專利名稱：微生物轉(zhuǎn)化制備香草醛的菌種及其方法
所屬領(lǐng)域本發(fā)明屬生物催化領(lǐng)域，涉及一種微生物朱紅密孔菌Pycnoporuscinnabarinus及其突變株，及用于轉(zhuǎn)化香草酸制備香草醛的方法。
背景技術(shù)：
香草醛，即香蘭素，化學(xué)名4-羥基3-甲氧基苯甲醛，是目前世界上產(chǎn)量最大的合成香料，廣泛應(yīng)用于食品、飲料、香料、醫(yī)藥、皮革、電鍍等行業(yè)。在食品中香草醛是香草、巧克力、奶油等香味的主要原料，被認(rèn)為是最重要的安全食用香料之一。
香草醛的生產(chǎn)方法主要是化學(xué)合成和天然提取，用兩種方法制備的產(chǎn)品在產(chǎn)量和價格上差異極大?；瘜W(xué)合成香草醛售價12$/kg左右，世界年產(chǎn)量超過1.2萬噸，而天然提取的售價1,200~4,000美元$/kg，由于受香莢蘭豆的產(chǎn)量的限制，天然香蘭素年產(chǎn)只有約20噸?；瘜W(xué)法合成香草醛雖然方法簡單，能大規(guī)模生產(chǎn)，但卻存在容易造成環(huán)境污染、采用的原料如愈創(chuàng)木酚有毒等弊端。隨著人們對健康與長壽意識的增強，世界各國對安全食品的日益重視，天然香草醛的需求不斷增加。但是，從植物中提取的方法生產(chǎn)天然香草醛，產(chǎn)率低、成本高、價格昂貴。由此，促使人們尋找采用廉價、可再生的、天然原料生產(chǎn)天然香草醛的替代方法。Lesage-Meessen(US5866380)等開發(fā)了用兩種微生物分步轉(zhuǎn)化阿魏酸制備香草醛的工藝，第一步在黑曲霉Aspergillus niger CNCM I-1472(即MIC373)菌株的發(fā)酵液中，流加終濃度為5.05g/L的阿魏酸，經(jīng)16天的轉(zhuǎn)化，發(fā)酵液中的阿魏酸完全消耗，大部分轉(zhuǎn)化為香草酸，香草酸的濃度達(dá)到3.6g/L，或者在西唐氏鐮霉菌Streptomyces setoniiATCC25497的發(fā)酵液中，流加終濃度為0.88g/L的阿魏酸，經(jīng)100h的轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)液中產(chǎn)生0.33g/L的香草酸；第二步培養(yǎng)擔(dān)子菌屬微生物如黃孢原毛平革菌Phanerochaeyte chrysosporium CNCMI-1471(即MIC247)，在培養(yǎng)過程中加入用含有纖維二糖的碳源和從第一步中轉(zhuǎn)化得到的香草酸，發(fā)酵培養(yǎng)6天，產(chǎn)生0.642g/L的香草醛。后續(xù)的研究報道(C.Stenielaire；L.Lesage-meessen.；A.Oddou.；et al.J ofBiosciandBioengineering，2000，89(3)223-230.)在轉(zhuǎn)化過程中添加選擇性樹脂XAD-2，減少香草醛對菌株的毒性，香草醛的產(chǎn)量達(dá)到1.57g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率82.1％。這種以阿魏酸為前體通過兩種微生物的轉(zhuǎn)化制備香草醛的方法，涉及到兩種微生物的培養(yǎng)，兩次底物的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，和中間產(chǎn)物的提取，整個生產(chǎn)流程長，生產(chǎn)效率低。
技術(shù)方案本發(fā)明提供了一種直接以香草酸為前體，通過朱紅密孔菌轉(zhuǎn)化香草酸制備香草醛的方法，具有對環(huán)境友好，反應(yīng)條件溫和，有害物質(zhì)含量低，并且不受種植業(yè)的影響，可大規(guī)模生產(chǎn)，生產(chǎn)周期短的優(yōu)點。與上述的生物方法相比，簡化了香草醛的生產(chǎn)工藝，降低生產(chǎn)能耗。
本發(fā)明中能有效轉(zhuǎn)化香草酸為香草醛的微生物，是白腐真菌類的朱紅密孔菌Pycnoporus cinnabarinus分類屬于真菌界，擔(dān)子菌門，擔(dān)子菌綱，多孔目，多孔科，密孔屬(Dictionary of the Fungi，9th ed.)，這種真菌分布于世界各地，生長在櫟、樺、椴及松等針闊葉木材上，引起木材腐朽(戴芳瀾，中國真菌總匯，北京科學(xué)出版社，1979，745)。在馬鈴薯培養(yǎng)基上，菌絲生長初期、中期呈白色毛絨狀，后期菌苔反面微淡褐色；在含有香草酸的平板上，生長初期，有白色絨毛狀單菌落和半透明狀菌落生長，后期菌落周圍呈紅褐色；菌絲細(xì)長有隔。
