亚洲成年人黄色一级片,日本香港三级亚洲三级,黄色成人小视频,国产青草视频,国产一区二区久久精品,91在线免费公开视频,成年轻人网站色直接看

一個與精神分裂癥密切相關聯(lián)的易感基因的制作方法

文檔序號:561641閱讀:368來源:國知局
專利名稱:一個與精神分裂癥密切相關聯(lián)的易感基因的制作方法
技術領域
本發(fā)明涉及一個與精神分裂癥有顯著關聯(lián)的易感基因KPNA3。
背景技術
精神分裂癥是最嚴重的精神疾病之一。在我國,精神分裂癥的終身患病率高達0.7%。這樣大的患病群體,不僅給家庭和社會帶來沉重的經濟負擔,而且還嚴重威脅社會的安全與穩(wěn)定。因此,確定精神分裂癥的病因,建立有效地防治方法,已成為醫(yī)學界乃至整個社會需迫切解決的問題。精神分裂癥與遺傳因素有密切關系,且歸類于多基因遺傳病。人類基因組系統(tǒng)掃描發(fā)現(xiàn),除19號、21號和Y染色體外,其余染色體上都可能含有精神分裂癥易感基因。利用連鎖和關聯(lián)方法定位精神分裂癥的易感基因已成為分子遺傳學研究的熱點。Campbell等報道13q14區(qū)域可能存在精神分裂癥易感基因(Campbell DA,et al.GenetTest.1997-98;1(4)297-9),并發(fā)現(xiàn)5-HT2a基因與精神紊亂或精神分裂癥有關聯(lián)。但至今在該染色體區(qū)域內未發(fā)現(xiàn)確定特異的與精神分裂癥有關的易感基因。Riley BP等報道在染色體13q14.1-q32區(qū)域內可能存在與精神分裂癥相關的基因(Riley BP,et al.Psychiatr Genet.1998;8(3)155-62)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的之一是在第13號染色體區(qū)域內揭示與精神分裂癥密切相關聯(lián)的易感基因;目的之二是通過該易感基因遺傳特性提出一種判定精神分裂癥的易感人群的方法,以利于指導精神分裂癥的預防和治療。
本研究結果表明,KPNA3基因是與精神分裂癥密切相關聯(lián)的易感基因,是含有兩個單核苷酸多態(tài)性的序列長度為93596bp的KPNA3(Karyopherin alpha 3)基因,由于該基因的單核苷酸多態(tài)性rs3782929堿基A突變?yōu)镚,從而與精神分裂癥的易感性相關聯(lián)。
從人類胎兒大腦的cDNA文庫中分離出不同的基因命名為KPNA3,編碼一種與異爪蛙和人的核轉運蛋白高度同源性的蛋白,完整的cDNA克隆包含一個開放的閱讀框架,長度為1563bp,編碼521個氨基酸。KPNA3蛋白包含N-末端importin-beta-binding(IBB)結構域、8犰狳重復序列和C-末端酸性區(qū)域,importin-alphas都具備這些特征。在已知的人類importin-alphas中,KPNA3與KPNA4有高度的同源性。KPNA3在不同組織中表達水平不同,在睪丸和結腸中高表達,其氨基酸序列分別與異爪蛙importin、酵母菌SRP1和人類的RCH1(KPNA2)高度同源,表明KPNA3可能與核轉運系統(tǒng)有關。
KPNA3基因位于13q14.3染色體區(qū)域。目前,有關karyopherin alpha基因家族成員與精分癥的關系尚未見研究報道。本研究結果表明KPNA3是精神分裂癥的易感基因,序列長度為93596bp,由于該基因的單核苷酸多態(tài)性rs3782929堿基A突變?yōu)镚,從而與精神分裂癥的易感性相關聯(lián)。
本發(fā)明在13q14區(qū)通過連鎖不平衡分析方法進行單個核苷酸多態(tài)性(SNPs)連鎖不平衡分析,通過NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/mapviewer)數據庫、http//www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP及http//snp.cshl.org/數據庫,在KPNA3基因上選擇含有TaqI限制性酶切位點的單核苷酸多態(tài)性rs3782929和含有RsaI限制性酶切位點的單核苷酸多態(tài)性rs3736830。以下所示為這兩個單核苷酸多態(tài)性的核苷酸序列。加黑部分分別為引物序列,方框內是發(fā)生互換的堿基,劃線處則是限制性內切酶識別的酶切位點,箭頭所示內切酶的切割部位。具體信息如下。
