專利名稱：用于防治青枯病的假單胞菌的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于防治作物的青枯病的細(xì)菌的篩選方法。本發(fā)明是申請?zhí)枮?0119018.0、申請日為2000年10月11日、發(fā)明名稱為“施氏假單胞菌Zh9944及其篩選方法和防治青枯病的微生物制劑”的發(fā)明專利申請的分案申請。
背景技術(shù)：
由青枯病假單胞菌引起的青枯病發(fā)病于煙草、番茄、花生、茄子、辣椒等等作物，迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)有效的農(nóng)藥以及防治方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于防治青枯病的假單胞菌的篩選方法。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的技術(shù)方案是采用平皿相互拮抗篩選模型與定向篩選相結(jié)合的方法，具體步驟為①在青枯病發(fā)生地區(qū)的田塊中采集作物發(fā)病株和健康株的根、莖和根圍土；②從采集樣品中分離菌株；③通過分離菌株間的平皿相互拮抗試驗(yàn)和分離菌株的致病性試驗(yàn)，區(qū)分出拮抗菌株和病原菌株兩類；④以生物學(xué)參數(shù)拮抗率、反拮抗率分析拮抗菌、病原菌和其他類之間相互關(guān)系，選出在細(xì)菌分類上屬假單胞桿菌或芽孢桿菌的拮抗菌株；⑤進(jìn)行田間小區(qū)多點(diǎn)試驗(yàn)，以田間防效不小于60％為基準(zhǔn)對選出的拮抗菌株進(jìn)行挑選，所得到的菌株即為有效菌株，從而完成了防治青枯病的假單胞菌的篩選。
上述青枯病發(fā)生地區(qū)的田塊為煙草或番茄青枯病發(fā)生地區(qū)的田塊。
本發(fā)明具有積極的效果(1)由于因青枯假單胞菌引起的青枯病日趨嚴(yán)重(包括感病程度、作物和地區(qū)的上升和擴(kuò)展)，迄今為止無任何農(nóng)藥可治。本發(fā)明所提供的方法可以對防治細(xì)菌性青枯病的細(xì)菌菌株進(jìn)行有效的篩選。(2)本發(fā)明的一個應(yīng)用例中，所篩選的防治青枯病的假單胞菌保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，并命名為PSZh9944。PSZh9944能在感病作物體內(nèi)外拮抗青枯病原菌；該菌株具有在感病作物根際土壤中繁殖的能力，并向作物根部聚集和進(jìn)入根組織內(nèi)部，向上轉(zhuǎn)移至莖。并且定植于根和莖的韌皮部薄壁細(xì)胞間，構(gòu)成所謂“拮抗防線”，并與感病作物形成互生關(guān)系；PSZh9944對青枯假單胞菌拮抗能力的大小與向田間接種PSZh9944的菌量成對應(yīng)關(guān)系。以PSZh9944為主要成分制造出微生物農(nóng)藥，是一種高效、無毒、安全、無殘留的新型微生物農(nóng)藥；這種農(nóng)藥對因青枯假單胞菌引起的煙草、番茄、花生、茄子、辣椒等植物的青枯病有很強(qiáng)的抑制作用，田間防效達(dá)60～80％左右，而且還可使受施作物具有對青枯病害的預(yù)防作用，并能刺激作物生長。
具體實(shí)施例方式
(實(shí)施例1)采用平皿相互拮抗篩選模型與定向篩選相結(jié)合的方法，具體步驟為①于1999年3月自我國江蘇省常州市郊區(qū)的番茄青枯病發(fā)生地區(qū)的田塊中采集發(fā)病株和健康株的根、莖和根圍土；②從采集樣品中分離菌株；③通過分離菌株間的平皿相互拮抗試驗(yàn)和分離菌株的致病性試驗(yàn)，區(qū)分出拮抗菌株和病原菌株兩類；④以拮抗率、反拮抗率等生物學(xué)參數(shù)分析拮抗菌、病原菌和其他類之間相互關(guān)系，選出在細(xì)菌分類上屬假單胞桿菌(Pseudomonas spp.)或芽孢桿菌(Bacills spp.)的拮抗菌株；⑤進(jìn)行田間小區(qū)多點(diǎn)試驗(yàn)，以田間防效不小于60％為基準(zhǔn)對選出的拮抗菌株進(jìn)行挑選，所得到的菌株即為有效菌株，從而完成了防治青枯病的假單胞菌的篩選，所篩選的防治青枯病的假單胞菌于2000年9月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC，保藏編號為NO.0494，名稱為施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)Zh9944(簡稱為PSZh9944菌株)。
