專利名稱：用于鑒定黃瓜霜霉病抗性的引物序列及其鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)中的DNA序列，及其利用DNA序列鑒定黃瓜霜霉病抗性的方法。
背景技術(shù)：
黃瓜霜霉病[Pseudoperonospora cubensis]是一種廣泛發(fā)生的世界性植物病害。該病靠氣流傳播，其發(fā)生和流行與植物生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)，特別是與空氣的溫、濕度的關(guān)系最大，特別是濕度。該病主要為害葉片，偶爾也能為害莖、卷須和花梗等。在適宜發(fā)病的環(huán)境下，黃瓜幼苗便可感病，成株期發(fā)病多在植株進(jìn)入開(kāi)花結(jié)果以后。發(fā)病初期，葉上出現(xiàn)水漬狀淺綠色斑點(diǎn)，擴(kuò)大后受葉脈限制成多角形，其色澤變?yōu)辄S綠、黃色，最后為褐色，但病斑邊緣仍呈黃綠色，病部與健部交界處不明顯。潮濕環(huán)境下葉背部病斑上長(zhǎng)出紫黑色的霉層(孢子囊及孢囊梗)。此病發(fā)展迅速，一、兩周內(nèi)即可使整株葉片(除頂端數(shù)片嫩葉外)枯死，直接影響結(jié)瓜，流行年份減產(chǎn)可達(dá)30-50％，有的田塊因此發(fā)生只采1-2次瓜后即提早拔秧，給生產(chǎn)造成很大威脅，已成為影響世界各國(guó)黃瓜產(chǎn)量的重要問(wèn)題。
我國(guó)十分重視黃瓜的抗病育種研究。從上個(gè)世紀(jì)50年代末，育種家就通過(guò)常規(guī)雜交、自交等育種方法進(jìn)行抗霜霉病和抗白粉病等的選育工作，并取得了顯著成就，先后育成了一批優(yōu)良品種，在生產(chǎn)上取得了可觀的經(jīng)濟(jì)效益。
常規(guī)的抗病育種方法雖然取得了顯著的成就，但也存在許多缺點(diǎn)。在傳統(tǒng)的育種工作中，育種家們首先得進(jìn)行品種或品系間的雜交，然后從分離后代中通過(guò)表型觀察選擇理想的重組基因型，由于抗病材料的選擇和田間鑒定過(guò)程復(fù)雜，周期相對(duì)較長(zhǎng)，而且可靠性差，使得這個(gè)過(guò)程大量的消耗人力、物力和財(cái)力。加之黃瓜霜霉病的病原(Pseudoperonosporacubensis(Berk.et Curt.)Rostov.)——古巴假霜霉菌(屬鞭毛菌亞門假霜霉菌屬真菌)為專性寄生菌，只能在活體寄主上存活，由于黃瓜霜霉病的發(fā)生受季節(jié)限制，在非發(fā)病季節(jié)對(duì)該病的田間鑒定工作則難以進(jìn)行。
RFLP、RAPD、SCAR等分子標(biāo)記技術(shù)的問(wèn)世，為育種提供了一條新途徑。分子標(biāo)記可以直接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物體的各個(gè)組織、各個(gè)發(fā)育階段均可檢測(cè)到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達(dá)與否等問(wèn)題。
分子標(biāo)記技術(shù)在尋找與目標(biāo)性狀連鎖的分子標(biāo)記方面已有諸多報(bào)道，與黃瓜霜霉病抗性相關(guān)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記目前尚未見(jiàn)報(bào)道。在利用分子標(biāo)記進(jìn)行抗性鑒定的過(guò)程中，特異性的引物序列是關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于鑒定黃瓜霜霉病抗性的引物序列；本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種鑒定黃瓜霜霉病抗性的方法；本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供另一種用于鑒定黃瓜霜霉病抗性的引物序列；本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供另一種鑒定黃瓜霜霉病抗性的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種用于鑒定黃瓜霜霉病抗性的引物序列，其特征是它由上游引物和下游引物組成，上游引物具有序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列。
一種鑒定黃瓜霜霉病抗性的方法，它是使用上述引物序列鑒定黃瓜霜霉病的抗性，它包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組DNA；(2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在PCR擴(kuò)增專用薄壁管中放入所述黃瓜基因組DNA15～30ng、序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列20～40ng、序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列20～40ng、dNTP0.15～0.25mM、Mg2+1.2～2.0mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶0.8～1.2單位，加無(wú)菌重蒸餾水至20μl，將所述PCR擴(kuò)增專用薄壁管放入PCR儀中擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性180～300秒，94℃變性60秒，50～59℃退火40～60秒，72℃延伸60～120秒，25～35個(gè)循環(huán)，再72℃延伸300～420秒，擴(kuò)增完成；(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析將擴(kuò)增產(chǎn)物采用5％變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離；在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95℃變性300秒，上樣于經(jīng)30分鐘預(yù)電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，70W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達(dá)凝膠的另一端，凝膠經(jīng)硝酸銀染色后在可見(jiàn)光下觀察、照相；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對(duì)位置，鑒定黃瓜霜霉病的抗性。
