專利名稱：海洋源枯草芽孢桿菌殺蟲活性產(chǎn)物的培育方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)殺蟲活性產(chǎn)物的培育方法及其應(yīng)用，尤其是海洋源枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)殺蟲活性產(chǎn)物的培育方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
農(nóng)藥在人類抵抗病蟲害為害，保護農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)生產(chǎn)中起到重要的作用。自二十世紀(jì)中葉有機合成農(nóng)藥問世以來，由于其具有高效、速效、廣譜等特點，曾經(jīng)一度對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)起到巨大的促進作用。但由于高毒、高殘有機合成農(nóng)藥的大面積使用，短短的幾十年以來，所導(dǎo)致的負(fù)面影響也遠遠超出了人們的預(yù)料，如害蟲抗藥性，環(huán)境污染，有益生物的大量殺傷等等。對具有殺蟲活性的天然產(chǎn)物資源進行開發(fā)，研究其毒理和應(yīng)用一直是熱點。陸地生物源天然產(chǎn)物研究已經(jīng)取得了許多可喜的成果，一些結(jié)構(gòu)新穎的天然化合物如毒扁豆堿、除蟲菊素、煙堿、印楝素、苦皮藤、魚藤酮、阿維菌素、多殺菌素等，通過結(jié)構(gòu)改造修飾后開發(fā)出高效系列殺蟲劑、或直接提取加工成農(nóng)藥，已廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)當(dāng)中，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。但近年來，隨著研究的深入以及環(huán)境惡化，可用陸地生物資源正逐漸減少，研究花費的人力、物力和才力也越來越大，而從中發(fā)現(xiàn)有明顯殺蟲活性，或是作用機制獨特、結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物殺蟲劑速度確越來越慢。為此，人們將注意力漸漸轉(zhuǎn)向其他生態(tài)系統(tǒng)如沙漠、極地、溫泉和海洋等中的生物資源的研究。
海洋是生命之源，亦是地球上物質(zhì)資源最豐富的領(lǐng)域。據(jù)報道地球上的物種約有80％生活在水中，其中除了我們所熟悉的魚、蝦、貝類外，僅較低等的海洋生物物種就達近20萬種，海生植物也有約2萬多種。海洋生物不同于陸地生物，由于其生存環(huán)境的艱難苛刻(高鹽、高壓、缺氧等)，為求生存及竟?fàn)幧婵臻g，很多海洋生物在長期的進化過程中能夠代謝產(chǎn)生一些結(jié)構(gòu)獨特的化學(xué)物質(zhì)即次生物質(zhì)。研究人員已從海洋細(xì)菌、海洋放線菌、海洋真菌中分離出眾多的新化合物，有些結(jié)構(gòu)類型以前從未在陸生生物中發(fā)現(xiàn)過，在得到的化合物中新結(jié)構(gòu)物質(zhì)比例遠遠高于陸生生物。
海洋中存在豐富微生物資源，是人們尋找和發(fā)現(xiàn)具有重要生物活性新物質(zhì)的主要來源。本發(fā)明人經(jīng)過大量的資料查詢，發(fā)現(xiàn)已經(jīng)從海洋生物中開發(fā)出了幾十種具有重要藥理活性的物質(zhì)，其中有十余種已進入臨床應(yīng)用階段。但迄今為止，作為農(nóng)用的海洋生物源天然產(chǎn)物不多，如從海洋腔腸動物沙蠶中發(fā)現(xiàn)的沙蠶毒素，已開發(fā)出了系列重要的水稻殺蟲劑；從海洋貝殼類生物中發(fā)現(xiàn)的甲殼素，作為殺菌劑、植物生長調(diào)節(jié)劑已經(jīng)開始推廣使用。但海洋源微生物的農(nóng)用殺蟲活性物質(zhì)的開發(fā)到目前為止還沒有見報道。

發(fā)明內(nèi)容
旨在提供一種海洋源枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)殺蟲活性產(chǎn)物的培育方法及其應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的海洋源枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)殺蟲活性產(chǎn)物的培育方法，其特征在于以農(nóng)業(yè)中重要的害蟲棉鈴蟲為指示試蟲，采用常規(guī)浸蟲法和微型篩選法兩種不同的篩選方法，對采自中國海域的海洋微生物進行了生物活性篩選，獲得了一株高活性菌株；該細(xì)菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28℃，200r/min搖床震蕩培養(yǎng)72-96h，可獲得高產(chǎn)量殺蟲活性產(chǎn)物；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，碳源可以為可溶性淀粉或大豆粉，氮源可以為大豆粉或蛋白胨，發(fā)酵中使用的無機組分可以為碳酸鈣；發(fā)酵在需氧條件下進行，發(fā)酵溫度28～30℃，并調(diào)整到PH＝7.0～8.0。