(應(yīng)用例)以葡萄糖1.5％、淀粉2.0％、酵母粉1.5％、蛋白胨0.4％，MgSO4為0.05％，KH2PO4為0.05％，CaCO3為0.6％的比例制成培養(yǎng)基，滅菌前pH值為7.2～7.4，在250毫升三角瓶放置70毫升培養(yǎng)基，將實(shí)施例1所得的PSZh9944接種于該培養(yǎng)基中。在30℃、220r.p.m下振蕩培養(yǎng)48小時作為種子液，取1000ml種子液于1噸發(fā)醇罐中，內(nèi)盛600升的上述相同比例的培養(yǎng)基。在30℃，向發(fā)酵罐通風(fēng)、攪拌培養(yǎng)20～24小時。培養(yǎng)終止后，及時將培養(yǎng)液與粒度為過40目篩的礱糠以1∶1～1∶3的比例混合，通風(fēng)干燥至物料含水量為8～15％，活菌量達(dá)1000～6000億CFU/g，色澤為土黃色至褐色。
根據(jù)細(xì)菌性青枯病的發(fā)病原理，對于此類病害的控制，能被普遍接受的方法只能用以生物防治為主的預(yù)防方法，以此達(dá)到阻止青枯病菌侵入植物根內(nèi)潛伏和發(fā)展成為病害。因此，使用本發(fā)明的生物制劑的時機(jī)應(yīng)在播種、假植、定植和定植后的20～60天，總共4～5次，總用量為2～2.5kg(3000億CFU/g)，在使用時以水為“溶劑”、使菌體釋放出來，防效可達(dá)60～80％。具體的應(yīng)用情況見表1和表2。
表1

表2

權(quán)利要求
1.一種用于防治青枯病的假單胞菌的篩選方法，其所采用的是平皿相互拮抗篩選模型與定向篩選相結(jié)合的方法，具體步驟為①在煙草、番茄青枯病發(fā)生地區(qū)的田塊中采集發(fā)病株和健康株的根、莖和根圍土；②從采集樣品中分離菌株；③通過分離菌株間的平皿相互拮抗試驗(yàn)和分離菌株的致病性試驗(yàn)，區(qū)分出拮抗菌株和病原菌株兩類；④以生物學(xué)參數(shù)拮抗率、反拮抗率分析拮抗菌、病原菌和其他類之間相互關(guān)系，選出在細(xì)菌分類上屬假單胞桿菌或芽胞桿菌的拮抗菌株；⑤進(jìn)行田間小區(qū)多點(diǎn)試驗(yàn)，以田間防效不小于60％為基準(zhǔn)對選出的拮抗菌株進(jìn)行挑選，所得到的菌株即為有效菌株，從而完成了防治青枯病的假單胞菌的篩選。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于防治青枯病的假單胞菌的篩選方法，其特征在于步驟①中的青枯病發(fā)生地區(qū)的田塊為煙草或番茄青枯病發(fā)生地區(qū)的田塊。
全文摘要
本發(fā)明屬于細(xì)菌的篩選方法。其步驟為①在青枯病發(fā)生的田塊中采集發(fā)病株和健康株的根、莖和根圍土；②從中分離菌株；③通過分離菌株間的平皿相互拮抗試驗(yàn)和分離菌株的致病性試驗(yàn)區(qū)分出拮抗菌株和病原菌株；④以拮抗率、反拮抗率分析拮抗菌、病原菌和其他類之間相互關(guān)系，選出屬假單胞桿菌或芽孢桿菌的拮抗菌株；⑤以田間防效不小于60％為基準(zhǔn)對選出的拮抗菌株進(jìn)行挑選，所得到的菌株即為有效菌株。以通過本發(fā)明的方法篩選出的防治青枯病的假單胞菌為主要成分的微生物制劑，是一種高效、無毒、安全、無殘留的新型微生物農(nóng)藥。對因青枯假單胞菌引起的煙草、番茄、花生、茄子、辣椒等植物的青枯病有很強(qiáng)的抑制作用，田間防效達(dá)60～80％左右。
文檔編號C12N1/04GK1515666SQ20031012446
公開日2004年7月28日 申請日期2000年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月11日
發(fā)明者楊仲華, 張春明, 任熾麓, 安鳳霞, 任敏, 張逸慶, 張華泉 申請人:常州蘭陵制藥有限公司, 張春明