專利名稱：一種單細(xì)胞凋亡dna片段化檢測用微流控芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微全分析技術(shù)，特別提供了一種單細(xì)胞凋亡DNA片段化檢測用微流控芯片。
背景技術(shù)：
細(xì)胞凋亡是機(jī)體生長發(fā)育、細(xì)胞分化和病理狀態(tài)中細(xì)胞自主性死亡的過程。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞生長、分化一樣屬于各具特征的細(xì)胞事件或過程，它們決定著細(xì)胞和組織的基本特征和命運(yùn)。由于細(xì)胞凋亡在正常胚胎和器官的發(fā)育、免疫反應(yīng)以及許多長期困擾人類的重大疾病如腫瘤、免疫缺陷與神經(jīng)退行性變等疾病發(fā)生過程中具有舉足輕重的作用，近幾年來，它已成為生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)。基于細(xì)胞凋亡異常在許多惡性腫瘤發(fā)病學(xué)上的重要地位，以選擇性的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡為目的的凋亡干預(yù)技術(shù)已成為治療惡性腫瘤的基本策略。
大量研究表明，細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)途徑的實(shí)質(zhì)是一套連續(xù)的生化反應(yīng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)使細(xì)胞外刺激和細(xì)胞內(nèi)應(yīng)答以及細(xì)胞凋亡效應(yīng)之間偶聯(lián)，調(diào)控著細(xì)胞的生命。這些作用的最終結(jié)局表現(xiàn)為一系列細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化和生化改變，其中由核酸內(nèi)切酶激活所致的染色質(zhì)DNA片段化是細(xì)胞凋亡最重要和最具特征性的生化指標(biāo)。傳統(tǒng)的分析方法包括瓊脂糖平板電泳和毛細(xì)管電泳技術(shù)。前者只能對大量群體細(xì)胞進(jìn)行總體分析(至少1×106細(xì)胞)，其分辨率、靈敏度均較低，且操作過程繁瑣、分析過程難以集成化。后者雖可在毛細(xì)管電泳進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞分析，但所需時(shí)間相對較長，集成化程度不高。這些局限性在一定程度上限制了對細(xì)胞凋亡過程更深入、更全面的研究和認(rèn)識。
微流控芯片技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一項(xiàng)嶄新的分析技術(shù)，它具有單細(xì)胞水平對細(xì)胞進(jìn)行操作的優(yōu)勢，它為在同一芯片上將細(xì)胞培養(yǎng)，輸運(yùn)，清洗和電泳分離等過程集成一體提供了可能性。同時(shí)，微流控芯片的流體網(wǎng)絡(luò)特征(二維或三維)，使之有可能對細(xì)胞進(jìn)行更為復(fù)雜的物理或化學(xué)分析，配合高靈敏度的檢測器可使該技術(shù)為單細(xì)胞水平研究復(fù)雜的細(xì)胞生物學(xué)過程提供強(qiáng)大的技術(shù)支撐。
目前，國際上僅有一個(gè)實(shí)驗(yàn)室報(bào)道利用芯片技術(shù)進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞DNA片段化分析，檢測對象為細(xì)胞內(nèi)單鏈DNA，但由于受所采用細(xì)胞裂解方式(氫氧化鈉)的限制，分析過程相對較長，且沒有芯片通道內(nèi)對單細(xì)胞的連續(xù)操作過程，分析通量相對較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在微流控芯片上以集成方式實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的進(jìn)樣、裂解、片斷化DNA標(biāo)記、凋亡細(xì)胞DNA片段化電泳分離及檢測。特別提供了一種單細(xì)胞凋亡DNA片段化檢測用微流控芯片。
本發(fā)明一種單細(xì)胞凋亡DNA片段化檢測用微流控芯片，其特征在于該芯片由三個(gè)基本功能單元構(gòu)成，其中第三個(gè)基本功能單元分別和另外兩個(gè)單元連接第一個(gè)基本單元是細(xì)胞進(jìn)樣單元；
