專利名稱：：殼聚糖在防治植物青枯病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物保護技術(shù)的生物防治領(lǐng)域，尤其涉及殼聚糖在防治植物青枯病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：作物細菌性青枯病是由茄科勞爾氏菌(Ralstoniasolanacear咖)(俗稱青枯菌)引起的一種系統(tǒng)侵染的毀滅性土傳病害，俗稱"植物瘟病"。發(fā)病作物莖葉萎蔫下垂至全株枯死，一般田塊的發(fā)病率為10%_15%，重病田的發(fā)病率高達80%_99%，導(dǎo)致作物產(chǎn)量的嚴(yán)重下降，甚至絕收。病原的寄主范圍廣泛，可侵染44個科的數(shù)百種植物，包括番茄、茄子、煙草、花生、馬鈴薯、香蕉等。雖然不同植物在不同環(huán)境條件下的癥狀和危害程度表現(xiàn)若干差異，但共同特點是細菌從植株根部侵入，通過增殖和一系列生化活動損壞寄主維管束輸導(dǎo)組織，導(dǎo)致植株失水枯萎，死亡。迄今為止，通過采用抗青枯的作物品種去防治青枯病的做法是很少的，因為已出現(xiàn)的品種不僅抗性低而且抗性容易喪失，其他的農(nóng)業(yè)防治手段因受地域條件的限制，也難以大面積推廣。化學(xué)防治上，雖然有農(nóng)用鏈霉素、銅制劑等藥物的出現(xiàn)，但均不是針對青枯病的防治農(nóng)藥，而且防效差，不穩(wěn)定，病原菌極易產(chǎn)生抗藥性，因此市場上尚無防治植物青枯病的有效藥劑。殼聚糖是由甲殼素經(jīng)脫乙?；幚砗蟮漠a(chǎn)物，通常將脫乙酰度大于55%的甲殼素稱作殼聚糖，其學(xué)名為聚氨基葡萄糖，化學(xué)名(1，4)-2-氨基-2-脫氧-13-D-葡萄糖，廣泛存在于蝦、蟹等動物外殼和藻類、真菌的細胞壁中。殼聚糖是一種抗菌譜較廣的天然物質(zhì)，對細菌、酵母菌和真菌等均有不同程度的抑制作用。殼聚糖具有良好的生物相溶性，可生物降解性以及無毒副作用，其分子內(nèi)含有-0H和_朋2-活性基團，易與多種有機物發(fā)生反應(yīng)，目前廣泛應(yīng)用在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、化工、環(huán)境保護和水處理等領(lǐng)域。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種殼聚糖防治植物青枯病中的應(yīng)用，解決了現(xiàn)有藥劑防效差，不穩(wěn)定，病原菌易產(chǎn)生抗藥性的問題。本發(fā)明還提供了一種防治植物青枯病的藥劑，該藥劑以殼聚糖為主要成份，添加常規(guī)的藥用賦形劑，如水、乙酸等，制成水劑、粉劑等劑型。殼聚糖在防治植物青枯病中的應(yīng)用，尤其是在防治番茄、茄子、煙草、花生、馬鈴薯或香蕉青枯病中的應(yīng)用，將植物種子浸泡在上述殼聚糖溶液中或用上述殼聚糖溶液對種植土壤進行澆灌。所選用的殼聚糖的脫乙酰度優(yōu)選大于75%，易獲得，成本低。殼聚糖溶液的制備方法，包括以下步驟將殼聚糖粉末溶于體積百分比為1%的乙酸溶液中，然后添加水配制成濃度為110mg/mL的殼聚糖溶液。乙酸主要是用于調(diào)節(jié)pH至5.6，使得殼聚糖溶解，其用量和濃度可以根據(jù)需要進行調(diào)整。殼聚糖在促進番茄生長和提高番茄抗青枯病性能中的應(yīng)用，將番茄種子浸泡在上述殼聚糖溶液中或用上述殼聚糖溶液對種植土壤進行澆灌，能夠提高番茄葉片中幾丁質(zhì)酶和P-l，3-葡聚糖酶的活性，以及提高番茄植株高度、鮮重和干重。采用上述殼聚糖溶液不僅在離體條件下能抑制青枯菌的生長，而且在番茄活體上也使植株產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性，并能有效降低青枯病的發(fā)生率。