Rs3782929,Gene bank accession numberAL135901.2 Base changeA/G146101 ctctcttgaa ggaagcagtg ccttctttta cattttggca caagctccct aacttgtcac146161 agatcaggac ttttgagtag cacggcctat atctgaagta tttgtcttaa aacttcaata146221 catgacttaa atataagtgc atatttttag agatcataat taaatttaat tcgtgaatat 146341 gagacttagg agttatttgg gaggctgggg tggagggatg tagatggata gtgaatgtgg146401 ttattatctg cactttagaa gcttacaatc taagggaaaa tgaaatattc aaagcaaaatRs3736830,Gene bank accession numberAL135901.2 Base changeC/G 135421 tcctaataaa gactataaat atttgagata agttaaaaca ggcaataaac aggagataaa135481 aatttcctag aaaacataca catccttcag aaatgaaaac gagaagcact ctgggtctgc以中國東北地區(qū)187個漢族精神分裂癥患者和他們健康父母雙親組成的核心家系(Trios)為研究對象?;颊呔?000~2002年間入院,按國際疾病分類標準第10版(ICD-10)被診斷為精神分裂癥。這種基于家系的研究,系以父母雙親傳遞給患病子女的等位基因為“病例”,以未傳遞的等位基因為“對照”。因病例與對照等位基因均來自同樣的基因池,可避免人群層化問題。
家系成員均由外周靜脈抽取抗凝血5ml,用星普液體微量DNA提取試劑盒(寧波)提取基因組DNA。步驟如下①取血樣100μl,加入到1.5ml離心管中,然后加入100ul的1×TE緩沖液,搖勻;②一邊振蕩,一邊加入200μl的B1試劑,充分混勻;③在振蕩中加入200μl的B2試劑,充分混勻;④將混合溶液移入旋轉離心柱中離心(14000rpm,分鐘);⑤向旋轉離心柱中加入400μl的B3試劑后離心(14000rpm,1分鐘);⑥重復上述步驟;⑦空柱離心(14000rpm,2分鐘),將旋轉離心柱移入干凈的1.5ml離心管中,加入100μl的B4試劑離心(14000rpm,1分鐘);此時離心管中的溶液體積為100μl,含有已經提取的基因組DNA。使用美國BECKMAN公司生產的型號為Du640紫外分光光度儀,分別取波長260nm、280nm兩個波段,測得其相應DNA的OD260nm及OD280nm值,然后再通過公式,計算出DNA含量,公式為DNA含量=50mg/ml×OD260nm×稀釋倍數,另外通過公式計算出DNA純度,公式為DNA純度=OD260nm/OD280nm。
依據相應的堿基序列合成引物,rs3782929序列為TGAGTAGCACGGCCTATATCTG和CCACATTCACTATCCATCTACATC,rs3736830 GACTCAAACATTATTTGGGTTGTTTTAAAATATTA和CGAGAAGCACT CTGGGTCTG。PCR反應體系為25μl,其中含10mM Tris-HCl(pH8.3),50mM KCl,1.5mMMgCl2,0.001%(w/v)gelatin,200μM ofeach dNTP,上下游引物各0.4μM,Taq DNA聚合酶(Promega)1.0U,DNA模板30-50ng。PCR擴增條件為①94℃5min②96℃45s,63℃1min,72℃1min 3個循環(huán);③95℃45s,61℃1min,72℃1min 5個循環(huán);④94℃45s,59℃1min,72℃1min 27個循環(huán);⑤72℃10min。取PCR產物5μl用1.5%瓊脂糖凝膠電泳,以DNA marker DL2000為分子量標準品。所擴增的片段長度分別為227bp(146173~146400)和165bp(135375~135539)。
在PCR擴增后的反應體系中,加入限制性內切酶TaqI 0.7μl,酶切緩沖液2μl,BSA0.2μl。置50℃溫箱3小時。經2.5%瓊脂糖凝膠電泳,根據酶切圖譜判斷基因型。存在3種基因型,其中有完全切開的純合基因型,未切開的純合基因型,既有切開又有未切開的雜合基因型。