第二個(gè)基本單元是細(xì)胞的裂解液進(jìn)樣單元；第三個(gè)基本單元是細(xì)胞裂解、片段化DNA標(biāo)記、DNA片段化分離及檢測單元。
本發(fā)明一種單細(xì)胞凋亡DNA片段化檢測用微流控芯片，其特征在于所述第一個(gè)基本單元所用的進(jìn)樣溶液細(xì)胞密度是104～106/mL；采用低電場電驅(qū)動(dòng)細(xì)胞進(jìn)樣，進(jìn)樣電壓為10～100V/cm。
本發(fā)明一種單細(xì)胞凋亡DNA片段化檢測用微流控芯片，其特征在于所述第二個(gè)基本單元采用低電場電驅(qū)動(dòng)細(xì)胞裂解液進(jìn)樣，進(jìn)樣電壓為10～100V/cm。
本發(fā)明一種單細(xì)胞凋亡DNA片段化檢測用微流控芯片，其特征在于所述第三個(gè)基本單元是芯片緩沖液池和廢液池之間的連接通道細(xì)胞裂解采用化學(xué)裂解方法，凋亡細(xì)胞裂解在芯片通道內(nèi)在線完成。
DNA片段化分離所用的篩分介質(zhì)是0.5％～5％羥丙基甲基纖維素50cp，粘度5～30kD，DNA片段化電泳分離為100～250V/cm。
本發(fā)明一種單細(xì)胞凋亡DNA片段化檢測用微流控芯片，其特征在于所述第三個(gè)基本單元是通過激光誘導(dǎo)熒光單點(diǎn)法檢測實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明一種單細(xì)胞凋亡DNA片段化檢測用微流控芯片，其特征在于所述片段化DNA標(biāo)記所用標(biāo)記染料是預(yù)先加在運(yùn)行緩沖液或細(xì)胞裂解液中的熒光染料；熒光染料的激發(fā)波長、發(fā)射波長與激光誘導(dǎo)熒光檢測用激光器的激光波長相適應(yīng)。
本發(fā)明一種單細(xì)胞凋亡DNA片段化檢測用微流控芯片，其特征在于對片段化DNA進(jìn)行在線動(dòng)態(tài)標(biāo)記所采用的標(biāo)記染料濃度是1uM。
本發(fā)明一種單細(xì)胞凋亡DNA片段化檢測用微流控芯片，其特征在于所述DNA片段化分離的分離電壓為170V/cm。
本發(fā)明一種單細(xì)胞凋亡DNA片段化檢測用微流控芯片，其特征在于所述檢測位置在反應(yīng)通道中的裂解液進(jìn)樣通道和細(xì)胞進(jìn)樣通道之間，與裂解液進(jìn)樣通道和細(xì)胞進(jìn)樣通道的距離之比為1比2。
本發(fā)明一種單細(xì)胞凋亡DNA片段化檢測用微流控芯片，其特征在于所述芯片為雙T型結(jié)構(gòu)，其由以下幾個(gè)部分組成緩沖液池(1)、細(xì)胞進(jìn)樣池(2)、裂解液進(jìn)樣池(3)、廢液池(4)、檢測區(qū)域(5)；雙T型結(jié)構(gòu)芯片的各個(gè)溶液池之間由通道連接，通道直徑與所研究的細(xì)胞大小相適應(yīng)，并能保證容納單個(gè)細(xì)胞的運(yùn)輸；芯片的雙T型結(jié)構(gòu)與權(quán)利要求1中所述各基本功能單元相對應(yīng)細(xì)胞進(jìn)樣池(2)對應(yīng)第一個(gè)基本單元；裂解液進(jìn)樣池(3)對應(yīng)第二個(gè)基本單元；細(xì)胞進(jìn)樣池與裂解液進(jìn)樣池之間的反應(yīng)通道對應(yīng)第三個(gè)基本單元。
本發(fā)明適用于對引起細(xì)胞凋亡各種致凋亡因子的篩選，以及不同類型細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞、神經(jīng)元、及胚胎等多種細(xì)胞凋亡的檢測。本發(fā)明操作方便易行，將細(xì)胞進(jìn)樣、裂解、片斷化DNA標(biāo)記、DNA片段化分離、檢測過程集成在一塊微流控芯片上完成，而且具有較高的分析通量和分析效率，在細(xì)胞生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有重大的潛在價(jià)值。


