專(zhuān)利名稱(chēng)：從大豆食用油中提取用于轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本方法涉及深度加工食品中轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)技術(shù)，尤其是從以大豆為原料的食用油中提取用于轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的模板DNA的方法。
背景技術(shù)：
隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，大量以轉(zhuǎn)基因作物為加工原料的轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)入商品化生產(chǎn)和銷(xiāo)售，據(jù)國(guó)際權(quán)威機(jī)構(gòu)統(tǒng)計(jì)，全球由轉(zhuǎn)基因作物加工生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因食品和食品成分達(dá)4000余種(參見(jiàn)U.S.Food and Drug Administration，Office of Food AdditiveSafety.List of Completed Consultations on Bioengineering Food[DB/OL].http://www.fda-cfsan/biotechnology.2002-10.)。全球主要種植的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物為大豆，種植面積達(dá)3330萬(wàn)公頃，占轉(zhuǎn)基因作物總種植面積的63％。由于轉(zhuǎn)基因大豆出油率高，制油成本低，各發(fā)展中國(guó)家紛紛進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆作為制油原料。目前對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的安全性尚有爭(zhēng)議，其潛在的風(fēng)險(xiǎn)引起世界各國(guó)政府極大關(guān)注，因此紛紛出臺(tái)轉(zhuǎn)基因食品的標(biāo)簽管理制度和出入境產(chǎn)品報(bào)告制度。聯(lián)合國(guó)和歐盟的要求更為嚴(yán)格，規(guī)定轉(zhuǎn)基因食品從研究、生產(chǎn)、運(yùn)輸、貯存、銷(xiāo)售到進(jìn)出口等所有環(huán)節(jié)都需要檢測(cè)監(jiān)控，因此轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)鑒定成為各主要貿(mào)易國(guó)檢驗(yàn)的一項(xiàng)重要工作，并建立相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)體系，以適應(yīng)于各種轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)(參見(jiàn)朱光富，世界各國(guó)對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的態(tài)度和管理，糧油食品科技，2001，31-5)。
由于食用油生產(chǎn)需經(jīng)過(guò)240℃高溫和高壓等處理過(guò)程，產(chǎn)品中的核酸成分(DNA)降解為長(zhǎng)度較短、大小不一的DNA片段，這給DNA提取造成很大困難。而DNA提取技術(shù)仍然是基于DNA擴(kuò)增的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)的瓶頸，是轉(zhuǎn)基因檢測(cè)成功與否的關(guān)鍵所在，因此開(kāi)發(fā)針對(duì)以大豆為原料的大豆油轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的模板DNA提取技術(shù)是實(shí)現(xiàn)食用油進(jìn)出口檢驗(yàn)和市場(chǎng)準(zhǔn)入的重要保證。
目前國(guó)內(nèi)十分缺乏有針對(duì)性和可操作的食用油脂，特別是DNA含量極低的色拉油的模板DNA提取技術(shù)，嚴(yán)重制約了這些產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。本發(fā)明現(xiàn)已解決了這一檢測(cè)技術(shù)難題。

發(fā)明內(nèi)容
本方法旨在建立從轉(zhuǎn)基因大豆為原料加工而成的食用油中提取模板DNA，用于轉(zhuǎn)基因成分的PCR檢測(cè)。
本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)中的難題，提供靈敏度高可操作的一種從DNA含量極低的大豆色拉油中提取用于轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的DNA的方法，以便建立快速、簡(jiǎn)便、可靠、高效率、低成本的以大豆為原料的食用油的模板DNA提取方法，用于轉(zhuǎn)基因成分的定性檢測(cè)，以確保檢測(cè)的可靠性。
