專利名稱：免疫原性組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及免疫原性組合物，其包括融合蛋白和皂苷佐劑。也涉及疫苗、制備疫苗的方法、以及免疫原性組合物的用途。
在現(xiàn)代人類和獸醫(yī)學中，人類和動物將會被定期接種疫苗以或多或少地預防令人虛弱的疾病或傳染病，或者確保一定的經(jīng)濟收益性。在2000年僅用作獸醫(yī)疫苗接種的生物制品的市場價值就為25億美元(Wood-Mackenzie，2001)。任何疫苗接種策略的目的在于在受試者中實現(xiàn)免疫系統(tǒng)激活的狀態(tài)，這將保護其免于感染或疾病(的癥狀)。為產(chǎn)生免疫保護，將感染性因子(的一部分)以能夠使免疫系統(tǒng)產(chǎn)生保護性應答的方式呈遞給受試者。通過免疫記憶現(xiàn)象，當將來發(fā)生此疫苗接種所瞄準的真正感染時，受試者的免疫系統(tǒng)被觸發(fā)，以更加容易且強烈地作出反應。
為此目的，疫苗通常是由靶向的感染性因子或其部分制備的，例如通過使用活性、活性減毒或殺死形式的傳染微生物，或者其蛋白質(zhì)亞單位或核酸。理想地，所有這些都將包括(或編碼)可在人類或動物靶標中誘發(fā)期望的保護性免疫應答的抗原性結構。
出于安全性的原因，優(yōu)選亞單位疫苗。亞單位則可介由(重組)核酸分子的表達通過表達系統(tǒng)的細胞產(chǎn)生。
只有當抗原能夠誘發(fā)降低感染或疾病跡象的免疫應答時，它才被稱之為保護性抗原或免疫原。
因此在亞單位疫苗領域，表達的蛋白可能是抗原性的，但多數(shù)時候發(fā)現(xiàn)不是免疫原性的。更別提具有足夠的免疫原性，以產(chǎn)生在實地條件下有效而且經(jīng)濟上可行的疫苗了。
然而，亞單位免疫原性的優(yōu)化可能負面地干擾獲得足夠的表達產(chǎn)率。這可能是由于過表達可能會導致用于蛋白表達的細胞機器超負荷并崩潰、或者用于表達異源蛋白的表達系統(tǒng)多數(shù)時候并不表現(xiàn)出與蛋白天然地表達的細胞中所發(fā)生的相同的翻譯后修飾的事實而引起的。例如，提供分泌或表面暴露的疏水信號序列的加工通過與細胞的細胞器或外膜相互作用，可能會在表達系統(tǒng)的細胞中產(chǎn)生問題。因此常見的作法是在細胞表達系統(tǒng)中生產(chǎn)沒有C-端疏水錨定信號的蛋白亞單位，并缺失或修飾N-端信號序列。然而該途徑的不利之處在于這通常導致低免疫原性。
為克服以這種方式產(chǎn)生的蛋白的低免疫原性的問題，通常采用的是向亞單位抗原添加佐劑(免疫刺激物質(zhì))。此類物質(zhì)相對便宜，且能夠非常有效。通常利用的佐劑有鋁鹽、油乳劑、脂質(zhì)A和皂苷。然而這些物質(zhì)大多數(shù)在施用部位以組織刺激的形式導致某種局部反應。這造成受試者的不適，并且在獸醫(yī)應用的情況下，可能導致生產(chǎn)力(如奶或蛋產(chǎn)量、飼料轉化)下降或屠宰場肉或畜體的禁止食用。
這些佐劑之中，發(fā)現(xiàn)有效濃度下具細胞毒性的一個是奎拉雅屬(Quillaja)皂苷。當然，施用皂苷的局部反應類型和強度取決于使用的量，并且也取決于該材料的純度或者所使用的特定批次。B.Rnnberg等(1995，Vaccine，vol.13，p.1375-1382)描述了奎拉雅屬皂苷衍生物不同級分的溶血細胞毒性。對不同級分而言，毒性濃度在5和100μg/ml之間變化。局部反應據(jù)觀察從腫脹到皮膚退化變化不一，并且甚至有實驗所用小鼠的死亡。在類似的研究中，Pillion等(1996，J.Pharm.Sci.，vol.85，p.518-524)描述了奎拉雅屬皂苷衍生物在0.006和1.5mM之間的濃度造成紅細胞溶血。Leung等(1997，BBA vol.1325，p.318-328)描述細胞溶解的原因在于游離皂苷與細胞膜中的膽固醇反應。