圖1單細(xì)胞凋亡DNA片段化檢測用微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖；圖2芯片電泳圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本實(shí)施例藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡模型的構(gòu)建以人急性早幼粒白細(xì)胞系(NB4cells)為對象，細(xì)胞培養(yǎng)于含10％新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中。用具代表性的抗腫瘤藥物(三氧化二砷，As2O3)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。將一定濃度的As2O3加入細(xì)胞培養(yǎng)液中使藥物終濃度為1uM，然后繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。收集細(xì)胞，于1000rpm離心5分鐘后用PBS溶液清洗一次，再經(jīng)重懸后待用。
2芯片設(shè)計(jì)本實(shí)施例所采用芯片設(shè)計(jì)如附圖1所示，芯片為雙T型結(jié)構(gòu)，芯片分離通道寬50微米，深20微米。因?yàn)椴溉轭惣?xì)胞的大小通常在10-25um直徑大小范圍，所設(shè)計(jì)芯片分離通道直徑與細(xì)胞大小在一個(gè)數(shù)量級，并能保證容納單個(gè)細(xì)胞的運(yùn)輸。圖中四個(gè)圓孔分別代表不同溶液池，其中1，4為緩沖液和廢液池，2和3分別為細(xì)胞進(jìn)樣池和裂解液進(jìn)樣池，檢測區(qū)域在1，4之間的連接通道內(nèi)。
芯片的雙T型結(jié)構(gòu)與芯片的各基本功能單元相對應(yīng)細(xì)胞進(jìn)樣池(2)對應(yīng)細(xì)胞進(jìn)樣單元；裂解液進(jìn)樣池對應(yīng)裂解液進(jìn)樣單元；細(xì)胞進(jìn)樣池與裂解液進(jìn)樣池之間的反應(yīng)通道對應(yīng)細(xì)胞裂解、片段化DNA標(biāo)記、DNA片段化分離及檢測單元。
3細(xì)胞裂解方式和片段化DNA標(biāo)記方式在低電場驅(qū)動(dòng)下(50V/cm)，經(jīng)藥物處理的細(xì)胞和細(xì)胞裂解液(2％SDS)分別由池2和3進(jìn)樣，當(dāng)進(jìn)入分離通道時(shí)，細(xì)胞與裂解液混合，在10ms左右細(xì)胞迅速裂解。裂解后釋放的片段化DNA與運(yùn)行緩沖液中的熒光染料結(jié)合，進(jìn)行在線動(dòng)態(tài)標(biāo)記。所采用的最佳染料標(biāo)記濃度為1uM。有效標(biāo)記后的DNA片段在分離電場和篩分介質(zhì)的作用下，在檢測區(qū)域通過激光誘導(dǎo)熒光單點(diǎn)法實(shí)現(xiàn)檢測。實(shí)驗(yàn)中所用細(xì)胞密度在105/mL左右，可避免高密度細(xì)胞懸液中細(xì)胞之間發(fā)生粘連，影響單個(gè)細(xì)胞在通道中的運(yùn)行。
4DNA片段化芯片電泳分離條件a.篩分介質(zhì)本實(shí)施例中所用運(yùn)行緩沖液中的主要有效成分即篩分介質(zhì)為自行優(yōu)化所得的1.5％羥丙基甲基纖維素50cp(1.5％HPMC-50cp，粘度15kD)，該篩分介質(zhì)與常規(guī)介質(zhì)相比黏度較低，特別適合于微流控芯片通道的微小尺寸，通道清洗方便，易于更換溶液，并可滿足于細(xì)胞凋亡過程中芯片DNA片段化的分離要求。
b.分離電壓芯片電泳過程中，分離電壓的選擇直接影響到片段化DNA的分離質(zhì)量，高分離電壓顯著降低分離效果(＞250V/cm)，而低電壓則明顯延長分離時(shí)間(＜100V/cm)，不利于快速分析。本實(shí)施例經(jīng)優(yōu)化的最佳分離電壓為170V/cm。
5.凋亡細(xì)胞電泳結(jié)果如附圖2所示，經(jīng)As2O3作用后的NB4細(xì)胞發(fā)生凋亡，出現(xiàn)DNA片段化，并可經(jīng)芯片電泳檢測。圖中的前3個(gè)小峰為片段化DNA，與DNA標(biāo)準(zhǔn)品比較后確認(rèn)片段大小為180bp、360bp和540bp，第4個(gè)最高峰為基因組DNA。
權(quán)利要求
1.一種單細(xì)胞凋亡DNA片段化檢測用微流控芯片，其特征在于該芯片由三個(gè)基本功能單元構(gòu)成，其中第三個(gè)基本功能單元分別和另外兩個(gè)單元連接第一個(gè)基本單元是細(xì)胞進(jìn)樣單元；第二個(gè)基本單元是細(xì)胞的裂解液進(jìn)樣單元；第三個(gè)基本單元是細(xì)胞裂解、片段化DNA標(biāo)記、DNA片段化分離及檢測單元。
2.按照權(quán)利要求1所述一種單細(xì)胞凋亡DNA片段化檢測用微流控芯片，其特征在于所述第一個(gè)基本單元所用的進(jìn)樣溶液細(xì)胞密度是104～106/mL；采用低電場電驅(qū)動(dòng)細(xì)胞進(jìn)樣，進(jìn)樣電壓為10～100V/cm。