本方法針對(duì)食用油經(jīng)過(guò)高溫高壓的嚴(yán)酷條件加工后，其中水溶性的DNA分子含量極低、降解嚴(yán)重的特點(diǎn)，在進(jìn)入DNA提取時(shí)，必須將含量極低的水溶性成分(包括部分已游離出來(lái)的DNA分子)從脂溶性油脂中充分游離出來(lái)，再利用溴代十六烷基三甲胺提取液在室溫使DNA分子從細(xì)胞中充分釋放出來(lái)，這是從油脂中提取DNA的第一個(gè)關(guān)鍵；而利用等體積異丙醇和1/10體積的乙酸鈉經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間沉淀，使含量極低的小分子DNA充分沉淀下來(lái)，是進(jìn)一步濃縮DNA分子的第二個(gè)關(guān)鍵。此方法快速、簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)，效率高、成本低，適合以大豆為原料的深度加工食用油中轉(zhuǎn)基因成分的定性檢測(cè)。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下從以大豆為原料的食用油中提取用于轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的DNA的方法，它由下述步驟組成1.取20-30mL樣品，加入20-30mL正己烷或石油醚，20-25℃于磁力攪拌器上攪拌2～3小時(shí)。
2.加入40-60mL TE緩沖液，繼續(xù)在20-25℃于磁力攪拌器上攪拌6-15小時(shí)，然后于4℃，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15-20分鐘，小心去除油相。
3.加入等體積的溴代十六烷基三甲胺提取緩沖液，混勻，20-25℃放置3～6小時(shí)，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，取上清。
4.加入等體積的異丙醇和10％的3mol/L乙酸鈉，混勻，20-25℃靜置6-15小時(shí)，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，留沉淀。
5.加入1mL TE緩沖液溶解沉淀，加入等體積的體積比為24∶1的三氯甲烷∶異戊醇，緩慢顛倒搖勻5分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，取上清。
6.加入1/10體積的3mol/L乙酸鈉和等體積的4℃預(yù)冷的異丙醇，緩慢混勻，4℃靜置6-15小時(shí)。
7.于4℃，14000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15分鐘，棄上清。
8.用400μL 4℃預(yù)冷的70％乙醇洗滌沉淀，除去殘留的乙醇，干燥沉淀，得到DNA沉淀。
9.加入25-35μL經(jīng)滅菌的去離子水溶解從食用油中提取的DNA沉淀。
優(yōu)選地，本發(fā)明中從以大豆為原料的食用油中提取用于轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的DNA的方法如下1.取25mL樣品，加入25mL正己烷或石油醚，20-25℃于磁力攪拌器上攪拌2～3小時(shí)。
2.加入50mL TE緩沖液，繼續(xù)在20-25℃于磁力攪拌器上攪拌12小時(shí)，然后于4℃，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15-20分鐘，小心去除油相。
3.加入等體積的溴代十六烷基三甲胺提取緩沖液，混勻，20-25℃放置6小時(shí)，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，取上清。
4.加入等體積的異丙醇和1/10體積的3mol/L乙酸鈉，混勻，20-25℃靜置12小時(shí)，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，棄上清，留沉淀。
5.加入1mL TE緩沖液溶解沉淀，加入等體積的體積比為24∶1的三氯甲烷∶異戊醇，緩慢顛倒搖勻5分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，取上清。
6.加入等體積的異丙醇和1/10體積的3mol/L乙酸鈉，混勻，20-25℃靜置12小時(shí)，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，棄上清，留沉淀。
7.于4℃，14000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15分鐘，棄上清，留沉淀。
8.用400μL 4℃預(yù)冷的70％乙醇洗滌沉淀，除去殘留的乙醇，干燥沉淀，得到DNA沉淀。
9.加入30μL經(jīng)滅菌的去離子水溶解從食用油中提取的DNA沉淀。
本發(fā)明的有益效果是提供了一種從DNA分子含量極低的食用油中轉(zhuǎn)基因成分的定性檢測(cè)方法，該方法快速、簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)，效率高、成本低，適合以大豆為原料的深度加工食用油中轉(zhuǎn)基因成分的定性檢測(cè)。