防止皂苷的毒性壓倒其佐劑活性的常見方式是摻入到免疫刺激復合物(ISCOM)(WO 9611711)中。這些復合物是通過混合皂苷、磷脂和膽固醇形成的。在正確條件下形成具籠狀結構的顆粒。當整合了抗原性蛋白時，可產(chǎn)生微粒結構，該結構將這些抗原呈遞到表面，由此模擬抗原在感染細胞上的“天然”呈遞(綜述于Morein，B.和K.L.Bengtson，1999，Methods，vol.19，p.94-102和EP109.942之中)。
或者可以生產(chǎn)ISCOM-基質(zhì)顆粒。這些是ISCOM-樣顆粒，其中亞單位抗原并不整合，而是后來添加的。
在這兩種情況下，奎拉雅屬皂苷的細胞毒性效應都得以中和。通過在ISCOM中整合攜帶表位的融合肽，Hsu等(1996，Vaccine，vol.14，p.1159-1166)選擇了這樣的途徑。
不幸的是，ISCOM及ISCOM-基質(zhì)的產(chǎn)生復雜且昂貴，因此使得其對于例如獸醫(yī)學上的一般應用來說不經(jīng)濟。使用游離形式的皂苷(即不整合到ISCOM中)不太復雜，且便宜。然而，在作為佐劑正常有效的濃度下，可能出現(xiàn)皂苷細胞毒性的不利之處，如上文所提到的那樣。
本發(fā)明的目的在于首次提供佐以皂苷的蛋白質(zhì)抗原的免疫原性組合物，其按成本有效生產(chǎn)水平計，確實提供有效的免疫刺激，而沒有顯著的不利局部效應。
現(xiàn)在令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過將疏水肽與免疫原性蛋白質(zhì)的核心融合，該融合蛋白能夠與如此低濃度的游離皂苷組合，從而所得組合物不會導致不利的局部效應，而仍然誘導有效的免疫應答。
這與在ISCOM和ISCOM-基質(zhì)顆粒中摻入皂苷以克服細胞毒性的普通習慣相反。同樣這也與由在異源表達系統(tǒng)中表達的亞單位蛋白習慣性去除疏水氨基酸(aa)區(qū)段相抵觸。表達系統(tǒng)中融合蛋白產(chǎn)量可能的損失通過就游離皂苷而言提高的免疫原性以及下降的不利局部反應而得到了彌補。
因此，本發(fā)明首次提供了佐以皂苷的亞單位疫苗，其足夠安全、在免疫學上有效且具有經(jīng)濟可行性。
因此，在第一方面，本發(fā)明提供了免疫原性組合物，包括融合蛋白和皂苷佐劑，其特征在于所述融合蛋白包括融合于核心多肽N-端和/或C-端的異源疏水肽，所述核心多肽包括至少一個保護性表位，所述皂苷佐劑以游離形式存在。
免疫原性組合物應理解為經(jīng)給受試者給藥后，誘導該受試者的免疫應答，使感染或疾病下降的組合物。這意味著刺激免疫系統(tǒng)成分。這些可以是細胞成分例如B或T淋巴細胞、巨噬細胞、殺傷細胞、抗原提呈細胞(APC)等，或者免疫系統(tǒng)的體液成分，例如抗體、細胞因子(如干擾素或白介素)等。
為了本發(fā)明的目的，術語“蛋白”是指氨基酸分子鏈。蛋白并不限于特定長度，且如需要，可在體內(nèi)或在體外通過例如糖基化、酰胺化、羧化或磷酸化修飾。其中，肽、寡肽和多肽包含在該定義之內(nèi)。蛋白或肽可以是天然或合成來源的。
融合蛋白是兩條或更多條氨基酸鏈的天然不存在的集合。所述氨基酸鏈可以等長，但通常它們長度不同，其中異源疏水肽優(yōu)選短于核心多肽。氨基酸鏈的結合可通過多種手段實現(xiàn)，如-化學上，通過脫水、酯化等直接或間接通過中間體結構對氨基酸序列進行偶聯(lián)、綴合或交聯(lián)。
-物理上，通過在高分子結構之中或之上的俘獲進行偶聯(lián)。
-通過聯(lián)合包含了編碼兩蛋白中每一個的核酸片斷的重組核酸分子進行分子生物學融合，從而單個連續(xù)的表達產(chǎn)物得以最終產(chǎn)生。
皂苷為表面活性的糖苷，可通過提取自植物中獲得。眾所周知的皂苷是，其由南美皂樹奎拉雅屬皂樹(Quillaja saponaria[Molina])的樹皮提取而得的Quillaja皂苷(Dalsgaard，K.，1974，Arch.Gesamte Virusforsch.vol.44，p.243-254)。取決于提取方法，將獲得不同的皂苷制劑。多種奎拉雅屬皂苷是商業(yè)上可獲得的Iscotec AB，Sweden的SpikosideTM、Superfos AS，Denmark的QuilATM、Nor-Vet，Denmark的Q-vacTM以及Antigenics，USA的QS-21TM和Desert King，Chili的Vax-SapTM。有些是粗制品，而其它的是更為純化的制劑。
