場上買到。
下面的實(shí)施例用來進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明，但其不意味著本發(fā)明僅限于此。
實(shí)施例1.天麻素的制備在250ml三角瓶中加入100ml LS液體培養(yǎng)基和15g細(xì)胞(株)(CGMCC No.1122)，再加入70.00mg對羥基苯甲醛于室溫在搖床旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)12天，轉(zhuǎn)速100-120轉(zhuǎn)/分鐘。用正丁醇提取轉(zhuǎn)化液，然后濃縮正丁醇提取液，濃縮后殘余物在硅膠柱層析上層析，用三氯甲烷∶甲醇(9∶1，v/v)洗脫，濃縮洗脫液，得天麻素粗品，用三氯甲烷∶甲醇(9∶1，v/v)重結(jié)晶，得天麻素56.66mg，產(chǎn)率80.95％，熔點(diǎn)154-156℃。
實(shí)施例2.天麻素的制備在250ml三角瓶中加入100ml LS液體培養(yǎng)基和15g細(xì)胞(株)(CGMCC No.1122)，于室溫在搖床中旋轉(zhuǎn)4-5天，轉(zhuǎn)速100-120轉(zhuǎn)/分鐘，然后再加入30.00mg對羥基苯甲醛于室溫在搖床旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)10天，轉(zhuǎn)速100-120轉(zhuǎn)/分鐘。用正丁醇提取轉(zhuǎn)化液，然后濃縮正丁醇提取液，濃縮后殘余物在硅膠柱層析上層析，用三氯甲烷∶甲醇(9∶1，v/v)洗脫，濃縮洗脫液，得天麻素粗品，用三氯甲烷∶甲醇(9∶1，v/v)重結(jié)晶，得天麻素24.89mg，產(chǎn)率82.96％，熔點(diǎn)154-156℃。
實(shí)施例3.天麻素的制備在250ml三角瓶中加入100ml LS液體培養(yǎng)基和10g細(xì)胞(株)(CGMCC No.1123)，于室溫在搖床中旋轉(zhuǎn)4-5天，轉(zhuǎn)速100-120轉(zhuǎn)/分鐘，然后再加入30.00mg對羥基苯甲醛于室溫在搖床旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)10天，轉(zhuǎn)速100-120轉(zhuǎn)/分鐘。用正丁醇提取轉(zhuǎn)化液，然后濃縮正丁醇提取液，濃縮后殘余物在硅膠柱層析上層析，用三氯甲烷∶甲醇(9∶1，v/v)洗脫，濃縮洗脫液，得天麻素粗品，用三氯甲烷∶甲醇(9∶1，v/v)重結(jié)晶，得天麻素25.80mg，產(chǎn)率86.00％，熔點(diǎn)154-156℃。
實(shí)施例4.天麻素制備用對羥基苯甲醇為原料。
在500ml三角瓶中加入300ml LS液體培養(yǎng)基和100g細(xì)胞(株)(CGMCC No.1123)，于室溫在搖床中旋轉(zhuǎn)4-5天，轉(zhuǎn)速100-120轉(zhuǎn)/分鐘，然后再加入40.00mg對羥基苯甲醛于室溫在搖床旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)10天，轉(zhuǎn)速100-120轉(zhuǎn)/分鐘。用正丁醇提取轉(zhuǎn)化液，然后濃縮正丁醇提取液，濃縮后殘余物在硅膠柱層析上層析，用三氯甲烷∶甲醇(9∶1，v/v)洗脫，濃縮洗脫液，得天麻素粗品，用三氯甲烷∶甲醇(9∶1，v/v)重結(jié)晶，得天麻素30.00mg，產(chǎn)率75.00％，熔點(diǎn)154-156℃。
實(shí)施例5.天麻素制備用對羥基苯甲醇為原料。
在2000ml三角瓶中加入1700ml LS液體培養(yǎng)基和350g細(xì)胞(株)(CGMCC No.1123)，于室溫在搖床中旋轉(zhuǎn)4-5天，轉(zhuǎn)速100-120轉(zhuǎn)/分鐘，然后再加入900.00mg對羥基苯甲醛于室溫在搖床旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)10天，轉(zhuǎn)速100-120轉(zhuǎn)/分鐘。用正丁醇提取轉(zhuǎn)化液，然后濃縮正丁醇提取液，濃縮后殘余物在硅膠柱層析上層析，用三氯甲烷∶甲醇(9∶1，v/v)洗脫，濃縮洗脫液，得天麻素粗品，用三氯甲烷∶甲醇(9∶1，v/v)重結(jié)晶，得天麻素240.00mg，產(chǎn)率27.00％，熔點(diǎn)154-156℃。
權(quán)利要求
1.細(xì)胞(株)CGMCC No.1122和/或CGMCC No.1123。
2.細(xì)胞(株)CGMCC No.1122和/或CGMCC No.1123在制備天麻素中的用途。
3.天麻素的制備方法，其包括在液體培養(yǎng)基存在下，將細(xì)胞(株)CGMCC No.1122和/或CGMCC No.1123與對羥基苯甲醛或?qū)αu基苯甲醇接觸。
4.權(quán)利要求1的細(xì)胞(株)，其中所述細(xì)胞株來自曼陀羅屬。
5.權(quán)利要求1的細(xì)胞(株)，其中所述細(xì)胞株來自白花曼陀羅或紫花曼陀羅。
6.權(quán)利要求2的用途，其中所述細(xì)胞株來自曼陀羅屬。
7.權(quán)利要求2的用途，其中所述細(xì)胞株來自白花曼陀羅或紫花曼陀羅。
8.權(quán)利要求3的方法，其中液體培養(yǎng)基為LS。
9.權(quán)利要求3的方法，其中所述細(xì)胞株來自曼陀羅屬。
10.權(quán)利要求3的方法，其中所述細(xì)胞株來自白花曼陀羅或紫花曼陀羅。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的來自植物的細(xì)胞，其在制備天麻素中的用途及制備天麻素的方法。進(jìn)一步講，本發(fā)明的植物細(xì)胞來自茄科曼陀羅屬，尤其是白花曼陀羅和紫花曼陀羅。
文檔編號C12P19/00GK1676601SQ200410029828
公開日2005年10月5日 申請日期2004年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月29日
發(fā)明者龔加順 申請人:昆明制藥集團(tuán)股份有限公司