圖1為實施例4中種子處理組、土壤澆灌組以及它們的對照組未接種青枯病菌的條件下的幾丁質(zhì)酶活性對照圖；圖2為實施例4中種子處理組、土壤澆灌組以及它們的對照組接種了青枯病菌的條件下的幾丁質(zhì)酶活性對照圖；圖3為實施例5中種子處理組、土壤澆灌組以及它們的對照組未接種青枯病菌的條件下的P-l，3-葡聚糖酶活性對照圖；圖4為實施例5中種子處理組、土壤澆灌組以及它們的對照組接種了青枯病菌的條件下的P-l，3-葡聚糖酶活性對照圖。具體實施例方式實施例l制備殼聚糖溶液將脫乙酰度為75%的殼聚糖粉末溶解于體積百分比為1%的乙酸中，配制成濃度為10mg/mL的殼聚糖溶液，調(diào)節(jié)pH至5.6，用高壓滅菌鍋12rC滅菌20分鐘，待用。pH為5.6、體積百分比為1%的乙酸溶液作為所有涉及殼聚糖處理的對照。當(dāng)然殼聚糖的脫乙酰度也可以大于75%。實施例2檢測殼聚糖對青枯菌的拮抗活性本實施例的青枯菌Rs-f.91由福建農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供，該菌株為試驗材料，其特性對試驗結(jié)果沒有影響。本實施例采用平板對峙法和濾紙片法檢測殼聚糖對青枯菌的拮抗活性，具體方法如下青枯菌Rs-f.91在CPG培養(yǎng)液(蛋白胨10.0g;水解酪蛋白1.Og;葡萄糖5.Og;水1000mL;pH7.0-7.2)上170r/min、3(TC條件下振蕩培養(yǎng)過夜，制得菌懸液。吸取lmL青枯菌菌懸液(108CFU/mL)與15mLCPG固體培養(yǎng)基(蛋白胨10.Og;水解酪蛋白1.Og;葡萄糖5.Og;瓊脂20.Og;水1000mL;pH7.0-7.2)混勻，倒平板待用。平板對峙法在每個平板上用直徑為10mm的打孔器打4個孔，每個孔里加實施例1制得的10mg/mL的殼聚糖溶液(如未特別說明，實施例27的殼聚糖溶液均指實施例1制得的殼聚糖溶液)50yL。濾紙片法將直徑為5mm的無菌濾紙片在10mg/mL的殼聚糖溶液中浸泡10分鐘，每個平板上放4個濾紙片。上述兩種方法均用pH為5.6的體積百分比為1%的乙酸溶液作為空白對照。處理后的平板置于3(TC溫箱培養(yǎng)48小時，待青枯菌大量長起后測量抑菌圈大小，每處理設(shè)4個重復(fù)。結(jié)果顯示，用這兩種方法檢測殼聚糖對青枯菌的拮抗活性都有顯著的效果。其中用濾紙片法的實驗顯示，10mg/mL的殼聚糖在平板上對青枯菌的平均抑制直徑為8.Omm，而采用平板對峙法時，其平均抑制直徑達11.Omm。實施例3溫室種植番茄植株種子處理組番茄種子先用2%的次氯酸鈉表面消毒2分鐘，用無菌水洗3次后在10mg/mL的殼聚糖溶液中浸泡2小時，過夜風(fēng)干，置于用無菌水打濕的無菌濾紙上，室溫培養(yǎng)5天使其預(yù)萌發(fā)，最后播種在20cm直徑X20cm高的裝有未滅菌蔬菜土的盆子中，隨機放在12小時光照/12小時黑暗、80%相對濕度、28"的溫室中。對照組用體積百分比為1%的乙酸溶液浸泡番茄種子。每個處理4個重復(fù)，每盆5棵植物。土壤澆灌組番茄種子先用2%的次氯酸鈉表面消毒2分鐘，用無菌水洗3次后過夜風(fēng)干，然后置于用無菌水打濕的無菌濾紙上，室溫培養(yǎng)5天使其預(yù)萌發(fā)，最后播種在20cm直徑X20cm高的裝有未滅菌蔬菜土的盆子中，隨機放在12小時光照/12小時黑暗、80%相對濕度、28t:的溫室中。播種3天前，每個盆子中澆灌50mL的10mg/mL的殼聚糖溶液。對照組用50mL體積百分比為1%的乙酸溶液澆灌每個盆子。每個處理4個重復(fù)，每盆5棵植物。青枯菌Rs-f.91在CPG培養(yǎng)液(蛋白胨10.0g;水解酪蛋白1.Og;葡萄糖5.Og;水1000mL;pH7.0-7.2)中于3(TC下過夜培養(yǎng)，制得菌懸液。在播種預(yù)萌發(fā)的番茄種子2周后，種子處理組、土壤澆灌組以及它們的對照組均取一半接種50mL青枯菌懸浮液(108CFU/mL)，另一半盆子接種50mL無菌水，接種后每株植株用塑料袋套袋24小時，以保持一個相對高的濕度。