為了本發(fā)明的目的，如果皂苷還沒有被有目的地與膽固醇和磷脂混合以產(chǎn)生ISCOM或ISCOM-基質(zhì)顆粒，它是游離形式的。
一般而言佐劑是以非特異性方式加強接受受試者的免疫應答的物質(zhì)。
待與疏水肽相連的核心多肽系不含存在于該蛋白天然形式之中的N-端或C-端疏水區(qū)的多肽。因而本發(fā)明的核心蛋白是來自因子或生物體的蛋白組分。不含疏水末端的蛋白無需對其天然組成進行進一步修飾，以天然形式就可作為“核心”。
這些疏水區(qū)可利用化學或酶學操作自蛋白切除。優(yōu)選地，編碼此種蛋白的核酸序列通過遺傳工程技術以這種方式修飾，從而使這些疏水區(qū)不再表達。
原則上任何具有醫(yī)學重要性的蛋白都可作為本發(fā)明的核心多肽。優(yōu)選核心多肽為已知或預期可對人類或動物造成疾病的感染性因子或生物學因子的組分。例如導致癌癥、HIV或AIDS、(自身)免疫病、神經(jīng)學、神經(jīng)退行性變、呼吸道或皮膚疾病的感染性因子或因子。
更優(yōu)選核心多肽為在疫苗接種研究中(例如在由感染性因子分離之后，通過用作活重組運載微生物(LRCM)中的插入物，在表達系統(tǒng)中表達后，或者在用作為DNA疫苗之后)已表現(xiàn)出免疫原性潛能的蛋白組分。
能夠用作本發(fā)明的核心多肽的此類蛋白的實例有來自包膜、基質(zhì)蛋白、細胞器或細胞核的蛋白，或者來自寄生蟲、細菌或病毒的非結構性蛋白或糖蛋白，以及它們在宿主中誘導或與之相互作用的蛋白。
甚至更為優(yōu)選地，核心多肽是下列蛋白的組分·寄生蟲蛋白例如來自艾美球蟲屬的寄生蟲酶(可溶的或內(nèi)部的)、或者可溶保護性抗原例如來自巴貝蟲屬(Babesia)的外抗原或裂殖子(merozoite)表面抗原。
·病毒蛋白如來自逆轉錄病毒的蛋白包膜蛋白gp20、gp40、gp120、rev、tat或nef蛋白、逆轉錄病毒組特異性抗原；新城疫病毒融合或血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白；流感病毒血凝素或神經(jīng)氨酸酶蛋白；雙RNA病毒VP2；冠狀病毒刺突或基質(zhì)蛋白；瘟病毒包膜蛋白Ems、E1或E2；豬生殖和呼吸道疾病病毒的病毒蛋白。
·細菌蛋白例如毒素、粘附素、纖維蛋白、纖毛蛋白、基柱蛋白或外膜蛋白。
·誘導的蛋白例如白介素；干擾素；癌抗原例如來自p53級聯(lián)、HER-2/Neu、癌胚抗原；腫瘤誘導的血管發(fā)生因子象纖連蛋白或神經(jīng)節(jié)苷脂；受體分子。
用于本發(fā)明之目的的術語異源是指疏水肽相對于其待連接的核心多肽而言的來源。因而如果肽不是特定物種的生物體或因子中核心多肽作為其組分的同一蛋白的一部分，它是異源來源的。例如，如果來自牛巴貝蟲(Babesia bovis)的Bd37蛋白的C-端疏水肽待與來自分歧巴貝蟲(B.divergens)的Bd37蛋白同系物的核心多肽融合，則其符合作為異源肽的要求。
一般而言，疏水肽應理解為對非極性環(huán)境具有偏好的氨基酸鏈。此類肽在本領域也被稱作親脂性或水不溶性的。以建立了多種能夠評估肽的疏水性的計算機算法。為了本發(fā)明的目的，采用的是Kyte &Doolittle的親水性算法(J.Kyte和R.F.Doolittle，1982，J.Mol.Biol.，vol.157，p.105-132)。這種廣泛采用的程序計算某一窗口氨基酸自由轉移能的移動平均值(moving average)，由此產(chǎn)生可表現(xiàn)為數(shù)據(jù)點表格或表現(xiàn)為圖表的疏水性分布圖。表格中移動平均值數(shù)字為正指示疏水氨基酸；圖表描述的疏水性分布圖中，低于中線的部分是疏水性的。