此菌株已于2004年3月17日保存在中國北京中關(guān)村中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物保藏中心，保存號CGMCC No.1115。
該菌及其突變株在含有1g/L香草醛以上的固體平板上不生長，斜面培養(yǎng)基的成分為1000ml馬鈴薯浸汁(含去皮馬鈴薯200g)中含50~250g，葡糖糖1~15g，硫酸鎂0.1~1g，磷酸二氫鉀0.2~5g，蛋白胨1~5g，瓊脂15~20g，pH自然；斜面培養(yǎng)溫度20~35℃，培養(yǎng)時間5~10天。
本發(fā)明采用微生物轉(zhuǎn)化香草酸制備香草醛的方法包括(1)將權(quán)利要求1所述的朱紅密孔菌SW-0203或其突變株進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)、發(fā)酵，以發(fā)酵液中的生長細(xì)胞，或分離獲得的游離細(xì)胞，或用海藻酸鈣等載體固定化的細(xì)胞作為香草酸轉(zhuǎn)化反應(yīng)的生物催化劑；(2)將香草酸配制成溶液作為生物轉(zhuǎn)化的底物；(3)用(1)的生物催化劑對(2)底物溶液進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，生成香草醛；
(4)在(3)的反應(yīng)液中加入吸附劑，并用有機溶劑提取產(chǎn)物；(5)對提取液進(jìn)行脫水、濃縮，并用非極性溶劑結(jié)晶，獲得香草醛粗品；(6)用乙醇~水溶液對香草醛粗品進(jìn)行重結(jié)晶。
生物催化劑的制備將在試管斜面中生長好的朱紅密孔菌CGMCC No.1115或其突變株，在液體搖瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)。然后按5~15％的種量接入裝有50~300ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基的成份為葡萄糖0.1~20g/L，牛肉膏0.1~15g/L，酵母膏0.1~10g/L，磷酸二氫鉀0.1~0.2g/L，硫酸鎂0.1~0.5g/L，氯化鈣0.1~1.32mg/L。培養(yǎng)基的起始pH3~8，搖床轉(zhuǎn)速100~250r/min，培養(yǎng)溫度20~35℃，培養(yǎng)時間24~72h后，得到用于香草酸轉(zhuǎn)化的發(fā)酵液?；蛘撸瑢l(fā)酵液過濾，得到濕菌體，直接用于香草酸的轉(zhuǎn)化。也可，用生理鹽水制成菌絲體懸液，與海藻酸鈉、卡拉膠、殼聚糖、明膠等載體混合制成固定化細(xì)胞用于轉(zhuǎn)化。濕菌體和固定化細(xì)胞可反復(fù)利用。
香草酸底物溶液的配制用0.1N的氫氧化鈉溶液，按每g香草酸約57ml堿溶液制成100g/L的pH7.2的鈉鹽水溶液，0.1Mpa下滅菌20分鐘，作為配制底物溶液用的原液保存，使用時按所需要的濃度稀釋至含香草酸1~10g/L。
微生物對香草酸的轉(zhuǎn)化反應(yīng)將濕菌體和固定化細(xì)胞與底物溶液混合，濕菌體和固定化細(xì)胞的加入量為每g底物加5~100g(以濕菌體計)，底物的濃度為1~10g/L。轉(zhuǎn)化反應(yīng)的溫度為20~40℃，轉(zhuǎn)化過程中可加1~15g/L葡萄糖，當(dāng)反應(yīng)液中出現(xiàn)香草醛時，加入1~20％(質(zhì)量體積)的X-5、201X7、DA201、D4020、AKA-9、HZ802、HZ816、HPD100A、HPD600、HPD300等大孔吸附樹脂。當(dāng)反應(yīng)液中香草酸基本被消耗完時，結(jié)束反應(yīng)，轉(zhuǎn)化時間6~60h。濕菌體和固定化細(xì)胞可反復(fù)回用，進(jìn)行數(shù)次反應(yīng)。