第二種用于鑒定黃瓜霜霉病抗性的引物序列，它包括兩組引物，第一組引物由第一組上游引物和第一組下游引物組成，所述第一組上游引物具有序列表中SEQ ID No3所述的核苷酸序列，所述第一組下游引物具有序列表中SEQ ID No4所述的核苷酸序列，第二組引物由第二組上游引物和第二組下游引物組成，所述第二組上游引物具有序列表中SEQ ID No5所述的核苷酸序列，所述第二組下游引物具有序列表中SEQ ID No6所述的核苷酸序列。
第二種鑒定黃瓜霜霉病抗性的方法，它是使用第二種用于鑒定黃瓜霜霉病抗性的引物序列來(lái)鑒定黃瓜霜霉病的抗性，它包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組DNA；(2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在兩支PCR擴(kuò)增專用薄壁管中分別放入所述黃瓜基因組DNA15～30ng、在第一支擴(kuò)增專用薄壁管中放入序列表中SEQ ID No3所述的核苷酸序列20～40ng、序列表中SEQ IDNo4所述的核苷酸序列20～40ng，在第二支擴(kuò)增專用薄壁管中放入序列表中SEQ ID No5所述的核苷酸序列20～40ng、序列表中SEQ ID No6所述的核苷酸序列20～40ng，再在兩支PCR擴(kuò)增專用薄壁管中分別加入dNTP0.15～0.25mM、Mg2+1.2～2.0mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶0.8～1.2單位，加無(wú)菌重蒸餾水至20μl，將所述兩支PCR擴(kuò)增專用薄壁管進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性180～300秒，94℃變性60秒，48～55℃退火40～60秒，72℃延伸60～120秒，25～35個(gè)循環(huán)，再72℃延伸300～420秒，擴(kuò)增完成；(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析將兩個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物均采用2.0％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離；在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入凝膠上樣緩沖液，混勻，然后點(diǎn)樣于事先準(zhǔn)備好的含有0.5μg/ml溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上，采用5V/cm的電壓進(jìn)行電泳使溴酚藍(lán)泳至凝膠的2/3，紫外觀察箱觀察照相。(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對(duì)位置，鑒定黃瓜霜霉病的抗性。
有益效果本發(fā)明鑒定結(jié)果與田間抗病吻合率達(dá)94.7％，而且具有快速、準(zhǔn)確、不受環(huán)境條件影響等優(yōu)點(diǎn)，在黃瓜霜霉病抗性篩選上具有很大的應(yīng)用價(jià)值。


圖1為第一種鑒定黃瓜霜霉病抗性的電泳圖；圖2為第二種鑒定黃瓜霜霉病抗性的第一支擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖；圖3為第二種鑒定黃瓜霜霉病抗性的第二支擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖；圖4顯示了22bp的DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID No1)；圖5顯示了20bp的DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID No2)；圖6顯示了20bp的DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID No3)；圖7顯示了21bp的DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID No4)；圖8顯示了20bp的DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID No5)；圖9顯示了22bp的DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID No6)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1一種鑒定黃瓜霜霉病抗性的方法(1)提取黃瓜基因組DNA；(2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在PCR擴(kuò)增專用薄壁管中放入所述黃瓜基因組DNA20ng、序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列30ng、序列表中SEQ IDNo2所述的核苷酸序列30ng、dNTP0.2mM、Mg2+1.5mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶1.0單位，加無(wú)菌重蒸餾水至20μl，將所述PCR擴(kuò)增專用薄壁管放入PCR儀中擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性200秒，94℃變性60秒，55℃退火50秒，72℃延伸90秒，30個(gè)循環(huán)，再72℃延伸350秒，擴(kuò)增完成；(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析將擴(kuò)增產(chǎn)物采用5％變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離；在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95℃變性300秒，上樣于經(jīng)30分鐘預(yù)電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，70W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達(dá)凝膠的另一端，凝膠經(jīng)硝酸銀染色后在可見(jiàn)光下觀察、照相；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對(duì)位置，鑒定黃瓜霜霉病的抗性。由于抗病單株、感病單株或中間類型單株經(jīng)擴(kuò)增以后產(chǎn)生不同分子量的DNA片段，在凝膠上分離時(shí)其在凝膠上的遷移速率不同，從而形成位置上存在差異的條帶，通過(guò)條帶在凝膠上的相對(duì)位置就可對(duì)黃瓜霜霉病材料的抗性進(jìn)行快速鑒定。如圖1所示1為指示DNA標(biāo)準(zhǔn)條帶的分子量180bp；2為指示DNA標(biāo)準(zhǔn)條帶的分子量160bp，3為抗性帶，4為感性帶，1～8為抗病單株；9～16為感病單株，17～27為中間類型單株，M為DNA標(biāo)準(zhǔn)，純合抗性株僅有抗性帶，純合感性株僅有感性帶，雜合類型同時(shí)具有抗性帶和感性帶。