圖1 福臨門(mén)大豆色拉油DNA的內(nèi)源特異參照Lectin基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果(1.DNA Marker；2.大豆種子對(duì)照；3.福臨門(mén)大豆色拉油)圖2 金龍魚(yú)大豆色拉油DNA的內(nèi)源特異參照Lectin基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果(1.DNA Marker；2.大豆種子對(duì)照；3.金龍魚(yú)大豆色拉油)具體實(shí)施方式
1.材料和試劑1)材料大豆油樣品購(gòu)自超級(jí)市場(chǎng)，對(duì)照為大豆種子。
2)提取試劑DNA提取緩沖液(1L)1000ml水中溶解溴代十六烷基三甲胺20g，Tris 12.114g，NaCl 81.816g，Na2EDTA 7.444g，聚乙烯吡咯烷酮20g，高壓滅菌；乙酸鈉溶液(3mol/L)800ml水中溶解408.1g三水乙酸鈉，用冰乙酸調(diào)pH至5.2，加水定容至1L，高壓滅菌；TE緩沖液Tris 0.01mol/L，Na2EDTA 1.0mmol/L，用鹽酸調(diào)pH至8.0，高壓滅菌；正己烷；石油醚；三氯甲烷∶異戊醇(24∶1)；70％乙醇；異丙醇；去離子無(wú)菌水。
2.DNA提取的流程(1)取25mL樣品，加入25mL正己烷或石油醚，混勻，室溫，于磁力攪拌器上攪拌2～3小時(shí)。
(2)加入50mL TE緩沖液，繼續(xù)在室溫于磁力攪拌器上攪拌過(guò)夜，然后于4℃，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，小心去除油相。
(3)加入等體積的溴代十六烷基三甲胺提取緩沖液，混勻，室溫放置6小時(shí)，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，取上清。
(4)加入等體積的異丙醇和10％的3mol/L乙酸鈉，混勻，室溫放置12小時(shí)，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，棄上清，留沉淀。
(5)加入1mL TE緩沖液溶解沉淀，加入等體積的體積比為24∶1的三氯甲烷∶異戊醇，緩慢顛倒搖勻5分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，取上清。
(6)加入1/10體積的3mol/L乙酸鈉和等體積的4℃預(yù)冷的異丙醇，緩慢混勻，4℃靜置12小時(shí)。
(7)于4℃ 14000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15分鐘，棄上清，留沉淀。
(8)用400μL 4℃預(yù)冷的70％的乙醇洗滌沉淀，除去殘留的乙醇，干燥沉淀，得到DNA沉淀。
(9)加入30μL經(jīng)滅菌的去離子水溶解從食用油中提取的DNA沉淀，取15μL用作PCR反應(yīng)的模板；用作對(duì)照的大豆種子的DNA提取物用100μL TE溶解，置-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (10)是否提取到可用于PCR檢測(cè)的DNA，采用特異內(nèi)源參照基因PCR定性擴(kuò)增法進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)方法和條件如下1)特異內(nèi)源參照基因的PCR引物序列(見(jiàn)表1)表1 特異內(nèi)源參照基因的PCR引物序列檢測(cè)基因 引物序列 擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度原料作物正5’-gcc ctc tac tcc acc ccc atc c-3’Lectin118bp 大豆反5’-gcc cat ctg caa gcc ttt ttg tg-3’2)特異內(nèi)源參照基因的PCR反應(yīng)體系組成(見(jiàn)表2)反應(yīng)體系中各試劑的量根據(jù)反應(yīng)體系的總體積進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，每個(gè)反應(yīng)體系應(yīng)該設(shè)置兩個(gè)平行管。大豆油DNA質(zhì)量檢測(cè)采用的反應(yīng)體系相同。
表2 PCR檢測(cè)參考反應(yīng)體系(25μL體系)試劑名稱(chēng) 加入PCR反應(yīng)體系的量10×PCR反應(yīng)緩沖液(含Mg2+) 2.5μLDNTP溶液(每種為10mmol/L) 0.5μL正向引物(10pmol/μL) 2.5μL反向引物(10pmol/μL) 2.5μLTaq酶(2U/μL) 2.0μL*模板DNA 10～15μL水 補(bǔ)足反應(yīng)體系，使總體積為25μL*表中陽(yáng)性對(duì)照樣品的DNA模板用量為1μL。
3)特異內(nèi)源參照基因的PCR反應(yīng)條件(見(jiàn)表3)表3 特異內(nèi)源參照基因的PCR檢測(cè)參考反應(yīng)條件被擴(kuò)增的基因變性 擴(kuò)增 循環(huán)次數(shù)最后延伸94℃，30s62℃，30sLectin 96℃，2min40 72℃，3 min72℃，25s4)電泳條件用1×TAE電泳緩沖液制備2％的瓊脂糖凝膠(凝膠融化后室溫放置到60℃左右時(shí)加入溴化乙錠，含量為0.5g/mL)。按比例將10μL的PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液均勻混合，然后加入到凝膠孔中，選擇合適的電壓(3V/cm～5V/cm)進(jìn)行電泳，電泳時(shí)間為40～60分鐘。將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像儀上或紫外透射儀上觀察并照相。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地說(shuō)明。
