專(zhuān)利名稱(chēng)：大規(guī)模液體深層發(fā)酵生產(chǎn)桑黃水提取物及多糖工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種大規(guī)模液體深層發(fā)酵生產(chǎn)桑黃水提取物及多糖工藝。
背景技術(shù)：
桑黃(Phellinus igniarius)的現(xiàn)代科學(xué)名稱(chēng)為鮑氏層孔菌，也叫作桑耳、針裂蹄、裂蹄針層孔菌等，是一種寄生于腐爛桑樹(shù)上的真菌，李時(shí)珍的《本草綱目》中就已將桑黃作為一味藥材收載。20世紀(jì)90年代中期以后，韓國(guó)和日本的研究人員發(fā)現(xiàn)桑黃的提取物對(duì)腫瘤等贅生物有出色的抑制作用。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，桑黃水提取物可誘導(dǎo)癌細(xì)胞進(jìn)入程序死亡。此外，桑黃還具有很強(qiáng)的抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移作用。更令人振奮的是，桑黃提取物對(duì)人體無(wú)害，即使長(zhǎng)期大劑量投予，對(duì)人或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物亦無(wú)任何毒副作用。桑黃的水提取物的主要活性成分為多糖類(lèi)物質(zhì)。
由于天然來(lái)源的桑黃數(shù)量非常稀少，難以成為穩(wěn)定的工業(yè)產(chǎn)品來(lái)源。韓國(guó)一制藥公司已率先開(kāi)發(fā)出桑黃菌絲體培養(yǎng)技術(shù)，是將桑黃在特制的培養(yǎng)罐中進(jìn)行發(fā)酵，最后將其提取物用凍干法加工成粉末。由于抗癌效果顯著，桑黃提取物干粉在韓國(guó)市場(chǎng)的售價(jià)高達(dá)2000美元/g。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2002年韓國(guó)和日本兩國(guó)市場(chǎng)桑黃制劑的銷(xiāo)售合計(jì)已過(guò)100億日?qǐng)A。而美國(guó)在2000年就已從日本進(jìn)口桑黃制劑作為膳食補(bǔ)充劑。目前尚未見(jiàn)大規(guī)模液體深層發(fā)酵生產(chǎn)桑黃水提取物及多糖的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是以生產(chǎn)桑黃水提取物及多糖為目標(biāo)，發(fā)明一種廉價(jià)高效的桑黃水提取物及多糖的大規(guī)模液體深層發(fā)酵工藝，為今后的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用打下基礎(chǔ)。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案以桑黃真菌為出發(fā)菌株，采用斜面菌種進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)、液體搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)、一級(jí)種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)。在發(fā)酵結(jié)束后，將終了發(fā)酵液繼續(xù)加熱到一定溫度，攪拌維持一定時(shí)間，發(fā)酵液經(jīng)板框壓濾，清液濃縮，噴霧干燥得到桑黃水提取物，或?qū)⑶逡簼饪s后用適量乙醇沉淀，取沉淀物加適量水溶解，噴霧干燥可得桑黃多糖。
本菌株購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏中心的菌種，編號(hào)為AS5.95。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體步驟如下(1)取出斜面菌種接入配制的新鮮斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度25-33℃，培養(yǎng)150-250小時(shí)。
(2)將步驟1中的斜面菌種轉(zhuǎn)接入裝有搖瓶培養(yǎng)基的搖瓶中，25-33℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120-180rpm/min，培養(yǎng)80-120小時(shí)后進(jìn)行搖瓶的擴(kuò)大培養(yǎng)。
(3)將步驟2中的搖瓶菌種轉(zhuǎn)接入裝有搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)基的搖瓶再進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，25-33℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120-180rpm/min，培養(yǎng)35-60小時(shí)后接入一級(jí)種子罐進(jìn)行培養(yǎng)。