該算法在多數(shù)用于蛋白分析或結構預測的軟件包中、以及通過互聯(lián)網(wǎng)借助于多數(shù)生物信息學研究所的網(wǎng)頁可獲得。
對于本發(fā)明，如果60％或更多個來自Kyte-Doolittle疏水性分析的數(shù)據(jù)點顯示疏水值，則肽被認為是疏水性的；所述疏水性必需利用5個氨基酸的窗口計算。疏水性百分比由來自這種分析的數(shù)據(jù)表計算疏水數(shù)據(jù)點(移動平均值數(shù)字為正)的數(shù)目除以肽的氨基酸總數(shù)。優(yōu)選70％來自Kyte-Doolittle疏水性分析的數(shù)據(jù)點是疏水性的，更優(yōu)選80％、85％、90％、95％、98％或100％，優(yōu)選等級漸增。
為舉例說明Kyte-Doolittle疏水性分布圖，表1描述了可用于產(chǎn)生本發(fā)明的融合蛋白的來自多種來源的疏水肽，而與之相伴的疏水性分布圖示于

圖1。該圖也列出了疏水性百分比。
用于本發(fā)明的疏水肽優(yōu)選包含3到200個氨基酸之間的序列，更優(yōu)選4到150個，甚至更優(yōu)選4到100個，還甚至更優(yōu)選5到75個，并且更優(yōu)選6到50個氨基酸。
可用于產(chǎn)生本發(fā)明的融合蛋白的疏水肽可來自其來源的供體蛋白的不同區(qū)域。例如·N-端N-端疏水肽例如信號序列可來自各種各樣的蛋白質(zhì)如蜂毒肽(蜂蜜毒)、人組織纖溶酶原激活劑(TPA)、酵母交配信息素α-因子、桿狀病毒包膜糖蛋白gp67或假狂犬病病毒gX。這些信號序列由Izard和Kendall(1994，Mol.Microbiol.，vol.13，p.765-773)、Claros等(1997，Curr.Opin.Struct.Biol.，vol.7，p.394-398)以及Lammertyn和Anne(1998，F(xiàn)EMS Microbiol.Lett.，vol.1，p.1-10)綜述。
·內(nèi)部內(nèi)部疏水肽序列有例如跨膜區(qū)(TMR)，這些肽可位于蛋白的N-端或C-端附近，而且也還在內(nèi)部，例如在具有跨膜片斷的蛋白的情況下。實例有來自麻疹病毒血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白的膜錨點；跨膜信號受體象“七跨膜結構域”受體；膜通道；細胞孔隙及泵等。此類信號由Goder和Spiess(2001，F(xiàn)EBS Lett.，vol.31，p.87-93)、von Heijne和Manoil(1990，Protein Eng.，vol.4，p.109-112)以及普通教科書象Alberts等的《細胞分子生物學》(2002，Garland Sciencepubl.，ISBN0815340729)綜述。
·C-端C-端疏水肽有例如糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定信號，例如來自人類CD14(單核細胞分化抗原(NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫登錄號P08571)，雞TGF-β神經(jīng)營養(yǎng)因子受體1(NCBI登錄號013156)，以及釀酒酵母胞壁蛋白1(見表1和圖1)的C-端。此類GPI錨點的特征由P.Englund(1993，Ann.Rev.Biochem.，vol.62，p.121-138)以及Chatterjee和Mayor(2001，Cell.Mol.Life Sci.，vol.58，p.1969-1987)綜述。
NBNCBI蛋白和核酸序列數(shù)據(jù)庫可通過互聯(lián)網(wǎng)http//www.ncbi.nlm.nih.gov進入，而且其用于獲得核酸或蛋白序列目的的用途是本領域眾所周知的。
表1可用于本發(fā)明的疏水肽的實例