實(shí)施例2一種鑒定黃瓜霜霉病抗性的方法
(1)提取黃瓜基因組DNA；(2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在PCR擴(kuò)增專用薄壁管中放入；所述黃瓜基因組DNA15ng、序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列20ng、序列表中SEQ IDNo2所述的核苷酸序列20ng、dNTP0.15mM、Mg2+1.2mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶0.8單位，加無(wú)菌重蒸餾水至20μl，將所述PCR擴(kuò)增專用薄壁管放入PCR儀中擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性180秒，94℃變性60秒，50℃退火40秒，72℃延伸60秒，25個(gè)循環(huán)，再72℃延伸300秒，擴(kuò)增完成；(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析將擴(kuò)增產(chǎn)物采用5％變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離；在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95℃變性300秒，上樣子經(jīng)30分鐘預(yù)電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，70W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達(dá)凝膠的另一端，凝膠經(jīng)硝酸銀染色后在可見(jiàn)光下觀察、照相；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對(duì)位置，鑒定黃瓜霜霉病的抗性。
實(shí)施例3一種鑒定黃瓜霜霉病抗性的方法(1)提取黃瓜基因組DNA；(2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在PCR擴(kuò)增專用薄壁管中放入所述黃瓜基因組DNA30ng、序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列40ng、序列表中SEQ IDNo2所述的核苷酸序列40ng、dNTP0.25mM、Mg2+2.0mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶1.2單位，加無(wú)菌重蒸餾水至20μl，將所述PCR擴(kuò)增專用薄壁管放入PCR儀中擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性300秒，94℃變性60秒，59℃退火60秒，72℃延伸120秒，35個(gè)循環(huán)，再72℃延伸420秒，擴(kuò)增完成；(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析將擴(kuò)增產(chǎn)物采用5％變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離；在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95℃變性300秒，上樣于經(jīng)30分鐘預(yù)電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，70W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達(dá)凝膠的另一端，凝膠經(jīng)硝酸銀染色后在可見(jiàn)光下觀察、照相；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對(duì)位置，鑒定黃瓜霜霉病的抗性。
實(shí)施例4第二種鑒定黃瓜霜霉病抗性的方法(1)提取黃瓜基因組DNA；(2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在兩支PCR擴(kuò)增專用薄壁管中分別放入所述黃瓜基因組DNA20ng、在第一支擴(kuò)增專用薄壁管中放入序列表中SEQ ID No3所述的核苷酸序列30ng、下游引物序列表中SEQ ID No4所述的核苷酸序列30ng、在第二支擴(kuò)增專用薄壁管中放入序列表中SEQ ID No5所述的核苷酸序列30ng、序列表中SEQ IDNo6所述的核苷酸序列30ng、再在兩支PCR擴(kuò)增專用薄壁管中分別加入dNTP0.20mM、Mg2+1.5mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶1.0單位，加無(wú)菌重蒸餾水至20μl，將所述兩支PCR擴(kuò)增專用薄壁管進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性250秒，94℃變性60秒，51℃退火50秒，72℃延伸90秒，30個(gè)循環(huán)，再72℃延伸350秒，擴(kuò)增完成；(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析將兩個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物均采用2.0％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離；在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入凝膠上樣緩沖液，混勻，然后點(diǎn)樣于事先準(zhǔn)備好的含有0.5μg/ml溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上，采用5V/cm的電壓進(jìn)行電泳使溴酚藍(lán)泳至凝膠的2/3，紫外觀察箱觀察照相。