實施例4番茄葉子中幾丁質(zhì)酶活性分析在實施例3的基礎(chǔ)上，接種7天后，從種子處理組、土壤澆灌組以及它們的對照組的番茄植株中采集長度為35cm的葉子。采集后，從每組處理中取lg新鮮的樣本，分別用液氮在研缽里搗碎，然后加5mL0.lmol/L的乙酸緩沖液(pH5.0)，在10000r/min、4t:條件下離心IO分鐘，分離上清液。取0.4mL上清液(即酶液)，加入40iiL1%蝸牛酶，37"水浴反應(yīng)30分鐘后，加入0.2mL飽和硼砂，放在沸水浴中加熱7分鐘，冷卻后加入2mL冰醋酸和lmL1%對二甲氨基苯甲醛(DMAB)，37。C保溫15分鐘，585nm下測定其吸光值(PerkinElmer(珀金-i矣爾默)公司生產(chǎn)的lambda35UV/Visspectrometer)，測得每組處理的葉子中幾丁質(zhì)酶的活性。一個幾丁質(zhì)酶活性單位定義為每克番茄葉子在上述條件下每分鐘產(chǎn)生lmmolN-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量。如圖1和圖2所示，無論是否有青枯病菌的存在，殼聚糖都能提高番茄植株體內(nèi)的幾丁質(zhì)酶活性。如圖l所示，在沒有青枯病菌存在的條件下，殼聚糖作為土壤澆灌液或種子浸泡劑，能夠分別增加幾丁質(zhì)酶13.14%和11.15%的活性，如圖2所示，青枯病菌存在的條件下，殼聚糖作為土壤澆灌液或種子浸泡劑，增加幾丁質(zhì)酶的活性分別超過95.99%和61.97%。實施例5番茄葉子中P-l，3-葡聚糖酶活性分析在實施例3的基礎(chǔ)上，接種7天后，從種子處理組、土壤澆灌組以及它們的對照組的番茄植株中采集長度為35cm的葉子。采集后，從每組處理中取lg新鮮的樣本，分別用液氮在研缽里搗碎，然后加入5mL0.05mol/L的醋酸鈉緩沖液(pH5.0)，在10000r/min、fC條件下離心10分鐘，分離上清液。取62.5iiL的上清液，加入62.5iiL濃度為4%的海帶多糖溶液，4(TC水浴10分鐘后加入375uL二硝基試劑，再沸水浴中加熱5分鐘。反應(yīng)結(jié)束后用4.5mL的蒸餾水稀釋反應(yīng)液，500nm處測定其吸光值(PerkinElmer(珀金-埃爾默)公司生產(chǎn)的lambda35UV/Visspectrometer)，得到每組處理的番茄葉子中P_1，3_葡聚糖酶的活性。一個酶活性單位定義為每克番茄葉子在上述條件下每分鐘產(chǎn)生lmmol葡萄糖所需的酶量。如圖3所示，在沒有青枯病菌存在的條件下，殼聚糖作為土壤澆灌液或種子浸泡劑，能夠分別增加P-1，3-葡聚糖酶6.66%和2.35%的活性，如圖4所示，在青枯病菌存在的條件下，殼聚糖作為土壤澆灌液或種子浸泡劑，增加13-1，3-葡聚糖酶的活性分別超過68.05%和47.30%。實施例4和實施例5的結(jié)果表明，無論是否存在青枯菌，殼聚糖都能誘導(dǎo)植物體內(nèi)幾丁質(zhì)酶和P-l，3-葡聚糖酶活性的上升。在植物抗病防御系統(tǒng)中，幾丁質(zhì)酶和P-l，3-葡聚糖酶起到非常重要的作用，這兩種酶活性的提高，能增強植物的抗病性。實施例6番茄植株病害評價觀察記錄實施例3中種子處理組、土壤澆灌組以及它們的對照組接種了青枯菌后的番茄植株的病害嚴(yán)重程度，病害嚴(yán)重度根據(jù)番茄植株接種病原菌8周后葉片枯萎嚴(yán)重程度進行記錄，分為如下5級標(biāo)準(zhǔn)O級無癥狀，植株健康；1級1%_15%的葉片萎蔫；2級16%_30%的葉片萎蔫；3級31%_60%的葉片萎蔫；4級61%以上的葉片萎蔫，但植株還沒死亡或全株枯萎；5級植株萎蔫或死亡。同時枯萎發(fā)生率和病害控制效率按下列公式計算病害發(fā)生率(％)={(病級X相應(yīng)級別感染植物的數(shù)量)/(最高級別X總的植物數(shù)量)}XIOO，最高級別表示該處理組病害嚴(yán)重度的最高級別。