該菌株產(chǎn)生的殺蟲活性產(chǎn)物，在培養(yǎng)過程中分泌于細(xì)胞外，儲存于培養(yǎng)基中，該活性產(chǎn)物可溶解于水或緩沖液中，用常用的有機溶劑不能從發(fā)酵液中提取出來，該活性產(chǎn)物的分子量大于8KD。
一種海洋源枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)殺蟲活性產(chǎn)物的應(yīng)用，其特征在于殺蟲活性產(chǎn)物對農(nóng)業(yè)害蟲具有滅殺活性。
本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明的具殺蟲活性海洋微生物為首次報道。而且海洋源枯草芽孢桿菌殺蟲活性產(chǎn)物的培育過程中所涉的原料容易獲得，發(fā)酵條件簡單，對設(shè)備要求低；獲得的殺蟲活性產(chǎn)物具有高效、廣譜，經(jīng)大量室內(nèi)生物測定表明，它對棉鈴蟲、粘蟲、菜青蟲和蚜蟲均有非常好的防治效果；由于殺蟲活性產(chǎn)物源于微生物的次生代謝產(chǎn)物，對環(huán)境及非靶標(biāo)生物安全，不會造成環(huán)境污染。
附圖表說明

圖1是發(fā)酵時間與活性的關(guān)系曲線；圖2是活性菌株碳源實驗結(jié)果；圖3是活性菌株氮源實驗結(jié)果。
具體實施例方式為了更清楚的理解本發(fā)明以及本發(fā)明產(chǎn)品的作用，以下通過發(fā)明人給出的依本發(fā)明技術(shù)方案所完成的具體的實施例對本發(fā)明作進一步的詳細(xì)描述。
實施例1一株海洋源殺蟲微生物的篩選方法1、供測海洋微生物培養(yǎng)條件培養(yǎng)基組成在陳海水占75％，蒸餾水占25％的混合液中加入可溶性淀粉2.0％，黃豆粉1.5％，酵母膏0.5％，蛋白胨0.2％，碳酸鈣0.2％，葡萄糖0.5％，并調(diào)整到PH7.5～8.0；接種量相當(dāng)于培養(yǎng)基總量的1％的種子液，于28℃，200r/min搖床震蕩培養(yǎng)120h。發(fā)酵液離心，取上清液供測殺蟲活性。
2、常規(guī)浸蟲篩選法取室內(nèi)連續(xù)飼養(yǎng)多代的3齡棉鈴蟲幼蟲，于發(fā)酵液原液中浸30s，置于裝有飼料的指形管中(每管1頭)，空白對照分別浸清水、浸發(fā)酵培養(yǎng)基，每處理20頭3齡幼蟲。處理后置于溫度25±0.5℃、光周期L∶D＝14∶10、相對濕度75％～85％的培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。48h、72h、120h檢查幼蟲死亡率，如對照有死亡，用Abbort公式校正死亡率。
3、微型化板上篩選法取24孔板，每孔內(nèi)加0.5g混有發(fā)酵液的棉鈴蟲飼料，接1頭初孵棉鈴蟲幼蟲，每處理24頭幼蟲?？瞻讓φ辗謩e加清水、發(fā)酵培養(yǎng)基。處理后培養(yǎng)和檢查同常規(guī)浸蟲篩選法。
4、經(jīng)常規(guī)浸蟲法篩選和微型化板上從2360株海洋源微生物中篩選獲得一株海洋微生物，其發(fā)酵發(fā)酵液原液對棉鈴蟲初孵幼蟲的校正致死率為24h為45.5％；48h為67.3％；72h為73.5％。對3齡棉鈴蟲幼蟲的校正殺蟲致死率為24h為23.9％；48h為43.5％；72h為65.8％。發(fā)酵液經(jīng)冷凍干燥濃縮10倍后對棉鈴蟲的校正致死率可達90％以上。
5、經(jīng)中國科學(xué)院微生物研究所對所篩選出的殺蟲海洋微生物進行菌種鑒定其特征在于細(xì)胞桿狀，革蘭氏陽性，大小為0.7×3.0μm，產(chǎn)生中生的柱狀芽孢，孢囊不膨大。細(xì)胞內(nèi)不產(chǎn)生聚-β-羥基丁酸鹽(PBH)顆粒。產(chǎn)生乙酰甲基甲醇(VP反應(yīng)陽性)。接觸酶陽性，卵磷脂酶陰性，還原硝酸鹽。在7％NaCl和pH5.7中生長，在厭氧培養(yǎng)基中不生長，營嚴(yán)格好氧生活。水解可溶性淀粉和明膠。從葡萄糖產(chǎn)酸、木糖和甘露糖產(chǎn)酸，但阿拉伯糖不產(chǎn)酸。石蕊牛奶呈還原反應(yīng)。表1中列出了該菌的具體生理生化特性。
表1.Bacillus subtilis的菌落形態(tài)和生理特征