實(shí)施例1以市售的北海糧油工業(yè)(天津)有限公司生產(chǎn)的福臨門(mén)大豆色拉油為材料，采用下述方法提取其中的DNA，1.取25mL樣品，加入25mL正己烷或石油醚，20-25℃于磁力攪拌器上攪拌2～3小時(shí)。
2.加入50mL TE緩沖液，繼續(xù)在20-25℃于磁力攪拌器上攪拌12小時(shí)，然后于4℃，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15-20分鐘，小心去除油相。
3.加入等體積的溴代十六烷基三甲胺提取緩沖液，混勻，20-25℃放置5小時(shí)，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，取上清。
4.加入等體積的異丙醇和10％的3mol/L乙酸鈉，混勻，20-25℃放置12小時(shí)，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，棄上清，留沉淀。
5.加入1mL TE緩沖液溶解沉淀，加入等體積的體積比為24∶1的三氯甲烷∶異戊醇，緩慢顛倒搖勻5分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，取上清。
6.加入1/10體積的3mol/L乙酸鈉和等體積的4℃預(yù)冷的異丙醇，緩慢混勻，4℃靜置12小時(shí)。
7.于4℃，14000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15分鐘，棄上清，留沉淀。
8.用400μL 4℃預(yù)冷的70％乙醇洗滌沉淀，除去殘留的乙醇，干燥沉淀，得到DNA沉淀。
9.加入30μL經(jīng)滅菌的去離子水溶解從食用油中提取的DNA沉淀。
用傳統(tǒng)方法提取大豆種子DNA作為對(duì)照。用大豆特異內(nèi)源基因lectin的特異性引物，以本方法提取的DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增鑒定按本方法所提取的DNA是否能滿足轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的要求，結(jié)果見(jiàn)圖1。
由圖1可見(jiàn)，從色拉油中提取的DNA，在利用lectin基因的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增以后，得到的擴(kuò)增片段與對(duì)照大豆種子的擴(kuò)增片段大小完全一致，所以用本方法提取的DNA完全能夠滿足轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的要求。
實(shí)施例2以市售的北海糧油工業(yè)(天津)有限公司生產(chǎn)的福臨門(mén)大豆色拉油為材料，采用下述方法提取其中的DNA，1.取20mL樣品，加入20mL正己烷或石油醚，20-25℃于磁力攪拌器上攪拌2～3小時(shí)。
2.加入40mL TE緩沖液，繼續(xù)在20-25℃于磁力攪拌器上攪拌6小時(shí)，然后于4℃，12000轉(zhuǎn)/粉鐘，離心15-20分鐘，小心去除油相。
其余步驟和過(guò)程同實(shí)施例1。
實(shí)施例31.取30mL樣品，加入30mL正己烷或石油醚，20-25℃于磁力攪拌器上攪拌2～3小時(shí)。
2.加入60mL TE緩沖液，繼續(xù)在20-25℃于磁力攪拌器上攪拌15小時(shí)，然后于4℃，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15-20分鐘，小心去除油相。
其余步驟和過(guò)程同實(shí)施例1。
實(shí)施例41.取25mL樣品，加入25mL正己烷或石油醚，20-25℃于磁力攪拌器上攪拌2～3小時(shí)。
2.加入50mL TE緩沖液，繼續(xù)在20-25℃于磁力攪拌器上攪拌10小時(shí)，然后于4℃，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15-20分鐘，小心去除油相。
3.加入等體積的溴代十六烷基三甲胺提取緩沖液，混勻，20-25℃放置12小時(shí)，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，取上清。
4-8步驟同實(shí)施例1。
9.加入25μL經(jīng)滅菌的去離子水溶解從食用油中提取的DNA沉淀。
其余過(guò)程同實(shí)施例1。
實(shí)施例51.取25mL樣品，加入25mL正己烷或石油醚，20-25℃于磁力攪拌器上攪拌2～3小時(shí)。
2.加入50mL TE緩沖液，繼續(xù)在20-25℃于磁力攪拌器上攪拌15小時(shí)，然后于4℃，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15-20分鐘，小心去除油相。
3.加入等體積的溴代十六烷基三甲胺提取緩沖液，混勻，20-25℃放置3小時(shí)，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，取上清。