生防效能(％)={(對照處理的病害發(fā)生率-殼聚糖處理的病害發(fā)生率)/對照處理的病害發(fā)生率}X100結(jié)果顯示，無論是土壤澆灌還是種子浸泡，與對照相比，殼聚糖都能顯著降低番茄的病害發(fā)生率(表1)，其生防效能分別達到71.99%和48.01%。而不接種青枯病菌的番茄都未顯示癥狀。表1不同處理下，番茄植株的病害評價處理病害發(fā)生率(％)生防效能(％)土壤澆灌殼聚糖17.55±5.72a71.99c對照62.66±4.98c0.00a種子處理殼聚糖33.33±7.70b48.01b對照64.11±4.11c0.00a注表中殼聚糖的濃度為10mg/mL，下同。實施例7番茄植株生長促生在播種2個月后，收獲所有番茄植株(接種病菌和不接種病菌)，測量所有植株的株高。將植株洗凈，吸干，測定其鮮重。將稱完鮮重的番茄植株裝入信封，放置于烘箱內(nèi)，6(TC烘干3天后，測定其干重。殼聚糖的相對生長促生率(GPE)按下列公式計算GPE(%)={(殼聚糖處理的植物參數(shù)_對照處理的植物參數(shù))/對照處理的植物參數(shù)}X100結(jié)果顯示，在沒有青枯病菌存在的條件下，殼聚糖溶液無論是作為土壤澆灌液還是作為種子浸泡劑，都能促進番茄植株生物量的增長。與對照相比，殼聚糖溶液的兩種施用方式顯著增加株高分別超過55.72%和37.51%，增加植物鮮重分別超過100.92%和91.15%，增加植物干重分別超過85.67%和66.27%(表2)。同樣，在青枯病菌存在的條件下，殼聚糖溶液無論是作為土壤澆灌液還是作為種子浸泡劑，都能促進番茄植株生物量的增長。與對照相比，殼聚糖溶液的兩種施用方式能顯著增加植物的株高分別超過67.87%和39.45%，增加植物的鮮重分別超過97.73%和81.88%，增加植物的干重分別超過76.17%和54.95%(表3)。表2殼聚糖對未接種青枯病菌的番茄植株生物量的影響處理長度(cm)GPE(%)鮮重(g)GPE(%)干重(g)GPE(%)土壤澆灌殼聚糖36.33±0.69d55.72c28.47±0.32b100.92c5.70±0.20cd85.67c對照23.33±1.20b0.00a14.17±0.50a0.00a3.07±0.09a0.00a種子處理殼聚糖29.33±U5c37.51b27.20±0.67b91.15b5.57±0.41c66.27b對照21.33±0.33a0.00a14.23±0.67a0.00a3.35±0.20b0.00a注表中GPE為相對生長促生率，下同。表3殼聚糖對接種青枯病菌的番茄植株生物量的影響7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求殼聚糖在防治植物青枯病中的應(yīng)用。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的植物為番茄、茄子、煙草、花生、馬鈴薯或香蕉。3.殼聚糖在提高番茄抗青枯病性能中的應(yīng)用。4.殼聚糖在促進番茄生長中的應(yīng)用。5.根據(jù)權(quán)利要求14任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述的殼聚糖脫乙酰度大于75%。6.根據(jù)權(quán)利要求14任一所述的應(yīng)用，其特征在于將植物種子浸泡在殼聚糖溶液中或用殼聚糖溶液對種植土壤進行澆灌，所述的殼聚糖溶液的濃度為110mg/ml。全文摘要本發(fā)明公開了一種殼聚糖在防治番茄青枯病中的應(yīng)用。本發(fā)明制劑能顯著增加番茄植株的誘導(dǎo)抗性，降低番茄青枯病的發(fā)生率，同時也能促進番茄植株的生長。采用本發(fā)明制劑防治番茄青枯病簡單易行，成本較低。文檔編號A01P1/00GK101731220SQ20091015574公開日2010年6月16日申請日期2009年12月25日優(yōu)先權(quán)日2009年12月25日發(fā)明者周青,李斌,蘇婷,謝關(guān)林申請人:浙江大學(xué)