實施例2一株海洋源殺蟲微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法1、發(fā)酵時間的確定培養(yǎng)基中接種1％的種子液，分別發(fā)酵1d，2d，3d，4d，測發(fā)酵液的活性，確定發(fā)酵時間和活性的關(guān)系(見圖1)。
2、碳源實驗分別用玉米粉3.5％，可溶性淀粉3.5％，麥芽糖3.5％，蔗糖3.5％，葡萄糖3.5％，乳糖3.5％代替培養(yǎng)基中的可溶性淀粉和葡萄糖，發(fā)酵3d，棉鈴蟲測活(見圖2)。
3、氮源實驗分別用黃豆粉1.7％，蛋白胨1.7％，牛肉膏1.7％，酵母提取物(進口)1.7％，濃縮酵母粉(國產(chǎn))1.7％為氮源分別取代培養(yǎng)基中的黃豆粉酵母提取物，發(fā)酵3d，棉鈴蟲測活(見圖3)。
4、正交實驗經(jīng)發(fā)酵時間、碳源、氮源實驗后設(shè)計正交實驗見(表2，表3)經(jīng)正交實驗后確定該菌株的最佳發(fā)酵條件為按1％接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(在陳海水占75％，蒸餾水占25％的混合液中含有可溶性可溶性淀粉3.5％，蛋白胨2.5％，碳酸鈣0.2％，并調(diào)整到PH7.0-8.0)中，于28℃，200r/min搖床震蕩培養(yǎng)72h，即可獲得高產(chǎn)量活性產(chǎn)物。
表2活性菌株正交試驗因子水平表因子碳源(％)氮源(％) 碳酸鈣(％) pH水平1 3.5 20.1 7.5水平2 4 2.5 0.2 8水平3 4.5 30.3 8.5表3活性菌株正交實驗活性測定結(jié)果列號死亡率(％)1 2 3 41 1 1 3 1 44.852 2 1 1 3 52.793 3 1 2 1 44.85試4 1 2 2 3 87.28驗5 2 2 3 2 44.85處6 3 2 1 1 79.32理7 1 3 1 3 80.258 2 3 2 2 36.429 3 3 3 1 28.46
實施例3一株海洋源殺蟲微生物發(fā)酵產(chǎn)物殺蟲譜測定(具體結(jié)果見表3)1、浸蟲法將室內(nèi)連續(xù)飼養(yǎng)的棉鈴蟲、菜青蟲、小菜哦、粘蟲的3齡幼蟲放入JAAS01發(fā)酵液濃縮液中浸漬30s，然后分別接入裝有新鮮棉花、甘藍、小青菜、甘藍、玉米葉片的培養(yǎng)皿中(葉柄用含0.2％NaNO3，0.1％K2HPO4的營養(yǎng)液浸棉球保濕)，每皿接3齡幼蟲20頭，每處理重復(fù)3次，處理后置于溫度25±0.5℃、光周期L∶D＝14∶10、相對濕度75％～85％的培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。48h檢查幼蟲死亡率。
2、浸葉法 將有菜縊管蚜的甘藍葉片剪成小塊，放入JAAS01發(fā)酵液濃縮液中浸漬10s，用吸水紙吸去多余水分，除去死蚜及過大過小的蚜蟲，只留個體一致的中等活蚜，計數(shù)。放入培養(yǎng)皿中的新鮮甘藍葉片上。用含0.2％NaNO3，0.1％K2HPO4的營養(yǎng)液浸棉球，裹于葉柄基部，保持葉面新鮮?？瞻讓φ辗謩e浸清水、發(fā)酵培養(yǎng)基。重復(fù)3次，每重復(fù)30頭蚜蟲。處理后培養(yǎng)和檢查同浸蟲法。
表4 活性菌株發(fā)酵液殺蟲譜測定結(jié)果試蟲 死亡率(％)experimental insectmortality棉鈴蟲Heliothis armigera Hubner88.12粘蟲Leucania separata Walker 94.36菜青蟲Pierisrapae Linnaeus 89.57小菜蛾P(guān)lutella xylostella(Linnaeus)16.67菜縊管蚜Rhopalosiphum pseudobrassicae 40.63實施例4一株海洋源殺蟲微生物發(fā)酵產(chǎn)物的分子量范圍確定透析膜50％乙醇慢慢煮沸一小時，再分別用50％乙醇、0.01mol/L碳酸氫鈉溶液、0.01mol/L的EDTA溶液依次洗滌，最后用蒸餾水浸洗三次。將毒素原液的10濃縮液小心地裝入透析膜，但不能裝滿以防膜外溶劑大量透入膜內(nèi)時將膜脹裂，或因透析膜脹，而引起膜地孔徑大小改變。裝好后，既匝緊膜口，將透析膜置于裝有蒸餾水地大磁盤中進行透析，8h換一次透析外液，共換6次。將透析得到地膜外溶液和膜內(nèi)溶液分別冷凍干燥濃縮至透析原體積，用蒸餾水恢復(fù)至毒素原液地濃度進行生測。用發(fā)酵培養(yǎng)基同樣做以上處理為對照。
36、45、75三種透析膜攔截的分子量范圍分別為8000～10000Da、8000～12000Da、10000～14000Da。由表5試驗結(jié)果可知，36、45透析膜膜外都沒有活性，75透析膜膜內(nèi)外都有活性，且膜外的活性較低，由此可知JAAS01D菌株產(chǎn)生的毒素為一類分子量大于8KD的物質(zhì)。