DAF＝衰變加速因子(CD 55)；CWP 1＝酵母菌胞壁蛋白1；MV HN＝麻疹病毒血凝素-神經(jīng)氨酸酶；HHV-4 EBNA-3C＝人類皰疹病毒4，核抗原EBNA-3C。
用來計算示于圖1的疏水性分布圖的計算機包(Clone Manager，SeiEd software，Durham，USA)將超過零的數(shù)值歸結于疏水氨基酸段，而親水段得分為負值。移動平均值以5個氨基酸的窗口計算。
不用說當使用不同的計算機包計算此分布圖時，可能稍有差異。不過，疏水和親水氨基酸區(qū)之間的區(qū)別將依然清晰。
文獻中，通常表達融合蛋白以便于下游加工期間的純化。然而，用于彼目的的融合肽不符合作為本發(fā)明的疏水肽的要求。
表位應理解為T細胞受體會對其作出應答、或者B細胞將對其產(chǎn)生抗體的抗原性分子的一部分。因此用于本發(fā)明的保護性表位將誘導特異性T細胞、或激活B細胞產(chǎn)生特異性抗體，從而這些細胞或抗體引起免疫反應，干涉侵染或疾病的病程。因而，通過此類保護性表位，可產(chǎn)生保護性免疫應答。
保護性表位包含在用于本發(fā)明的融合蛋白的核心多肽部分中。
與核心多肽相連的異源疏水肽也可以包含表位。融合蛋白中不止一個表位的存在甚至可以增強本發(fā)明的融合蛋白的免疫功效。
當前，存在多種技術可用來容易地識別蛋白表位。一種尤其適于檢測B細胞表位的經(jīng)驗性方法是所謂的PEPSCAN法。這由Geysen等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.81，p.3998-4002(1984)、J.Imm.Meth.vol.102，p.259-274(1987)和專利申請WO84/03564及WO 86/06487以及美國專利號no.4,833,092中描述。所述PEPSCAN法是容易實施、快速且為大家所公認的用于表位檢測的方法。它包括合成與待研究的蛋白漸進地重疊的系列肽片斷，并隨后用該蛋白的特異性抗體測試這些多肽。
同樣，給定任何蛋白(其編碼基因)的氨基酸(或核酸)序列，都存在能夠基于其與目前已知表位的序列和/或結構一致性，標明作為免疫學上重要的表位的特定蛋白區(qū)的計算機算法。這些區(qū)域的確定是建立在根據(jù)Hopp和Woods(Hopp T.P and Woods，K.R.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，vol.78，p.3824-3828)的親水性標準與根據(jù)Chou和Fasman(Adv.In Enzymology，vol.47，p.45-148(1987)以及美國專利4,554,101)的二級結構方面的組合的基礎上的。采用此類算法組合的程序?qū)嵗荘epPlot(Gribskov等，1986，Nucl.Acids Res.vol.14，p.327-334)。
由于T細胞表位正常地隱藏在蛋白的疏水區(qū)，其折疊遠離極性親水的外部(這里通常是B細胞表位的位置)，待與核心多肽融合的異源肽的疏水特點尤其適用于摻入T細胞表位。
如由Berzofsky等(1987，Immunol，Rev.，vol.98，p.9-52)所綜述的那樣，T細胞表位由短的氨基酸線性區(qū)段組成，并且只能在MHC-I的環(huán)境下，在其被APC加工后呈遞給免疫系統(tǒng)。
許多實例中的一個是來自人皰疹病毒4的EBNA-3C核抗原(NCBI登錄號S27922)，也描述在表1和圖1中。
T細胞表位可象B細胞表位一樣，通過計算機借助于Berzofsky的兩親性標準(1987，Science，vol.235，p.1059-1062)自序列中預測。這由Lu等(1992，Vaccine vol.10，p.3-7)綜述。采用這些方法的功效的舉例說明由H.Margalit等(1987，J.of Immunol.，vol.138，p.2213-2229)公開，其描述運用此類方法預測T細胞表位的成功率為75％。
所述異源疏水肽和/或核心多肽也可以含有其它免疫激活特征。此類特征可包括象來自趨化因子或免疫毒素的免疫刺激信號。