香草醛的分離與純化分離反應(yīng)液中的吸附樹脂，用乙醇、或甲醇、或乙酸乙酯等有機溶劑進(jìn)行洗脫，香草醛集中在有機相中，有機溶劑的加量在15~40g/g產(chǎn)物。含有香草醛的有機相，經(jīng)飽和氯化鈉等脫水后，在30~70℃下真空濃縮，得到100~500g/L的香草醛濃縮液。濃縮液中加入1~10倍體積的正己烷或苯等非極性溶劑進(jìn)行攪拌，得到純度為70~90％的香草醛粗結(jié)晶。再用乙醇-水體積比為0.01~0.8∶1的溶液溶解，加熱至60~85℃，至香草醛粗晶體完全溶解后，冷卻至0~10℃，靜止結(jié)晶，濾去母液，用冷乙醇洗滌，40℃下真空干燥，得到純度為99％的香草醛晶體。
本發(fā)明突出的特點是通過以簡單的葡糖糖為碳源的培養(yǎng)基，培養(yǎng)朱紅密孔菌Pycnoporus cinnabarinus CGMCC No.1115，就能有效地轉(zhuǎn)化底物香草酸生成香草醛，微生物的轉(zhuǎn)化效率高，對底物的摩爾轉(zhuǎn)化率為30~80％，轉(zhuǎn)化液中副產(chǎn)物少，產(chǎn)物易于提取，提取收率60~90％，所得到香草醛的純度高。并且，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化工藝即可直接用發(fā)酵培養(yǎng)液添加香草酸進(jìn)行轉(zhuǎn)化，也可用發(fā)酵后分離到的游離菌絲體或制成的固定化細(xì)胞加香草酸溶液進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
實施例實施例1配制斜面培養(yǎng)基，1000ml馬鈴薯浸汁(含去皮馬鈴薯200g)中含葡萄糖20g，硫酸鎂0.1g，磷酸二氫鉀0.25g，蛋白胨1g，瓊脂20g，pH自然，裝入玻璃試管中，滅菌后冷卻，接入朱紅密孔菌Pycnoporus cinnabarinus CGMCC No.1115，30℃培養(yǎng)5天，作為活化種子。
配制發(fā)酵培養(yǎng)基，葡萄糖20g/L，牛肉膏6g/L，酵母膏0.1/L，磷酸二氫鉀0.2g/L，氯化鈣1.32mg/L，硫酸鎂0.5g/L，鹽酸硫胺素3.5mg/L，pH5.0。500ml三角瓶中裝液220ml，120℃滅菌20分鐘，冷卻后接入種子。30℃、120r/min培養(yǎng)48h后，補加終濃度為5g/L的葡萄糖，并加入2g/L的底物香草酸，轉(zhuǎn)化42h，測定香草醛的含量為0.724g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率40％。
實施例2按實施例1的方法制備種子，以10％的種量接入25L發(fā)酵罐中發(fā)酵，控制溫度30℃、罐壓0.1Mpa，轉(zhuǎn)速150r/min，通氣量1∶1v/v，菌體生長48h時，加入終濃度2g/L的香草酸溶液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并將溫度升為35℃，通氣量降為0.3∶1v/v，添加300g樹脂HZ802，轉(zhuǎn)化72h時測定香草醛的含量為1.30g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率71％。
實施例3按實施例1的方法，朱紅密孔菌CGMCC No.1115發(fā)酵培養(yǎng)48h，過濾得到朱紅密孔菌游離菌絲體。用生理鹽水配制成3％海藻酸鈉溶液，煮沸溶解，與生理鹽水調(diào)制的菌絲體懸浮液混合攪拌均勻，用滴管滴入0.1mol/L CaCl2中，得到海藻酸鈣包埋細(xì)胞。在150mL三角瓶中，裝30mL轉(zhuǎn)化液和30g固定化細(xì)胞，在溫度35℃下轉(zhuǎn)化反應(yīng)48h，測定溶液中香草醛的含量。表1結(jié)果表明，重復(fù)使用3次，第4次轉(zhuǎn)化能力下降。
表1固定化細(xì)胞反復(fù)分批轉(zhuǎn)化結(jié)果反復(fù)利用次數(shù) 1 2 3 4香草醛濃度(g/L) 0.444 0.645 0.489 0.195實施例4按實施例2的方法，得到2400g吸附香草醛的樹脂(測定含香草醛20.6g)，用1660ml乙酸乙酯抽提三次，得到4670ml有機相，HPLC測得含3.728g/L香草醛，用250g無水硫酸鎂脫水，35℃真空濃縮到75ml，加入150ml正己烷，得到粗晶體17.7g，經(jīng)HPLC測定其含量為82.7％。
實施例5取實施例4中得到的粗結(jié)晶1.89g，加12倍量85℃的乙醇-水溶液溶解，乙醇-水溶液的體積比為0.25∶1，調(diào)pH7.0，冷卻，去除先析出的棕色油狀物，再冷卻析出晶體，經(jīng)過濾后于50℃烘干，得到淡黃色結(jié)晶，HPLC測定含量95％，重復(fù)進(jìn)行二次重結(jié)晶得到0.87g白色結(jié)晶，HPLC測定純度為99％。