3.按照權(quán)利要求1所述一種單細(xì)胞凋亡DNA片段化檢測用微流控芯片，其特征在于所述第二個(gè)基本單元采用低電場電驅(qū)動(dòng)細(xì)胞裂解液進(jìn)樣，進(jìn)樣電壓為10～100V/cm。
4.按照權(quán)利要求1所述一種單細(xì)胞凋亡DNA片段化檢測用微流控芯片，其特征在于所述第三個(gè)基本單元是芯片緩沖液池和廢液池之間的連接通道DNA片段化分離所用的篩分介質(zhì)是0.5％～5％羥丙基甲基纖維素50cp，粘度5～30kD，DNA片段化電泳分離為100～250V/cm。
5.按照權(quán)利要求1所述一種單細(xì)胞凋亡DNA片段化檢測用微流控芯片，其特征在于所述第三個(gè)基本單元是通過激光誘導(dǎo)熒光單點(diǎn)法檢測實(shí)現(xiàn)的。
6.按照權(quán)利要求1所述一種單細(xì)胞凋亡DNA片段化檢測用微流控芯片，其特征在于所述片段化DNA標(biāo)記所用標(biāo)記染料是預(yù)先加在運(yùn)行緩沖液或細(xì)胞裂解液中的熒光染料；熒光染料的激發(fā)波長、發(fā)射波長與激光誘導(dǎo)熒光檢測用激光器的激光波長相適應(yīng)。
7.按照權(quán)利要求1或6所述一種單細(xì)胞凋亡DNA片段化檢測用微流控芯片，其特征在于對片段化DNA進(jìn)行在線動(dòng)態(tài)標(biāo)記所采用的標(biāo)記染料濃度是1uM。
8.按照權(quán)利要求1或4所述一種單細(xì)胞凋亡DNA片段化檢測用微流控芯片，其特征在于所述DNA片段化分離的分離電壓為170V/cm。
9.按照權(quán)利要求1或5所述一種單細(xì)胞凋亡DNA片段化檢測用微流控芯片，其特征在于所述檢測位置在反應(yīng)通道中的裂解液進(jìn)樣通道和細(xì)胞進(jìn)樣通道之間，與裂解液進(jìn)樣通道和細(xì)胞進(jìn)樣通道的距離之比為1比2。
10.按照權(quán)利要求1所述一種單細(xì)胞凋亡DNA片段化檢測用微流控芯片，其特征在于所述芯片為雙T型結(jié)構(gòu)，其由以下幾個(gè)部分組成緩沖液池(1)、細(xì)胞進(jìn)樣池(2)、裂解液進(jìn)樣池(3)、廢液池(4)、檢測區(qū)域(5)；雙T型結(jié)構(gòu)芯片的各個(gè)溶液池之間由通道連接，通道直徑與所研究的細(xì)胞大小相適應(yīng)，并能保證容納單個(gè)細(xì)胞的運(yùn)輸；芯片的雙T型結(jié)構(gòu)與權(quán)利要求1中所述各基本功能單元相對應(yīng)細(xì)胞進(jìn)樣池(2)對應(yīng)第一個(gè)基本單元；裂解液進(jìn)樣池(3)對應(yīng)第二個(gè)基本單元；細(xì)胞進(jìn)樣池與裂解液進(jìn)樣池之間的反應(yīng)通道對應(yīng)第三個(gè)基本單元。
全文摘要
本發(fā)明特別提供了一種單細(xì)胞凋亡DNA片段化檢測用微流控芯片，主要涉及在微流控芯片上以集成方式實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的進(jìn)樣、裂解、片段化DNA標(biāo)記、凋亡細(xì)胞DNA片段化電泳分離及檢測等功能。芯片各功能單元與芯片結(jié)構(gòu)相對應(yīng)。芯片為雙T型結(jié)構(gòu)，由緩沖液池、細(xì)胞進(jìn)樣池、裂解液池、廢液池、檢測區(qū)域組成，各溶液池由通道連接，通道直徑與所研究細(xì)胞的大小相適應(yīng)，并能保證容納單細(xì)胞運(yùn)輸。本發(fā)明用于篩選引起細(xì)胞凋亡各種致凋亡因子及檢測不同類型細(xì)胞的凋亡。本發(fā)明操作方便易行，將各實(shí)驗(yàn)功能集成在一塊微流控芯片上實(shí)現(xiàn)，而且具有較高的分析通量和分析效率，在細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域具有極其重大的潛在價(jià)值。
文檔編號C12Q1/68GK1712540SQ20041002075
公開日2005年12月28日 申請日期2004年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月15日
發(fā)明者林炳承, 秦建華, 蓋宏偉, 於林芬, 葉囡楠, 劉欣 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所