4.加入等體積的異丙醇和1/10體積的3mol/L乙酸鈉，混勻，20-25℃放置15小時(shí)，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，棄上清，留沉淀。
其余步驟和過(guò)程同實(shí)施例1。
實(shí)施例6以正大集團(tuán)(天津)實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)的金象大豆色拉油為材料，采用下述方法提取其中的DNA1.取25mL樣品，加入25mL正己烷或石油醚，20-25℃于磁力攪拌器上攪拌2～3小時(shí)。
2.加入50mL TE緩沖液，繼續(xù)在20-25℃于磁力攪拌器上攪拌12小時(shí)，然后于4℃，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15-20分鐘，小心去除油相。
3.加入等體積的溴代十六烷基三甲胺提取緩沖液，混勻，20-25℃放置5小時(shí)，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，取上清。
4.加入等體積的異丙醇和10％的3mol/L乙酸鈉，混勻，20-25℃放置12小時(shí)，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，棄上清，留沉淀。
5.加入1mL TE緩沖液溶解沉淀，加入等體積的體積比為24∶1的三氯甲烷∶異戊醇，緩慢顛倒搖勻5分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，取上清。
6.加入1/10體積的3mol/L乙酸鈉和等體積的4℃預(yù)冷的異丙醇，緩慢混勻，4℃靜置12小時(shí)。
7.于4℃ 14000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15分鐘，棄上清，留沉淀。
8.用400μL 4℃預(yù)冷的70％乙醇洗滌沉淀，除去殘留的乙醇，干燥沉淀，得到DNA沉淀。
9.加入30μL經(jīng)滅菌的去離子水溶解從食用油中提取的DNA沉淀。
用傳統(tǒng)方法提取大豆種子DNA作為對(duì)照。用大豆特異內(nèi)源基因lectin的特異性引物，以本方法提取的DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增鑒定按本方法所提取的DNA是否能滿足轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的要求，結(jié)果見(jiàn)圖2。
由圖2可見(jiàn)，從色拉油中提取的DNA，在利用lectin基因的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增以后，得到的擴(kuò)增片段與對(duì)照大豆種子的擴(kuò)增片段大小完全一致，所以用本方法提取的DNA完全能夠滿足轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的要求。
實(shí)施例7 檢測(cè)1.取30mL樣品，加入30mL正己烷或石油醚，20-25℃于磁力攪拌器上攪拌2～3小時(shí)。
2.加入60mL TE緩沖液，繼續(xù)在20-25℃于磁力攪拌器上攪拌15小時(shí)，然后于4℃，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15-20分鐘，小心去除油相。
其余步驟和過(guò)程同實(shí)施例6。
實(shí)施例81-2步驟同于實(shí)施例6。
3.加入等體積的溴代十六烷基三甲胺提取緩沖液，混勻，20-25℃放置5小時(shí)，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，取上清。
4-8步驟同于實(shí)施例6。
9.加入35μL經(jīng)滅菌的去離子水溶解從食用油中提取的DNA沉淀。
其余過(guò)程同實(shí)施例6。
實(shí)施例91.取20mL樣品，加入20mL正己烷或石油醚，20-25℃于磁力攪拌器上攪拌2～3小時(shí)。
2.加入40mL TE緩沖液，繼續(xù)在20-25℃于磁力攪拌器上攪拌6小時(shí)，然后于4℃，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15-20分鐘，小心去除油相。
3.加入等體積的溴代十六烷基三甲胺提取緩沖液，混勻，20-25℃放置3小時(shí)，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，取上清。
4.加入等體積的異丙醇和1/10體積的3mol/L乙酸鈉，混勻，20-25℃放置6小時(shí)，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，棄上清，留沉淀。
其余步驟和過(guò)程同實(shí)施例6。
實(shí)施例101-8步驟同實(shí)施例6。
9.加入25μL經(jīng)滅菌的去離子水溶解從食用油中提取的DNA沉淀。
其余過(guò)程同實(shí)施例6。
權(quán)利要求