權(quán)利要求
1.一種能有效轉(zhuǎn)化香草酸為香草醛的微生物菌株，其特征是擔(dān)子菌屬(Basidiomycetes)的朱紅密孔菌Pycnoporus cinnabarinus及其突變株。
2.一種用微生物轉(zhuǎn)化制備香草醛的方法，包括(1)將權(quán)利要求1所述的朱紅密孔菌或其突變株進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)、發(fā)酵，以發(fā)酵液中的生長細(xì)胞，或分離獲得的濕菌體、固定化細(xì)胞作為香草酸轉(zhuǎn)化反應(yīng)的生物催化劑；(2)將香草酸配制成溶液作為生物轉(zhuǎn)化的底物；(3)用(1)的生物催化劑對(2)的底物溶液進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，生成香草醛；(4)在(3)的反應(yīng)液中加入吸附劑，并用有機溶劑提取產(chǎn)物；(5)對提取液進(jìn)行脫水、濃縮，并用非極性溶劑結(jié)晶，獲得香草醛粗品；(6)用含有乙醇的水溶液對香草醛粗品進(jìn)行重結(jié)晶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(1)中菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基含有葡萄糖0.1~20g/L，牛肉膏0.1~15g/L，酵母膏0.1~10g/L，磷酸二氫鉀0.1~0.2g/L，硫酸鎂0.1~0.5g/L，氯化鈣0.1~1.32mg/L，培養(yǎng)基起始pH3~8，培養(yǎng)溫度20~35℃，500ml三角瓶裝液50~300ml，搖床轉(zhuǎn)速100~250r/min，培養(yǎng)時間24-72h。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(2)中的底物溶液中香草酸濃度1~10g/L，加入生物催化劑的量為5~100g/g底物(以濕菌體計)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，步驟(3)中轉(zhuǎn)化反應(yīng)的溫度20~40℃，轉(zhuǎn)化時間6~72h。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的吸附劑為大孔吸附樹脂X-5、201X7、DA201、D4020、AKA-9、HZ802、HZ816、HPD100A、HPD600、HPD300。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的有機溶劑為乙醇、甲醇或乙酸乙酯，加入量為15~40g/g產(chǎn)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的非極性溶劑為正己烷或苯，加入量為1~10倍提取液。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的含有乙醇的水溶液中乙醇-水的體積比為0.01~0.8∶1。
全文摘要
本發(fā)明是一種用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)制備香草醛的方法，利用篩選得到的微生物朱紅密孔菌Pycnoporus cinnabarinus轉(zhuǎn)化香草酸生成香草醛。具體包括朱紅密孔菌在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下發(fā)酵；其發(fā)酵液或游離細(xì)胞或固定化細(xì)胞能將1~10g/L的香草酸轉(zhuǎn)化為香草醛，對底物的摩爾轉(zhuǎn)化率為30~80％；轉(zhuǎn)化液通過樹脂吸附、溶劑抽提和結(jié)晶，得到淡黃色晶體，收率60~90％；用含有乙醇的水溶液重結(jié)晶后得到純度為99％的香草醛結(jié)晶。
文檔編號C12P7/24GK1670182SQ200410008769
公開日2005年9月21日 申請日期2004年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月18日
發(fā)明者孫志浩 申請人:江南大學(xué)