產(chǎn)生本發(fā)明的融合蛋白的優(yōu)選方式是使用遺傳工程技術和重組表達系統(tǒng)。這些可包括使用(重組)核酸序列、LRCM及宿主細胞。
可用于編碼本發(fā)明的融合蛋白的核酸序列可通過熟練技術人員眾所周知的標準分子生物學技術獲取、操作和表達，并且在標準教科書如Sambrook和RussllMolecular doninga laboratorymanual(2000，Cold Spring Harbor LaboratoryPress；ISBN0879695773)中極為詳細地進行了說明。
為構建編碼本發(fā)明的融合蛋白的核酸，優(yōu)選采用DNA質(zhì)粒。此類質(zhì)?？捎糜诶缭龃驞NA-插入物的含量、用作為探針、以及作為進一步操作的工具。用于克隆的此類質(zhì)粒的實例有pBR、pUC及pGEM系列，所有這些都可從多家商業(yè)供貨商獲得。
編碼多肽核心和疏水肽的DNA可以例如克隆到不同的質(zhì)粒上，經(jīng)修飾以獲得期望的構象，然后組合到一個重組質(zhì)粒中；所述肽及核心的讀框以此方式排列，從而使可表達單個連續(xù)的融合蛋白。
能夠編碼本發(fā)明的疏水肽和/或核心多肽的核酸序列的修飾可通過例如限制性酶消化、通過定點突變、或通過聚合酶鏈式反應(PCR)技術實施。例如，用于實施PCR的標準技術和方案詳盡地描述在C.Dieffenbach和G.Dveksler；PCR primersa laboratory manual(1995，CSHL Press，ISBN879694473)中。
為了蛋白純化、檢測、或提高表達水平的目的，可添入附加序列。這可導致重組核酸分子或質(zhì)粒中的最終插入物大于編碼疏水肽和核心多肽融合物的序列。當此類附加元件以正確的讀碼插入時，這些元件變成本發(fā)明融合蛋白的完整的一部分。
由重組核酸分子表達核酸序列的必要條件是核酸可操作地連接于轉錄調(diào)控序列，從而使它能夠控制核酸序列的轉錄。轉錄調(diào)控序列是本領域眾所周知的，并且包含啟動子和增強子。對本領域技術人員顯而易見的是啟動子的選擇延及能夠指導基因轉錄的任何真核、原核或病毒啟動子，只要該啟動子在所用的表達系統(tǒng)中具有功能。
細菌、酵母、真菌、昆蟲和脊椎動物細胞表達系統(tǒng)被極為頻繁地利用。此類表達系統(tǒng)是本領域眾所周知的，并且一般可在商業(yè)上例如由Invitrogen(the Netherlands)獲得。
可用于表達本發(fā)明的融合蛋白的宿主細胞可以是細菌來源的細胞，如來自大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、乳酸桿菌(Lactobacillus sp.)或新月柄桿菌(Caulobacter crescentus)，并聯(lián)合應用細菌來源的質(zhì)?；蚴删w，用以表達編碼融合蛋白的序列。宿主細胞也可以是真核來源的，如酵母細胞聯(lián)合酵母特異性載體分子，或者高等真核細胞，象昆蟲細胞(Luckow等Bio-technology 647-55(1988))聯(lián)合載體或重組桿狀病毒；植物細胞聯(lián)合如基于Ti-質(zhì)粒的載體或植物病毒載體(Barton，K.A.等Cell vol.32，p.1033(1983))；或者哺乳動物細胞如Hela細胞、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或Crandell-Rees貓腎細胞，連同合適的載體或重組病毒。
表達的本發(fā)明的融合蛋白的實例是禽流感病毒H5 HA蛋白核心(如可來源于NCBI登錄號CAC28131)，融合于異源疏水序列，并在桿狀病毒表達載體系統(tǒng)中表達，見實施例4。
除了這些表達系統(tǒng)，植物細胞或基于寄生蟲的表達系統(tǒng)是有吸引力的表達系統(tǒng)。寄生蟲表達系統(tǒng)描述在例如法國專利申請
發(fā)明者S·德爾貝克, E·普雷西古, A·F·格倫夫洛特, T·P·M·謝勒斯 申請人:阿克佐諾貝爾公司