(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對(duì)位置，鑒定黃瓜霜霉病的抗性，圖2所示的是第一支擴(kuò)增產(chǎn)物，1為指示DNA標(biāo)準(zhǔn)條帶的分子量200bp；2為抗性帶；M為DNA標(biāo)準(zhǔn)；泳道1及3～9為抗病單株；泳道2及10～16為感病單株；17～27為中間類型單株，在圖2中，抗病單株和中間類型單株具有抗性帶，而感病單株無(wú)此條帶，據(jù)此可鑒定出純合感病個(gè)體；圖3所示的是第二支擴(kuò)增產(chǎn)物，1為指示DNA標(biāo)準(zhǔn)條帶的分子量200bp；2為指示DNA標(biāo)準(zhǔn)條帶的分子量100bp；3為感性帶；M為DNA標(biāo)準(zhǔn)；泳道1及3～9為抗病單株；泳道2及10～16為感病單株；17～28為中間類型單株，在圖3中，感病單株和中間類型單株均具有感性帶，而抗病單株無(wú)此條帶，據(jù)此可鑒定出純合抗病個(gè)體。將圖2和圖3結(jié)合在一起觀察和分析，可以作為一個(gè)共顯性標(biāo)記。在第一組中無(wú)帶的為純合感性帶，在第二組中無(wú)帶的為純合抗性株，在兩組中均有條帶的為雜合中間類型，據(jù)此可快速鑒定出純合抗性株、純合感性株及雜合中間類型，實(shí)現(xiàn)黃瓜霜霉病抗性的快速鑒定。
實(shí)施例5第二種鑒定黃瓜霜霉病抗性的方法(1)提取黃瓜基因組DNA；(2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在兩支PCR擴(kuò)增專用薄壁管中分別放入所述黃瓜基因組DNA15ng、在第一支擴(kuò)增專用薄壁管中放入序列表中SEQ ID No3所述的核苷酸序列20ng、序列表中SEQ ID No4所述的核苷酸序列20ng、在第二支擴(kuò)增專用薄壁管中放入序列表中SEQ ID No5所述的核苷酸序列20ng、序列表中SEQ ID No6所述的核苷酸序列20ng、再在兩支PCR擴(kuò)增專用薄壁管中分別加入dNTP0.15mM、Mg2+1.2mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶0.8單位，加無(wú)菌重蒸餾水至20μl，將所述兩支PCR擴(kuò)增專用薄壁管進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性180秒，94℃變性60秒，48℃退火40秒，72℃延伸60秒，25個(gè)循環(huán)，再72℃延伸300秒，擴(kuò)增完成；(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析將兩個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物均采用2.0％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離；在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入凝膠上樣緩沖液，混勻，然后點(diǎn)樣于事先準(zhǔn)備好的含有0.5μg/ml溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上，采用5V/cm的電壓進(jìn)行電泳使溴酚藍(lán)泳至凝膠的2/3，紫外觀察箱觀察照相。(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對(duì)位置，鑒定黃瓜霜霉病的抗性。
實(shí)施例6第二種鑒定黃瓜霜霉病抗性的方法(1)提取黃瓜基因組DNA；(2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在兩支PCR擴(kuò)增專用薄壁管中分別放入所述黃瓜基因組DNA30ng、在第一支擴(kuò)增專用薄壁管中放入序列表中SEQ ID No3所述的核苷酸序列40ng、序列表中SEQ ID No4所述的核苷酸序列40ng、在第二支擴(kuò)增專用薄壁管中放入序列表中SEQ ID No5所述的核苷酸序列40ng、序列表中SEQ ID No6所述的核苷酸序列40ng、再在兩支PCR擴(kuò)增專用薄壁管中分別加入dNTP0.25mM、Mg2+2.0mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶1.2單位，加無(wú)菌重蒸餾水至20μl，將所述兩支PCR擴(kuò)增專用薄壁管進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性300秒，94℃變性60秒，55℃退火60秒，72℃延伸120秒，35個(gè)循環(huán)，再72℃延伸420秒，擴(kuò)增完成；(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析將兩個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物均采用2.0％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離；在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入凝膠上樣緩沖液，混勻，然后點(diǎn)樣于事先準(zhǔn)備好的含有0.5μg/ml溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上，采用5V/cm的電壓進(jìn)行電泳使溴酚藍(lán)泳至凝膠的2/3，紫外觀察箱觀察照相。(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對(duì)位置，鑒定黃瓜霜霉病的抗性。
權(quán)利要求
1.一種用于鑒定黃瓜霜霉病抗性的引物序列，其特征是它由上游引物和下游引物組成，所述上游引物具有序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列，所述下游引物具有序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列。