表5.透析膜內(nèi)外液的毒性The effect of dialvsis to the toxin distribution36 45 75透析膜型號膜內(nèi)液膜外液膜內(nèi)液膜內(nèi)液膜內(nèi)液膜外液死亡率(％) 75.6 0 78.9 0 56.32 15.權(quán)利要求
1.海洋源枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)殺蟲活性產(chǎn)物的培育方法，其特征在于a)以農(nóng)業(yè)中重要的害蟲棉鈴蟲為指示試蟲，采用常規(guī)浸蟲法和微型篩選法兩種不同的篩選方法，對采自中國海域的海洋微生物進行了生物活性篩選，獲得了一株高活性菌株；b)該細(xì)菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28℃，200r/min搖床震蕩培養(yǎng)72-96h，可獲得高產(chǎn)量殺蟲活性產(chǎn)物；c)所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，碳源可以為可溶性淀粉或大豆粉，氮源可以為大豆粉或蛋白胨，發(fā)酵中使用的無機組分可以為碳酸鈣；d)發(fā)酵在需氧條件下進行，發(fā)酵溫度28～30℃，并調(diào)整到PH＝7.0～8.0。e)該菌株產(chǎn)生的殺蟲活性產(chǎn)物，在培養(yǎng)過程中分泌于細(xì)胞外，儲存于培養(yǎng)基中，該活性產(chǎn)物可溶解于水或緩沖液中，用常用的有機溶劑不能從發(fā)酵液中提取出來，該活性產(chǎn)物的分子量大于8KD。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海洋源枯草芽孢桿菌殺蟲活性產(chǎn)物的培育方法，其特征在于其最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為在陳海水占75％，蒸餾水占25％的混合液中含有可溶性淀粉3.5％，蛋白胨2.5％，碳酸鈣0.2％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海洋源枯草芽孢桿菌殺蟲活性產(chǎn)物的培育方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基中的接種量為培養(yǎng)基總量的1～5％的種子液(107～108細(xì)胞/ml)。
4.一種權(quán)項1所述海洋源枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)殺蟲活性產(chǎn)物的應(yīng)用，其特征在于殺蟲活性產(chǎn)物對多種農(nóng)業(yè)害蟲具有滅殺活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)殺蟲活性產(chǎn)物的應(yīng)用，其特征在于所述的農(nóng)業(yè)害蟲包括棉鈴蟲、菜青蟲、小菜蛾、粘蟲、菜縊管蚜及其同屬害蟲。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株海洋源枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)殺蟲活性產(chǎn)物的培育方法及其應(yīng)用。它以棉鈴蟲為指示試蟲，采用浸蟲法和篩選法對采自中國海域的海洋微生物進行了生物活性篩選，獲得了一株高活性菌株；并接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得活性產(chǎn)物；該活性產(chǎn)物可溶解于水或緩沖液中，分子量大于8KD。該活性產(chǎn)物對多種農(nóng)業(yè)害蟲具有滅殺活性。本發(fā)明的優(yōu)點在于海洋源枯草芽孢桿菌殺蟲活性產(chǎn)物的培育過程中所涉的原料容易獲得，發(fā)酵條件簡單，對設(shè)備要求低；獲得的殺蟲活性產(chǎn)物具有高效、廣譜；活性產(chǎn)物源于微生物的次生代謝產(chǎn)物，對環(huán)境及非靶標(biāo)生物安全，不會造成環(huán)境污染。
文檔編號C12N1/20GK1556195SQ200310112809
公開日2004年12月22日 申請日期2003年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月30日
發(fā)明者劉賢金, 余向陽, 劉濟寧, 王冬蘭, 張存政 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院