建立Pedigree和SPSS SNP基因分型數據庫(參見表3和表4),應用擬合優(yōu)度卡方檢驗和傳遞不平衡檢驗,應用UNPHASED分析軟件進行單倍體傳遞卡方檢驗,利用SPSS軟件管理數據。
傳遞不平衡檢驗(Transmitted disequilibrium test,TDT)顯示rs3782929與精神分裂癥顯著關聯(lián)(x2=6.721,P=0.010)。在187個家系374個父母中,172個為雜合子,而這些雜合父母分別將69個A等位基因和103個G等位基因傳遞給患病子女(參見表1)。由于G等位基因傳遞過多,說明含G等位基因的單倍體或染色體可能攜帶決定精神分裂癥易感性的突變位點。
單倍體傳遞卡方檢驗(Haplotype transmission chi-square test)顯示有一種單倍體與精神分裂癥密切相關聯(lián),即Rs3782929(G)-Rs3736830(G)單倍體(參見表2)。單倍體可以是一條染色體或一段染色體。故此結果進一步說明KPNA3基因Rs3782929和Rs3736830之間的染色體區(qū)域存在決定精神分裂癥易感性的突變位點。
根據本發(fā)明由KPNA3基因堿基突變特性判定精神分裂癥的易感人群的方法,可對未表現(xiàn)精神分裂癥臨床癥狀的人群進行如下所示方法的篩查,rs3782929堿基為G的個體為精神分裂癥的易感人群。Rs3782929堿基為A的個體不易發(fā)生精神分裂癥。對精神分裂癥易感人群在日常生活中應盡量減少誘發(fā)因素,如環(huán)境因素的刺激,可降低精神分裂癥的發(fā)病率。這是本發(fā)明的一個重要用途。
根據本發(fā)明,對精神分裂癥的患者可采用如基因敲除等基因工程方法針對性進行基因治療。另外,疾病基因的存在有可能導致蛋白質產物結構與功能的缺損或改變,阻礙或干擾特定生化通路中生物大分子的相互作用。正因為KPNA3基因的堿基突變,可能造成蛋白質表達及功能異常。本發(fā)明為進一步檢測蛋白功能,開發(fā)新型治療藥物,開展基于遺傳學背景的個體化藥物治療奠定了十分重要的基礎,并將帶來十分可觀的社會與經濟效益。
表1.KPNA3基因與精神分裂癥的關系限制性等位基因 傳遞等位基因SNPsP內切酶主等位基因 次等位基因主等位基因 次等位基因Rs3782929 TaqI G A 103 69 0.010Rs3736830 RsaI G C 102 87 0.275注傳遞等位基因指雜合父母傳遞給患病子女的等位基因數目表2.單倍體傳遞卡方檢驗結果單倍體 x2dfRs3782929(G)-Rs3736830(C)0.00641 NSRs3782929(A)-Rs3736830(C)1.81461 NSRs3782929(G)-Rs3736830(G)6.60951 0.010Rs3782929(A)-Rs3736830(G)2.58641 NSNS無顯著性差異表3.Pedigree數據庫格式Number 病人 父親 母親性別 狀態(tài) TaqI RsaIABC91 2 3 2 21/2 1/2ABC92 0 0 1 11/2 2/2ABC93 0 0 2 11/1 1/2ABC11 1 2 3 2 21/2 2/2ABC11 2 0 0 1 12/2 1/2ABC11 3 0 0 2 11/1 1/2ABC14 1 2 3 1 22/2 1/2ABC14 2 0 0 1 11/2 2/2ABC14 3 0 0 2 11/2 1/2表4.SPSS數據庫格式
具體實施例方式
通過提取受試者基因組DNA進行單核苷酸多態(tài)性rs3782929的基因型分析,其rs3782929堿基為G的個體為精神分裂癥的易感人群。
1.基因組DNA提取受試者均由外周靜脈抽取抗凝血5ml,用星普液體微量DNA提取試劑盒(寧波)提取基因組DNA。步驟如下①取血樣100μl,加入到1.5ml離心管中,然后加入100μl的1×TE緩沖液,搖勻;②一邊振蕩,一邊加入200μl的B1試劑,充分混勻;③在振蕩中加入200μl的B2試劑,充分混勻;④將混合溶液移入旋轉離心柱中離心(14000rpm,分鐘);⑤向旋轉離心柱中加入400μl的B3試劑后離心(14000rpm,1分鐘);⑥重復上述步驟;⑦空柱離心(14000rpm,2分鐘),將旋轉離心柱移入干凈的1.5ml離心管中,加入100μl的B4試劑離心(14000rpm,1分鐘);此時離心管中的溶液體積為100μl,含有已經提取的基因組DNA。使用美國BECKMAN公司生產的型號為Du640紫外分光光度儀,分別取波長260nm、280nm兩個波段,測得其相應DNA的OD260nm及OD280nm值,然后再通過公式,計算出DNA含量,公式為DNA含量=50mg/ml×OD260nm×稀釋倍數,另外通過公式計算出DNA純度,公式為DNA純度=OD260nm/OD280nm。