(4)將步驟3中的搖瓶菌種轉(zhuǎn)接入一個(gè)裝有種子培養(yǎng)基的一級(jí)種子罐中，接種量為4-10％，保持罐溫25-33℃，罐壓0.5-0.9kPa，攪拌速率80-150rpm/min，通氣量1∶0.3-0.5v/v.m，發(fā)酵30-55小時(shí)，然后轉(zhuǎn)接入發(fā)酵罐發(fā)酵。
(5)將一級(jí)種子罐中的菌種轉(zhuǎn)接入一個(gè)裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量為4-10％，保持罐溫25-33℃，罐壓0.5-0.9kPa，攪拌速率80-150rpm/min，通氣量1∶0.3-0.5v/v.m，發(fā)酵120-200小時(shí)。在發(fā)酵液還原糖含量降低到1.0-2.0％左右時(shí)為發(fā)酵終了，放罐。
本發(fā)明中斜面培養(yǎng)基的配方是(g/100ml)馬鈴薯10-20，葡萄糖1-3，瓊脂1.5-2.5，加水定容至所需體積，pH值自然。
本發(fā)明中搖瓶培養(yǎng)基和搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)基的配方是(g/100ml)葡萄糖2-4，蛋白胨0.05-0.5，麩皮汁1.0-2.5，KH2PO40.1-0.5，MgSO40.01-0.2，加水定容至所需體積，pH值為4.5-5.0。
本發(fā)明中一級(jí)種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方是(g/100ml)葡萄糖2-4，蛋白胨0.03-0.7，玉米漿0.5-1.5，玉米粉0.5-2，麩皮汁1-3，KH2PO40.1-0.5，MgSO40.01-0.2，加水定容至所需體積，pH值為4.0-5.0。
本發(fā)明步驟2和3中搖瓶培養(yǎng)基與搖瓶容積比為1∶5。
本發(fā)明步驟4中一級(jí)種子罐的容積為100-300L，在該一級(jí)種子罐中裝有的一級(jí)種子培養(yǎng)基相應(yīng)為50-180L；步驟5中發(fā)酵罐的容積為1000-5000L，在該發(fā)酵罐中裝有的發(fā)酵培養(yǎng)基相應(yīng)為500-3500L。
本發(fā)明的放罐標(biāo)準(zhǔn)是發(fā)酵液開(kāi)始變得粘稠，還原糖含量降低到1.0-2.0％左右，鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲體開(kāi)始衰老。
如需獲取其水提取物及多糖，則在本發(fā)明所述的發(fā)酵終止后，將發(fā)酵終了液溫度加熱到60-100℃，攪拌速度為150-250rpm/min，維持2-4小時(shí)，用泵將發(fā)酵液輸送到貯罐中，經(jīng)板框壓濾，得清液。濾液經(jīng)濃縮，使最后體積為原液的1/4-1/10，取濃縮液噴霧干燥得到桑黃水提取物?；蚯逡簼饪s后加入適量乙醇使乙醇濃度達(dá)75％，醇析20-30小時(shí)，取沉淀用去離子水溶解，噴霧干燥即得到桑黃多糖。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明適用于大規(guī)模液體深層發(fā)酵生產(chǎn)桑黃水提取物及多糖，對(duì)于今后的工業(yè)化生產(chǎn)和相關(guān)的應(yīng)用產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。本發(fā)明所得桑黃水提取物和多糖顏色為褐色。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)施例1在斜面培養(yǎng)基中接種購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏中心(菌種編號(hào)5.95)的桑黃菌絲體，培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)時(shí)間180小時(shí)。將新鮮的斜面菌種接入裝有100ml培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，28℃搖床培養(yǎng)100小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速150rpm/min。然后將所得搖瓶菌種轉(zhuǎn)接入裝有100ml培養(yǎng)基的500ml三角搖瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，28℃搖床培養(yǎng)45小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速150rpm/min。