1.從以大豆為原料的食用油中提取用于轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的DNA的方法，它由下述步驟組成(1)取20-30mL樣品，加入20-30mL正己烷或石油醚，20-25℃于磁力攪拌器上攪拌2～3小時(shí)；(2)加入40-60mL TE緩沖液，繼續(xù)在20-25℃于磁力攪拌器上攪拌6-15小時(shí)，然后于4℃，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15-20分鐘，小心去除油相；(3)加入等體積的溴代十六烷基三甲胺提取緩沖液，混勻，20-25℃放置3～6小時(shí)，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，取上清液；(4)加入與上清液等體積的異丙醇和上清液1/10體積的3mol/L乙酸鈉，混勻，20-25℃靜置6-15小時(shí)，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，棄上清液，留沉淀；(5)加入1mLTE緩沖液溶解沉淀，加入等體積的體積比為24∶1的三氯甲烷∶異戊醇，緩慢顛倒搖勻5分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，取上清液；(6)加入1/10體積的3mol/L乙酸鈉和等體積的4℃預(yù)冷的異丙醇，緩慢混勻，4℃靜置6-15小時(shí)；(7)于4℃，14000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15分鐘，棄上清液；(8)用400μL 4℃預(yù)冷的70％乙醇洗沉淀，除去殘留的乙醇，干燥沉淀，得到DNA沉淀；(9)加入25-35μL滅菌的去離子水，溶解DNA沉淀。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從以大豆為原料的食用油中提取用于轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的DNA的方法，其特征在于所述步驟(1)正己烷用量為1倍樣品體積。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從以大豆為原料的食用油中提取用于轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的DNA的方法，其特征在于所述步驟(2)中所用TE緩沖液為2倍樣品體積。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從以大豆為原料的食用油中提取用于轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的DNA的方法，其特征在于所述步驟(2)攪拌時(shí)間為12小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從以大豆為原料的食用油中提取用于轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的DNA的方法，其特征在于所述步驟(3)中的放置時(shí)間為5小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從以大豆為原料的食用油中提取用于轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的DNA的方法，其特征在于所述步驟(4)中靜置時(shí)間為12小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從以大豆為原料的食用油中提取用于轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的DNA的方法，其特征在于所述步驟(9)中的滅菌去離子水體積為30μL。
全文摘要
本發(fā)明的內(nèi)容是從以大豆為原料的食用油中提取DNA，用于轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)。與常規(guī)方法相比，本方法的特點(diǎn)是在DNA提取過(guò)程中將含量極低的水溶性成分(包括部分已游離出來(lái)的DNA分子)從脂溶性油脂中充分游離出來(lái)；利用溴代十六烷基三甲胺提取液在室溫使DNA分子從細(xì)胞中充分釋放出來(lái)；利用等體積異丙醇和1/10體積的乙酸鈉經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間沉淀，使含量極低的小分子DNA充分沉淀下來(lái)；將所提取的DNA溶解在30μL體積的去離子水中，取15μL用作一次PCR反應(yīng)，以增加反應(yīng)體系中DNA模板的濃度。此方法快速、簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)，效率高，適用于以大豆為原料的深度加工食用油中轉(zhuǎn)基因成分的定性檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1597982SQ20041002017
公開(kāi)日2005年3月23日 申請(qǐng)日期2004年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月28日
發(fā)明者金紅, 趙昕, 王永, 程奕, 鄭貴忠 申請(qǐng)人:天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室