2.PCR擴增目的片段應用以下引物序列TGAGTAGCACGGCCTATATCTG和CCACATTCACTATCCATCTACATC進行PCR擴增。PCR反應體系為25μl,其中含10mMTris-HCl(pH 8.3),50mM KCl,1.5mM MgCl2,0.001%(w/v)gelatin,200μM of dNTP,上下游引物各0.4μM,Taq DNA聚合酶(Promega)1.0U,DNA模板30-50ng。PCR擴增條件為①94℃5min②96℃45s,63℃1min,72℃1min 3個循環(huán);③95℃45s,61℃1min,72℃1min 5個循環(huán);④94℃45s,59℃1min,72℃1min 27個循環(huán);⑤72℃10min。取PCR產物5μl用1.5%瓊脂糖凝膠電泳,以DNA marker DL2000為分子量標準品。所擴增的片段長度為227bp(146173~146400)。
3.限制性內切酶酶切鑒定基因型酶切的反應體系為20μl,其中,10μl PCR產物,限制性內切酶TaqI 0.7μl,酶切緩沖液2μl,BSA 0.2μl。置50℃溫箱3小時。經2.5%瓊脂糖凝膠電泳,根據酶切圖譜判斷基因型。存在3種基因型,其中有完全切開的純合基因型(G/G),未切開的純合基因型(A/A),既有切開又有未切開的雜合基因型(G/A)。
4.結果判定rs3782929堿基為G的個體為精神分裂癥的易感人群。rs3782929堿基為A的個體不易發(fā)生精神分裂癥。
權利要求
1.一個與精神分裂癥密切相關聯(lián)的易感基因,是含有兩個單核苷酸多態(tài)性的序列長度為93596bp的KPNA3基因,由于該基因的單核苷酸多態(tài)性rs3782929堿基A突變?yōu)镚,從而與精神分裂癥的易感性相關聯(lián)。
2.一種根據權利要求1所述的KPNA3基因堿基突變特性判定精神分裂癥的易感人群的方法,其特征是通過提取受試者基因組DNA進行單核苷酸多態(tài)性rs3782929的基因型分析,其rs3782929堿基為G的個體為精神分裂癥的易感人群,具體作法是(1)基因組DNA提取,用微量DNA提取試劑盒提取基因組DNA,(2)PCR擴增目的片段,引物序列為TGAGTAGCACGGCCTATATCTG和CCACATTCACTATCCATCTACATC,(3)限制性內切酶酶切鑒定基因型,酶切的反應體系為20μl,其中,10μlPCR產物,限制性內切酶TaqI0.7μl,酶切緩沖液2μl,BSA0.2μl,置50℃溫箱3小時,經2.5%瓊脂糖凝膠電泳,根據酶切圖譜判斷基因型,(4)結果判定,rs3782929堿基為G的個體為精神分裂癥的易感人群,Rs3782929堿基為A的個體不易發(fā)生精神分裂癥。
全文摘要
本發(fā)明提供一個與精神分裂癥的發(fā)生密切相關的易感基因,即含有兩個單核苷酸多態(tài)性的序列長度為93596bp的KPNA3(Karyopherin alpha 3)基因。由于該基因的單核苷酸多態(tài)性rs3782929堿基A突變?yōu)镚,從而與精神分裂癥的易感性相關聯(lián)。rs3782929堿基為G的個體為精神分裂癥的易感人群。Rs3782929堿基為A的個體不易發(fā)生精神分裂癥。該基因決定精神分裂癥易感性。KPNA3基因及其編碼蛋白對闡明精神分裂癥遺傳學機制及建立基因診斷方法,指導精神分裂癥預防、開發(fā)新型治療藥物具有重要作用。
文檔編號C12N15/12GK1629292SQ20041001110
公開日2005年6月22日 申請日期2004年9月23日 優(yōu)先權日2004年9月23日
發(fā)明者尉軍, 于雅琴, 張海英, 鞠桂芝, 劉樹錚, 沈巖, 張萱, 史杰萍, 謝林, 許琪, 胡穎 申請人:吉林大學
網友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1