2.一種鑒定黃瓜霜霉病抗性的方法，它包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組DNA；(2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在PCR擴(kuò)增專用薄壁管中放入所述黃瓜基因組DNA15～30ng、序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列20～40ng、序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列20～40ng、dNTP0.15～0.25mM、Mg2+1.2～2.0mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶0.8～1.2單位，加無(wú)菌重蒸餾水至20μl，將所述PCR擴(kuò)增專用薄壁管放入PCR儀中擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性180～300秒，94℃變性60秒，50～59℃退火40～60秒，72℃延伸60～120秒，25～35個(gè)循環(huán)，再72℃延伸300～420秒，擴(kuò)增完成；(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析將擴(kuò)增產(chǎn)物采用5％變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離；在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95℃變性300秒，上樣于經(jīng)30分鐘預(yù)電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，70W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達(dá)凝膠的另一端，凝膠經(jīng)硝酸銀染色后在可見(jiàn)光下觀察、照相；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對(duì)位置，鑒定黃瓜霜霉病的抗性。
3.一種用于鑒定黃瓜霜霉病抗性的引物序列，其特征是它包括兩組引物，第一組引物由第一組上游引物和第一組下游引物組成，所述第一組上游引物具有序列表中SEQ ID No3所述的核苷酸序列，所述第一組下游引物具有序列表中SEQ ID No4所述的核苷酸序列，第二組引物由第二組上游引物和第二組下游引物組成，所述第二組上游引物具有序列表中SEQ ID No5所述的核苷酸序列，所述第二組下游引物具有序列表中SEQ ID No6所述的核苷酸序列。4.一種鑒定黃瓜霜霉病抗性的方法，它包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組DNA；(2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在兩支PCR擴(kuò)增專用薄壁管中分別放入所述黃瓜基因組DNA15～30ng、在第一支擴(kuò)增專用薄壁管中放入序列表中SEQ ID No3所述的核苷酸序列20～40ng、序列表中SEQ ID No4所述的核苷酸序列20～40ng，在第二支擴(kuò)增專用薄壁管中放入序列表中SEQ ID No5所述的核苷酸序列20～40ng、序列表中SEQ ID No6所述的核苷酸序列20～40ng，再在兩支PCR擴(kuò)增專用薄壁管中分別加入dNTP0.15～0.25mM、Mg2+1.2～2.0mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶0.8～1.2單位，加無(wú)菌重蒸餾水至20μl，將所述兩支(3)PCR擴(kuò)增專用薄壁管進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性180～300秒，94℃變性60秒，48～55℃退火40～60秒，72℃延伸60～120秒，25～35個(gè)循環(huán)，再72℃延伸300～420秒，擴(kuò)增完成；(4)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析將兩個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物均采用2.0％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離；在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入凝膠上樣緩沖液，混勻，然后點(diǎn)樣于事先準(zhǔn)備好的含有0.5μg/ml溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上，采用5V/cm的電壓進(jìn)行電泳使溴酚藍(lán)泳至凝膠的2/3，紫外觀察箱觀察照相。(5)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對(duì)位置，鑒定黃瓜霜霉病的抗性。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種用于鑒定黃瓜霜霉病抗性的引物序列及其鑒定方法，引物序列是由具有序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列的上游引物和具有序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列的下游引物組成；一種鑒定黃瓜霜霉病抗性的方法，它的步驟是(1)提取黃瓜基因組DNA；(2)用序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列及序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對(duì)位置，鑒定黃瓜霜霉病的抗性，本發(fā)明鑒定結(jié)果與田間抗病吻合率達(dá)94.7％，而且具有快速、準(zhǔn)確、不受環(huán)境條件影響等優(yōu)點(diǎn)，在黃瓜霜霉病抗性篩選上具有很大的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1560247SQ20041001866
公開(kāi)日2005年1月5日 申請(qǐng)日期2004年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月17日
發(fā)明者杜勝利, 鞠秀芝, 張桂華, 李淑菊, 魏愛(ài)民, 韓毅科, 張歷 申請(qǐng)人:天津科潤(rùn)農(nóng)業(yè)科技股份有限公司, 天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心