然后將三角瓶擴(kuò)大的菌種2200ml轉(zhuǎn)接入裝有50L種子培養(yǎng)基的100L一級(jí)種子罐中，保持罐溫28℃，罐壓0.7kPa，攪拌速率100rpm/min，通氣量1∶0.5v/v.m，發(fā)酵時(shí)間45小時(shí)。將一級(jí)種子罐菌種轉(zhuǎn)接入裝有800L發(fā)酵培養(yǎng)基的1500L發(fā)酵罐中，保持罐溫28℃，罐壓0.7kPa，攪拌速率100rpm/min，通氣量1∶0.5v/v.m，發(fā)酵時(shí)間144小時(shí)，發(fā)酵液中菌絲體以干重計(jì)為2.9％，多糖含量為30％。
本實(shí)施例1中斜面培養(yǎng)基組成是(g/100ml)馬鈴薯15，葡萄糖2，瓊脂2，加水定容至所需體積，pH值為自然。
本實(shí)施例1中搖瓶培養(yǎng)基和搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)基組成是(g/100ml)葡萄糖3，蛋白胨0.2，麩皮汁2，KH2PO40.2，MgSO40.1，加水定容至所需體積，pH值為自然。
本實(shí)施例1中100L一級(jí)種子罐的培養(yǎng)基組成是(g/100ml)葡萄糖3，蛋白胨0.2，玉米漿1，玉米粉1.5，麩皮汁2，KH2PO40.2，MgSO40.1，加水定容至50L，pH值為4.5。
本實(shí)施例1中1500L發(fā)酵罐的培養(yǎng)基配方是(g/100ml)葡萄糖3，蛋白胨0.2，玉米漿1.0，玉米粉1.5，麩皮汁2，KH2PO40.2，MgSO40.1，加水定容至800L，pH值為4.5。
本實(shí)施例中發(fā)酵結(jié)束標(biāo)準(zhǔn)是發(fā)酵液開(kāi)始變得粘稠，還原糖含量降低到1.5％，鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲體開(kāi)始衰老。
獲取桑黃水提取物及多糖的方法是在本發(fā)明所述的發(fā)酵終止后，將溫度加熱到90℃，攪拌速度為220rpm/min，維持3小時(shí)，用泵將發(fā)酵液輸送到貯罐中，經(jīng)板框壓濾，濾液經(jīng)濃縮，使最后體積為原液的1/5，取濃縮液噴霧干燥得到桑黃水提取物。如需獲取多糖，則將濃縮液加入適量乙醇使乙醇濃度達(dá)75％，醇析24小時(shí)，取沉淀用去離子水溶解，噴霧干燥得到桑黃多糖。
權(quán)利要求
1.一種液體深層發(fā)酵生產(chǎn)桑黃水提取物及多糖的工藝，其特征是以桑黃真菌(Phellinus igniarius)為出發(fā)菌株，采用斜面菌種進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)、液體搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)、一級(jí)種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)得桑黃菌絲體發(fā)酵液，在發(fā)酵結(jié)束后，將終了發(fā)酵液繼續(xù)加熱到一定溫度，攪拌維持一定時(shí)間，發(fā)酵液經(jīng)板框壓濾，清液濃縮，噴霧干燥得到桑黃水提取物，或?qū)⑶逡簼饪s后用適量乙醇沉淀，取沉淀物加適量水溶解，噴霧干燥可得桑黃多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液體深層發(fā)酵生產(chǎn)桑黃水提取物及多糖的工藝，其特征是以購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏中心的桑黃真菌AS5.95為出發(fā)菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液體深層發(fā)酵生產(chǎn)桑黃水提取物及多糖的工藝，其特征是所述的斜面菌種培養(yǎng)，培養(yǎng)基組成是(g/100ml)馬鈴薯10-20，葡萄糖1-3，瓊脂1.5-2.5，加水定容至所需體積，pH值為自然，斜面菌種培養(yǎng)溫度25-33℃，培養(yǎng)150-250小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液體深層發(fā)酵生產(chǎn)桑黃水提取物及多糖的工藝，其特征是所述的搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)基組成是(g/100ml)葡萄糖2-4，蛋白胨0.05-0.5，麩皮汁1.0-2.5，KH2PO40.1-0.5，MgSO40.01-0.2，加水定容至所需體積，pH值為4.5-5.0，培養(yǎng)條件是培養(yǎng)溫度25-33℃，轉(zhuǎn)速120-180rpm/min，培養(yǎng)80-120小時(shí)，然后轉(zhuǎn)接入搖瓶進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液體深層發(fā)酵生產(chǎn)桑黃水提取物及多糖的工藝，其特征是所述的搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)基組成是(g/100ml)葡萄糖2-4，蛋白胨0.05-0.5，麩皮汁1.0-2.5，KH2PO40.1-0.5，MgSO40.01-0.2，加水定容至所需體積，pH值為4.5-5.0，培養(yǎng)條件是培養(yǎng)溫度25-33℃，轉(zhuǎn)速120-180rpm/min，培養(yǎng)35-60小時(shí)，然后轉(zhuǎn)接入一級(jí)種子培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液體深層發(fā)酵生產(chǎn)桑黃水提取物及多糖的工藝，其特征是所述的一級(jí)種子培養(yǎng)，培養(yǎng)基組成是(g/100ml)葡萄糖2-4，蛋白胨0.03-0.7，玉米漿0.5-1.5，玉米粉0.5-2，麩皮汁1-3，KH2PO40.1-0.5，MgSO40.01-0.2，加水定容至所需體積，pH值為4.0-5.0，接種量為4-10％，培養(yǎng)條件是培養(yǎng)溫度25-33℃，罐壓0.5-0.9kPa，攪拌速率80-150rpm/min，通氣量1∶0.3-0.5v/v.m，發(fā)酵30-55小時(shí)，然后轉(zhuǎn)接入發(fā)酵罐發(fā)酵。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液體深層發(fā)酵生產(chǎn)桑黃水提取物及多糖的工藝，其特征是所述的發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基組成是(g/100ml)葡萄糖2-4，蛋白胨0.3-0.7，玉米漿0.5-1.5，玉米粉0.5-2，麩皮汁1-3，KH2PO40.1-0.5，MgSO40.01-0.2，加水定容至所需體積，pH值為4.0-5.0，接種量為4-10％，培養(yǎng)條件是培養(yǎng)溫度25-33℃，罐壓0.5-0.9kPa，攪拌速率80-150rpm/min，通氣量1∶0.3-0.5v/v.m，發(fā)酵120-200小時(shí)，當(dāng)發(fā)酵液還原糖含量降到1.0-2.0％時(shí)，為發(fā)酵終了。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液體深層發(fā)酵生產(chǎn)桑黃水提取物及多糖的工藝，其特征是所述的發(fā)酵培養(yǎng)，可選擇1000-5000L的發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液體深層發(fā)酵生產(chǎn)桑黃水提取物及多糖的工藝，其特征是將終了發(fā)酵液溫度加熱到60-100℃，攪拌速度為150-250rpm/min，維持2-4小時(shí)，用泵將發(fā)酵液輸送到貯罐中，經(jīng)板框壓濾得到清液，清液濃縮至體積為原體積1/4-1/10，噴霧干燥得到桑黃水提取物；或?qū)⑶逡簼饪s后用適量乙醇沉淀，醇析液乙醇濃度為75％，醇析20-30小時(shí)，取沉淀物加適量水溶解，噴霧干燥可得桑黃多糖。
全文摘要
大規(guī)模液體深層發(fā)酵生產(chǎn)桑黃水提取物及多糖工藝。本發(fā)明以大規(guī)模液體深層發(fā)酵生產(chǎn)桑黃水提取物及多糖為目標(biāo)，以中國(guó)微生物菌種保藏中心的桑黃真菌為出發(fā)菌株，采用斜面菌種進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)、液體搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)、一級(jí)種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)，最終發(fā)酵罐體積達(dá)1000－5000L。發(fā)酵結(jié)束后，將終了發(fā)酵液溫度加熱到60－100℃，攪拌速度為150－250rpm/min，維持2－4小時(shí)，用泵將發(fā)酵液輸送到貯罐中，經(jīng)板框壓濾，清液濃縮，噴霧干燥得到桑黃水提取物，如將清液濃縮后用適量乙醇沉淀，取沉淀物加適量水溶解，噴霧干燥可得桑黃多糖。
文檔編號(hào)C12P1/04GK1556212SQ200410013869
公開(kāi)日2004年12月22日 申請(qǐng)日期2004年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月7日
發(fā)明者敖宗華, 符慧子, 鄒錫良 申請(qǐng)人:敖宗華, 符慧子, 鄒錫良